Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

O objetivo geral deste procedimento é traçar o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano por PCR quantitativo e analisar os dados usando o software profissional da Geração X. Isso é feito isolando primeiro o RNA total das amostras de líquido cefalorraquidiano. O segundo passo é realizar a transcrição reversa para transcrever os RNAs em CDNAs.

Em seguida, os CDNAs são misturados com uma mistura master verde cibernética carregada em placas de 384 poços contendo primers para 742 sequências exclusivas e amplificadas usando PCR em tempo real. A etapa final é analisar os dados adquiridos da amplificação em tempo real. Em última análise, os resultados podem ser expressos como uma mudança de dobra, aumento ou diminuição em relação a um controle e visualizados em várias representações gráficas.

Portanto, a principal vantagem de nossa técnica sobre os métodos existentes, como matrizes de chips, é que nosso método é altamente sensível e requer uma quantidade mínima de RNAs. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades devido à alta quantidade de dados gerados e ao uso do software para análise de dados. Primeiro, borrife a área de trabalho e as pipetas com RNA Zap.

Para começar, a síntese de CDNA dilui as amostras de RNA modelo a uma concentração de cinco nanogramas por microlitro com água livre de nuclease. Em seguida, coloque suavemente o tampão de reação cinco x no gelo para descongelar. Em seguida, adicione 40 microlitros de água livre de nuclease ao pico de RNA para ressuspender o reagente, vórtice o tubo e deixe-o no gelo por 15 a 20 minutos.

Em seguida, retire as enzimas do freezer, sacuda os tubos e coloque-os no gelo. Além disso, depois que todos os reagentes descongelarem, gire-os rapidamente. Prepare a solução de trabalho da transcriptase reversa em um tubo eph de 1,5 mililitro adicionando a enzima tampão de reação cinco vezes.

Misture água livre de nuclease e pico de RNA no molde usando as proporções indicadas na tabela um. Em seguida, misture a solução de trabalho agitando-a por um a dois segundos na velocidade máxima. Gire brevemente a solução por 10 segundos e, em seguida, dispense a solução de trabalho em tubos de PCR livres de nuclease.

Em seguida, adicione o RNA molde diretamente nos tubos de PCR. Agite suavemente a reação por um a dois segundos para garantir que todos os reagentes estejam bem misturados e gire pelos tubos por 10 segundos. Coloque a amostra na máquina de PCR e insira as configurações mostradas aqui.

Em seguida, inicie o programa após a transcrição retroativa. O CDNA está pronto para amplificação de PCR em tempo real e pode ser armazenado a 20 graus Celsius negativos por até cinco semanas. Para iniciar a amplificação de PCR em tempo real, primeiro coloque o CDNA e o mix mestre de PCR no gelo.

Para descongelar, proteja os frascos da mistura principal de PCR da luz, cobrindo-os com papel alumínio enquanto descongelam. Uma vez descongelado o vórtice, o mestre de PCR se mistura por um a dois segundos. Em seguida, combine 2000 microlitros de dois master mix XPCR e 1.980 microlitros de água em um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione 20 microlitros de CDNA à mistura e subtraia suavemente as soluções por um a dois segundos. Em seguida, gire as soluções em uma centrífuga refrigerada a 1.500 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque a mistura de reação de PCR em um reservatório de pipeta multicanal.

Gire brevemente as placas prontas para uso em uma centrífuga refrigerada a 1.500 vezes G antes de remover a vedação da placa. Em seguida, dispense 10 microlitros da mistura principal de PCR contendo CD NA para cada poço de uma placa de 384 poços. Usando uma pipeta de 16 canais e sele a placa com um filme de vedação óptica.

Depois de adicionar a mistura principal, gire brevemente a placa em uma centrífuga refrigerada a 1.500 vezes G para puxar a solução para o fundo dos poços. Misture as amostras e remova as bolhas de ar para pausar o experimento. Neste ponto, armazene as reações em uma área protegida da luz a quatro graus Celsius por até 24 horas.

Em seguida, execute a amplificação de PCR em tempo real e a análise da curva de fusão seguindo os parâmetros detalhados na tabela dois. Para iniciar a análise, selecione o método de análise de segunda derivada no ciclador de luz Roche. Em seguida, calcule o ciclo de quantificação ou os valores CQ.

Exporte os dados como uma tabela e salve-os como um arquivo de texto. Em seguida, importe os dados para a Geração X clicando primeiro no botão do assistente de importação gon e, em seguida, clicando em iniciar na próxima janela, selecione o instrumento de formato e os arquivos de layout da placa. Os arquivos Excel de layout de placa podem ser baixados do site do GON.

Em seguida, importe o painel um e clique em Avançar. A tabela gerada após a importação do arquivo contém colunas predefinidas, edita nomes de amostra e adiciona ou remove colunas de classificação nesta etapa. Clique em Avançar quando terminar e salve os dados.

Em seguida, carregue-o no editor de dados Primeiro, calibre os dados entre as placas escolhendo a calibração INTERPLATE no menu de pré-processamento para garantir que todas as placas sejam calculadas usando os mesmos parâmetros. Em seguida, defina um valor de corte que descartará dados maiores que o ciclo de limite ou ct. Se um micro RNA tiver uma TC maior para uma réplica em três, essa leitura será substituída pela média da TC das outras duas sondas.

Defina genes de referência selecionando uma lista de microRNAs que tenham valores de CQ semelhantes em todas as amostras e execute a norma do gene. Em seguida, normalize os dados usando os genes de referência obtidos. Os valores resultantes corresponderão ao delta ct.

Remova colunas vazias e quase vazias abrindo a janela de pré-processamento e selecionando validar planilha e, em seguida, selecionando Aplicar na linha remover colunas vazias na linha abaixo. Escolha a porcentagem desejada de dados válidos e clique em aplicar. Selecione 100% se desejar comparar apenas microRNAs comuns a todas as amostras.

Carregue o arquivo MDF final na Geração X e abra o gerenciador de dados para classificar o cluster e visualizar microRNAs e amostras em mapas de calor e dendrogramas. Em seguida, selecione e crie grupos de amostras e clique em aplicar quando terminar. Em seguida, na janela do painel de controle, clique em executar.

Salve o mapa de calor no formato desejado, como TIFF ou bitmap, e copie e modifique o mapa de calor conforme necessário. Esta barra gráfica foi obtida a partir da aplicação da norma G na Geração X para analisar 10 possíveis genes de referência de micro RNA. Esses resultados indicam que MIR 622 e MI 1, 266 são os microRNAs mais expressos de forma estável.

O gráfico de caixa exibido aqui mostra a distribuição de dados para cada um dos 11 microRNAs estatisticamente significativos dentro dos grupos de HIVE e HIV mais sem encefalite. Em cada coluna, o gráfico indica a mediana e o primeiro e terceiro quartis, juntamente com os valores máximo e mínimo. Após este procedimento, o perfil mineral pode ser realizado em quaisquer fluidos corporais, amostras de tecido e células cultivadas.