Name: A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a monitorar infecções por Streptococcus pneumoniae em tempo real em modelo murino de pneumonia aguda usando bactérias bioluminescentes. Este método permite quantificar a intensidade da bioluminescência para avaliar a progressão da infecção e fatores de virulência.

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Pesquisas em laboratório foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) Genomics Infecção Médico (FKZ 0315828A) para SH.

Os experimentos de infecção de animais aqui descritos devem ser executados em estrita conformidade com o (por exemplo, o direito europeu de Saúde da Federação das Associações de Laboratório Ciência Animal (FELASA)) local e internacional diretrizes e normas para o uso de animais vertebrados. Os experimentos têm de ser aprovados pelo conselho de ética local e do Comitê Animal Care Institucional. Todas as experiências com S. pneumoniae no laboratório ou as infecções animais são conduzidos em uma Classe II Biossegurança Gabinete. 1. Preparação de Doenças Infecciosas da Bolsa de Bioluminescent Pneumocococi <ol><li> Prepare culturas estoque de pneumococos em caldo de Todd-Hewitt suplementado com 1% (w / v) de extracto de levedura e uma concentração final de 20% de glicerol para a manutenção a 80 ° C. </li><li> Placa de uma pequena quantidade de cultura de pneumococos ultracongelado sobre uma placa de agar de sangue e incubar as bactérias durante 10 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. Tele placa de ágar de sangue contém os antibióticos adequados, tais como canamicina (150 ng / ml) para a inserção de transposões da cassete do gene luxABCDE no genoma. </li><li> Sub-cultivar uma nova colônia para uma nova placa de ágar sangue para um máximo de 10 horas. </li><li> THY inocular meio suplementado com 10% (v / v) inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de soro fetal bovino (FBS) com pneumococos e iniciar a cultura a uma DO 600 de 0,05-0,07. </li><li> Incubar pneumococos, sem agitação, a 37 ° C e 5% de CO 2 até a cultura atingir uma OD 600 de 0,35-0,40. Crescimento levará entre 3-4 horas. </li><li> Colheita pneumococos por centrifugação a 3750 xg durante 10 min e ressuspender pneumococos bioluminescente em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS) suplementada com 0,5% de FBS. </li><li> Ajustar o inoculo para a concentração desejada em PBS/10% de FBS. A dose infecção depende da cepa de pneumococo utilizado eo fundo genético do microfonee. Para infectar outbred ratinhos CD-1 por via intranasal com S. pneumoniae D39 lux a dose de infecção deve ser ajustada a 1 x 10 7 UFC de uma suspensão de 20 ul suplementados com 90 unidades de hialuronidase. Não agite ou vórtice pneumococo, uma vez que este irá desencadear autólise. </li><li> Verificar a concentração de inoculo por plaqueamento de 10 diluições em série de dobragem em agar de sangue e contagem das colónias após crescimento durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Verifique a bioluminescência do inoculo pneumocócica medindo a bioluminescência utilizando um sistema de imagem óptica. </li></ol> 2. Intranasal e Infecção intraperitoneal de camundongos com Bioluminescent pneumococos <ol><li> Utilizar ratos fêmea consanguíneos na idade de 7-10 semanas para o modelo de pneumonia aguda e sépsis. O peso destes ratinhos deve estar entre 20-30 g. </li><li> Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de ketamina e xilazina. Prepara-se uma mistura de 1,0 mgde cetamina e xilazina 0,1 mg em 100 ul estéril a 0,9% (w / v) de cloreto de sódio para os ratinhos com um peso corporal de 20 g. Isto é consistente com uma dose de 50 mg / kg de peso corporal para a cetamina e 5 mg / kg de peso corporal para a xilazina. Para ser exato, pesar camundongos antes da injeção do anestésico. </li><li> Injectar a mistura na cavidade intraperitoneal e colocar os animais de volta para dentro da gaiola, até os anestésicos agem e os animais são narcotizada. A respiração dos ratos se tornará muito lento e regular. Os ratos têm de ser totalmente narcotizado, de modo que a inoculação intranasal e inalação da suspensão bacteriana não vai resultar em espirros e, portanto, a perda de inoculo. Isso pode ser avaliado por beliscar o mouse no final de sua cauda; um mouse totalmente narcotizada faltará capacidade de resposta. </li><li> Gentilmente pegar um rato narcotizada e segure o mouse entre os dedos eo polegar, com o nariz em pé (Figura 1). </li><li> Use uma pipeta com longas pontas estreitas (Gel CarregadorDicas) e soltar pneumococos bioluminescente em várias gotas pequenas para as narinas (10 mL / narina) do mouse 26-29. O rato vai involuntariamente inalar as bactérias. Segure o mouse 1-2 min na posição vertical e observar se o mouse espirra ou mantém o inóculo. </li><li> Infect 7-10 semanas de idade ratinhos CD-1 por via intranasal com uma dose de infecção de 1 x 10 7 ou 7,5 x 10 7 pneumococos da estirpe D39 e TIGR4, respectivamente, para monitorar a infecção em tempo real. O limite de detecção para o sistema sem qualquer absorção pelo tecido do hospedeiro é de cerca de 1 x 10 6 bactérias bioluminescentes. </li><li> Infectar camundongos por via intraperitoneal (IP) para avaliar e BioImage virulência do pneumococo em um modelo de infecção sepsis mouse. Use 5 x 10 3 UFC em 100 ul de D39 tensão e 1 x 10 4 de tensão TIGR4. Ratos não são anestesiados quando se utiliza a via IP. </li><li> Inocular camundongos controle com PBS. <img alt="Figura 1" fo:content-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 1. Infecção intranasal de murganhos CD-1 com S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . </li></ol> 3. Visualizando pneumocócica Divulgação no Pulmão e Sangue Utilizando o Sistema de Imagem Imagem de divulgação de pneumococos após a infecção intranasal de camundongos fêmeas outbred CD1 em tempo real usando um sistema de imagem in vivo. <ol><li> Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de análise de imagem localizado no computador pré-configuração. </li><li> O sistema de imagem inicia automaticamente e a câmara CCD é termoelectricamente arrefecido a 90 ° C antes de ser activo. </li><li> As configurações e binning depender do número de ratinhos medidoe, simultaneamente, com a força do sinal bioluminescente. O campo de visão (FOV) para monitorar a bioluminescência dos animais é variável ea ampliação varia entre um FOV de 22,5 cm a medir cinco ratos, e um FOV de 3,9 cm para medir um único rato ou partes do animal como o peito ou na cabeça. </li><li> Use rotineiramente um tempo de exposição de 1 min, um grau médio de binning, e um FOV de 22,5 cm (conjunto D). Em primeiro lugar, selecione o modo de imagem luminescente e, em seguida, definir os parâmetros de imagem. </li><li> A emissão do sinal pode depender da estirpe bacteriana e estirpe de ratinhos utilizada, e o pigmento do rato. Raspar o peito dos ratos quando se utiliza por exemplo, ratinhos C57BL / 6, o que pode ser vantajoso na obtenção de imagens do desenvolvimento da pneumonia nestes ratinhos. </li><li> Imagem ratinhos infectados, a intervalos de tempo previamente escolhida. Medir a bioluminescência de ratos no modelo de pneumonia aguda em intervalos de tempo de 8-12 horas no máximo. Monitorar também o bem-estar de camundongos infectados por observing sua aparência, comportamento e determinação da perda de peso. </li><li> Anestesiar os ratos na câmara narcótico do sistema de anestesia do equipamento de imagem antes das medições na câmara. Comece a inalação de uma mistura de isoflurano e oxigênio e esperar até que os camundongos respirar lenta e regularmente. </li><li> Coloque animais anestesiados para a câmara de formação de imagens do sistema e manter os ratos na posição supina. A câmara CCD sobre a parte superior da câmara será então a imagem do tracto respiratório murino. </li><li> Colocar os animais com o seu nariz em tubos para permitir a inalação do anestésico. </li><li> Isoflurano entrada para a câmara de imagiologia por meio de uma tubagem de gás é permitido para manter a anestesia. </li><li> Para ativar a câmera CCD no topo da câmara e começar a imagem óptica bioluminescente, pressione &quot;Acquire&quot; no software de imagem. Imediatamente uma fotografia dos ratinhos na câmara fechada, aparece no ecrã. Após um minuto de<html> medição uma sobreposição dos dados bioluminescência ea foto é mostrada. </li><li> Pare de anestesia após a sobreposição de imagem aparece na janela do software e colocar os ratos de volta em suas gaiolas. </li><li> Ratos são monitorados para a recuperação. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Anestesia e monitoramento de camundongos infectados com pneumococos bioluminescente utilizando a anestesia eo sistema IVIS IVIS Spectrum, respectivamente. A) O sistema IVIS Spectrum imagem. B) O sistema de anestesia IVIS com a câmara de incubação. C) Ratos anestesiados na câmara de incubação . D) Ratos localizado no interior da câmara IVIS Espectro de imagem com o nariz a inalação do anestésico._blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. </li></ol> 4. Quantificação e Avaliação da bioluminescência de camundongos infectados com S. Bioluminescent pneumoniae <ol><li> Determinar as intensidades de bioluminescência dos ratos ou de uma região seleccionada dos ratinhos por quantificar a emissão de fotões totais (fotões / sec) usando o software de análise de imagem. </li><li> Use os valores da emissão de fótons que são fornecidos em uma folha de dados do Excel para preparar um gráfico. Uma vez que a variação de dados é frequentemente elevado nos ratinhos agrupados, gerar um gráfico de caixa suiça para mostrar as diferenças de ratinhos infectados com diferentes estirpes de pneumococos. </li><li> Proporcionar os fotões por ratinhos ou alternativamente os resultados como a média de brilho (fotões / sec / cm 2 / SR) de uma área seleccionada. </li><li> Os dados de medição de ROI (região de interesse) no modo de fóton pode ser quantitativamente comparados entre diferentes em sistemas de imagem in vivo com diferente veioconfigurações ra, uma vez que as medidas em unidades de irradiação têm automaticamente em conta as definições da câmara (por exemplo, o tempo de integração, binning, f / stop, e campo de visão). </li></ol>

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<li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+disease+in+western+Europe%3A+burden+of+disease%2C+antibiotic+resistance+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li>
<li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Brehm,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<html> Todos os experimentos realizados em animais têm de ser aprovados pelas autoridades locais e comissões de ética. Em experiências in vivo de infecção a carga bacteriana nos vários nichos hospedeiras de animais infectados tem de ser determinada a diferentes pontos de tempo após a infecção. Sob estas condições experimentais, os animais têm de ser sacrificados antes do isolamento de bactérias a partir do sangue, a nasofaringe, lavado bronchoalvelar, ou órgãos tais como os pulmões, baço e cérebro. Para calcular...

Infecções respiratórias causadas por vírus ou bactérias continuam a ser um dos problemas adquiridas na comunidade ou clínicas mais comuns em todo o mundo, causando cerca de um terço de todas as mortes no mundo inteiro. As espécies de bactérias principais são o Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. No entanto, estas espécies de bactérias são normalmente constituintes comuns da flora natural do tracto respiratório. Assim, a carga bacteriana também é de certo risco para doença invasiva e, dependendo do estado imunitário ou predisposições dos indivíduos. A colonização assintomática é acionado para infecções invasivas. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Em indivíduos saudáveis ​​S. pneumoniae (pneumococo) são muitas vezes assintomáticas colonizadores e inofensivos do trato respiratório superior, onde são confrontados com bactérias não patogênicasda flora residente, mas também com agentes patogênicos, como Haemophilus spp. ou de Staphylococcus aureus e a primeira linha de defesa do sistema imunitário humano. A freqüência de colonização são os mais altos em crianças pequenas (37%) e ainda mais dentro de creches lotadas (58%) 3-5. A população mais jovem e os idosos, que recebe o pneumococo através da transmissão aerossol de operadoras e secreções nasofaríngeas 6, pertencem aos grupos de alto risco e vacinação utilizando uma das vacinas conjugadas pneumocócicas (PCV10 ou PCV13 em crianças e polissacarídica 23-valente PPSV23 em adultos) É recomendado nos Estados Unidos (EUA) e muitos países europeus 4. O PPSV23 cobre sorotipos responsáveis ​​por ~ 90% das doenças pneumocócicas bacteremia em os EUA e na Europa, evitando, assim, doenças pneumocócicas invasivas de forma eficiente (IPD) em adultos, enquanto as PCVs cobrir os sorotipos mais prevalentes em crianças. Consequentemente, IPD devido a tipos de vacinas (VT) são redusorotipos não incluídos na vacina ced mas exibindo um elevado potencial de virulência e resistência a antibióticos surgiram 4,7-12. A nasofaringe como o reservatório é o ponto de partida para pneumococos a se espalhar para os seios ou orelhas médias iniciando infecções locais prejudiciais. Mais importante ainda, pneumococos espalhar diretamente através das vias aéreas ao brônquios e pulmão, resultando em CAP risco de vida 4,13. Infecções pulmonares são frequentemente acompanhadas com e destruição do tecido de barreira, permitindo que o agente patogénico a propagar-se no sangue e causar IPD. As incidências de PAC e IPD são mais elevados em pessoas imunocomprometidas ou nos extremos da idade 4,13. As circunstâncias responsáveis ​​pela conversão de um comensal a um patógeno com alta virulência ainda estão em debate. No entanto, têm sido sugeridas, além mudanças na suscetibilidade do hospedeiro e adaptação evolutiva acompanhado com maior virulência eo aumento da resistência a antibióticos para ter um impacto crucial sobre PNEinfecções umococcal 14-16. O patógeno é dotado de uma multiplicidade de adesinas mediando o contato íntimo com as células epiteliais da mucosa. Depois de superar o muco das vias aéreas, a adesão às células hospedeiras pneumocócica é facilitada através de interações diretas de adesinas de superfície exposta com receptores celulares e através da exploração de componentes da matriz extracelular ou proteínas séricas como ponte moléculas 4,17,18. Patógenos tão versátil pneumococos também estão equipados com fatores envolvidos na evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro imune. Além disso, eles têm a capacidade de se adaptar a ambientes diversos hospedeiros, tais como o pulmão, sangue e fluido cerebrospinal (CSF), respectivamente 5,17,19,20. O impacto dos fatores bacterianos sobre patogênese e inflamatória do hospedeiro respostas é investigada em modelos animais experimentais de pneumonia, bacteremia ou meningite 21-25. Apesar de ser um patógeno humano, estes modelos são nósll-estabelecidos para decifrar tropismo pneumocócica tecidos, mecanismos de virulência, ou protectivity de vacinas pneumocócicas. O fundo genético de linhagens puras determina a susceptibilidade a pneumococos. Ratinhos BALB / c por via intranasal infectados com pneumococos foram consideradas resistentes, enquanto que a CBA / Ca e SJL ratinhos eram mais susceptíveis às infecções pneumocócicas 22. Isto implica que, semelhante aos seres humanos, o fundo genético e os mecanismos de defesa do hospedeiro determinar o resultado da infecção. Por isso, são necessárias para desvendar locos de resistência no genoma de ratinhos menos susceptíveis a infecções por pneumococos esforços suplementares. Os resultados levaram a mudanças na in vivo protocolos de virulência. Em vez dos ratinhos BALB / c consanguíneos muitas vezes utilizados no passado, as estirpes de ratinho outbred CD-1/MF1 altamente sensíveis são hoje em dia, muitas vezes utilizado para estudar o efeito de virulência ou aptidão pneumocócica perda de função factores 26-28. Além disso, a disponibilidadede pneumococos bioluminescente e técnicas de imagem óptica permite que o tempo real de bioluminescência bioimaging de infecções. Em pneumococos a cassete do gene luxABCDE optimizado (plasmídeo Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) foi inserido num local de integração único de cromossoma por mutagénese por transposões. Pneumococos bioluminescente têm sido empregados para avaliar a atenuação de mutantes pneumocócicas deficientes em virulência ou aptidão fatores e sua translocação de um sítio anatômico para outro 26,28-31. Aqui nós fornecemos um protocolo para a bioimaging das infecções pneumocócicas em uma pneumonia ou modelo murino sepse. A amplificação e disseminação de pneumococos bioluminescente em ratinhos por via intranasal ou por via intraperitoneal infectadas podem ser facilmente monitorizados ao longo do tempo utilizando um sistema de imagiologia óptica e do mesmo animal em diferentes pontos de tempo.

<table><tbody><tr><td>Caldo Todd Hewitt</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>X936.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>2363.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue</td><td>Oxoid, Wesel, Alemanha</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>T832.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>E6376</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>PAA Laboratories, Coelbe, Alemanha</td><td>A11-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Camundongos CD-1, fêmeas</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemanha</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>camundongos fêmeas CD-1, seis a oito semanas de idade</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, solução injetável Curamed</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rompun 2%, solução injetável</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringas BD Plastipak de 1 ml</td><td>Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha</td><td>300015</td><td>seringas estéreis Luer-Lok com agulha</td></tr><tr><td>Pontas de Carregador de Gel</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro; Pontas ltiFlex</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884-100mg</td><td>Hyaluronidase Tipo IV-S de teste bovino</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Air Liquide, D&uuml; sseldorf, Alemanha</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, Mannheim, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos&nbsp;</td><td>Eurofins MWG, Ebersberg, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Midiprep Spin Qiaprep&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>27104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificação PCR DNA</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>28106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Software Living Image 4.1</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paquímetro de Sistema de Anestesia a Gás XGI-8</td><td>Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de espectro IVIS&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biofotômetro</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse pneumonia aguda modelo usando bactérias bioluminescentes

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

A pneumonia é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento e países industrializados e está associada com morbidade e mortalidade considerável. Apesar dos avanços no conhecimento desta doença, a disponibilidade de unidades de terapia intensiva (UTI), eo uso de antimicrobianos potentes e vacinas efetivas, as taxas de mortalidade continuam altas 1. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Este patógeno é equipado com um arsenal de adesinas de superfície exposta e fatores de virulência que contribuem para pneumonia e doença pneumocócica invasiva (DPI). A avaliação do papel in vivo de aptidão ou de virulência fatores bacterianos é de extrema importância para desvendar S. mecanismos de patogenicidade pneumoniae. Modelos murinos de pneumonia, bacteremia e meningite estão sendo usados ​​para determinar o impacto de fatores pneumocócicas em difrente fases da infecção. Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar em tempo real a divulgação pneumocócica em ratos após intranasal ou infecções intraperitoneais com bactérias bioluminescentes. Os resultados mostram a multiplicação e difusão de pneumococos no tracto respiratório inferior e do sangue, que pode ser visualizado e avaliada utilizando um sistema de imagem e o software de análise que a acompanha.

A aquisição e absorção de metionina é de importância central para pneumococos para manter a forma em seu nicho de acolhimento 32,33. A metionina ABC transportador lipoproteína é codificado em D39 pelo SPD _ 0151 gene (TIGR4: sp_0149) e nomeado METQ 32. Os pneumococos produzir mais enzimas de biossíntese de metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). A falta de metionina num meio quimicamente definido afecta o crescimento de pneumococos e se...

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar em tempo real uma infecção por streptococcus pneumonia no modelo de pneumonia ou sepse aurin. Isso é realizado preparando uma dose infecciosa de streptococcus pneumonia após o cultivo em meio complexo THY. O segundo passo é a infecção intranasal ou intraperitoneal de camundongos com streptococcus pneumonia.O passo final é a quantificação da bioluminescência, das intensidades dos camundongos ou de uma região selecionada dos camundongos, a fim de fornecer as emissões totais de fótons. Em última análise, as intensidades de bioluminescência de um grupo de camundongos mostram as alterações na infecção ao longo do tempo. Além disso, é realizada a análise de imagens individuais de camundongos bioluminescentes.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a determinação da carga bacteriana no pulmão ou em diferentes tecidos, é que é possível acompanhar a infecção em um único animal. As implicações desta técnica estendem-se à pesquisa básica, pois ela também pode ser aplicada para avaliar a produtividade de fatores bacterianos e agentes anti-infecciosos. Este método pode fornecer informações sobre este grupo de promo Cox em camundongos.Ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a determinação da carga bacteriana nos órgãos. Em geral, os pesquisadores acharão fácil aprender este método, pois o uso do sistema de bioimagem é simples e existe software disponível para preparar as imagens. Tive imediatamente a ideia de aplicar este método em experimentos de infecção com bios e óxido primário quando fui apresentado ao sistema de bioimagem.A demonstração deste método é crucial devido ao manuseio especial necessário para os animais e porque etapas críticas, como a inoculação, são difíceis de explicar. Comece preparando um estoque de pneumococos bioluminescentes infecciosos conforme explicado no protocolo textual. Em seguida, inocule um tubo contendo 40 mililitros de meio THY suplementado com SBF com os pneumococos e inicie um cultivo com OD 600 de 0,08. Incube os pneumococos sem agitação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três a quatro horas, até que o cultivo atinja um OD 600 de 0,35 a 0,40.Em seguida, recolha os pneumococos por centrifugação a 3.750 × g durante seis minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet bacteriano em aproximadamente um mililitro de PBS com pH 7,4, suplementado com 0,5% de FBS. Ajuste o inóculo para a concentração desejada em uma suspensão de 20 microlitros de PBS com 10% de FBS e 90 unidades de hialuronidase.Não agite nem vorte os pneumococos, pois isso induzirá autólise. Em seguida, utilize um sistema de imagem óptica para verificar a bioluminescência do pneumococo oulu. Anestesie um camundongo fêmea outbred com sete a dez semanas de idade por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina. Teste a profundidade adequada da anestesia pinçando a cauda.Uma vez completamente anestesiado, segure o camundongo entre os dedos e o polegar com o focinho voltado para cima. Em seguida, usando uma pipeta com ponteira longa e estreita, coloque 10 microlitros dos pneumococos bioluminescentes em cada narina. O camundongo inala involuntariamente as bactérias.Segure o camundongo na posição vertical por um a dois minutos para observar se ele espirra ou mantém o inóculo. Concluído. A inalação da dose infecciosa deve ser garantida, de modo que o camundongo inspire a dose infecciosa selecionada. Portanto, o camundongo deve respirar lentamente e regularmente.Evite que o camundongo espirre e partes da dose de infecção se percam. Após a inoculação bem-sucedida, marque a cauda para identificação posterior e coloque o camundongo em uma nova gaiola.Em seguida, para avaliar a virulência em um modelo de infecção por sepse, injete 100 microlitros de uma cepa pneumocócica por via intraperitoneal em camundongo anestesiado. Após marcar a cauda, devolva o camundongo a uma gaiola com imagem como controle. Injete outro grupo de camundongos com PBS para imagem.A disseminação dos pneumococos é realizada por meio de software de análise de imagem. Primeiro, configure o modo de imagem para luminiscência e, em seguida, defina os parâmetros de imagem da seguinte maneira. Ajuste o tempo de exposição para um minuto.Um grau médio de agrupamento e um campo de visão de 22,5 centímetros. Anestesiar os camundongos na câmara de anestesia do equipamento de imagem com uma mistura de iso, fluor e oxigênio. Quando os camundongos estiverem respirando lentamente, colocá-los na câmara de imagem na posição supina, com os focinhos inseridos em tubos conectados ao sistema de anestesia.Para ativar a câmera CCD localizada na parte superior da câmara e iniciar a imagem óptica bioluminescente, pressione adquirir no software de imagem imediatamente. Uma fotografia dos camundongos dentro da câmara fechada aparece na tela. Após um minuto de medição, é exibida uma sobreposição dos dados de bioluminescência e da fotografia.Agora interrompa a anestesia aproximadamente 20 segundos antes do fim da exposição. Devolva os camundongos à sua gaiola e deixe-os recuperar completamente da anestesia antes de devolver a gaiola ao suporte. Continue a obter imagens dos camundongos infectados a cada oito a dez horas, além de monitorar sua aparência, comportamento e peso.Por fim, utilize o software de análise de imagem para determinar as intensidades de bioluminescência por ponto temporal e grupo de camundongos, quantificando a emissão total de fótons. A imagem óptica bioluminescente de camundongos infectados intranasalmente com D 39 lux ou com o mutante isogênico D 39 luxe delta MET Q é mostrada aqui. A aquisição de imagens começou 24 horas após a infecção e continuou a cada oito horas até a morte ou até 120 horas após a infecção em cada grupo. Sete dos 10 camundongos desenvolveram sinais graves de doença e morreram, enquanto os outros três camundongos não apresentaram bioluminescência e sobreviveram.Observe que a cena de bioluminescência em dois dos camundongos é na verdade um derramamento da intensa bioluminescência nos camundongos vizinhos. Os camundongos infectados com sucesso com o tipo selvagem bioluminescente D 39 lux desenvolveram uma infecção pulmonar grave, 32 horas após a infecção, que progrediu em oito a 16 horas para sepse. Todos os camundongos que desenvolveram pneumonia e sepse após infecção com D 39 lux haviam sucumbido até 96 horas após a infecção.A perda da função da lipoproteína ligadora de metionina prejudicou significativamente a virulência dos pneumococos. Após 32 horas, apenas um camundongo infectado com o mutante mEq apresentou infecção pulmonar leve, em comparação com as infecções observadas em todos os camundongos D 39 lux suscetíveis. No entanto, após 48 horas, infecções pulmonares graves tornaram-se evidentes nos camundongos infectados com o mutante.Como resultado, esses camundongos desenvolveram sepse 72 horas após a infecção e tornaram-se mais abundantes posteriormente a 72 horas após a infecção, demonstrando que, no modelo de infecção aguda de pneumonia, a deficiência de met Q atenua os pneumococos. Os valores das intensidades de bioluminescência dos camundongos agrupados são mostrados nos pontos de tempo indicados. A quantificação do fluxo bioluminescente mostrou diferenças significativas entre camundongos infectados com o tipo selvagem e camundongos infectados com met Q, 32 e 40 horas após a infecção.Assim, a perda da função de met q atenua os pneumococos e resulta em um atraso significativo na infecção invasiva, mas não resulta em bactérias avirulentas uma vez dominada. Esta técnica pode ser utilizada para monitorar 10 grupos de quatro camundongos em uma hora, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a inalação seja completa e realizada pelos camundongos. Após este procedimento, outros métodos, como co-infecção em camundongos, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como leve atenuação e mutantes bacterianos, após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia da infecção explorarem e visualizarem pneumonia ou sepse pneumocócica em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como infectar camundongos e acompanhar em tempo real a infecção pneumocócica utilizando um sistema de bioimagem. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas humanas como o *Streptococcus pneumoniae* pode ser perigoso e precauções, como trabalhar sob uma bancada de segurança classe dois, devem ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A infecção concomitante com o vírus influenza A é um dos fatores implicados na indução de doença pneumocócica invasiva durante...

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o uso da bioluminescência para visualizar e comparar o comportamento in vivo de cepas bacterianas virulentas e atenuadas em camundongos. Ele descreve a preparação de suspensões bacterianas bioluminescentes e sua injeção intraperitoneal em camundongos. A cepa virulenta exibe...

Rastreando a dinâmica da infecção bacteriana em um camundongo usando bioluminescência

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

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Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Um método para estabelecer infecções pulmonares em roedores imunocompetentes é descrito. Com proficiência, este método pode ser realizado de forma rápida e fácil para induzir infecção estável com muitos isolados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Aqui, descrevemos um protocolo simples e reproduzível do modelo de infecção do rato para avaliar a atenuação das cepas geneticamente modificadas de Pseudomonas aeruginosa em comparação com os Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) aprovado Escherichia coli para aplicações comerciais.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Aprenda a monitorar infecções por Streptococcus pneumoniae em tempo real em modelo murino de pneumonia aguda usando bactérias bioluminescentes. Este método permite quantificar a intensidade da bioluminescência para avaliar a progressão da infecção e fatores de virulência.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes (Vídeo) | JoVE Journal

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

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