Name: Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a visualizar a dinâmica dos grânulos de estresse G3BP em células primárias vivas usando microscopia confocal de lapso de tempo. Este método permite monitorar a formação e resposta celular ao estresse em neurônios e fibroblastos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a plataforma Montpellier Rio (RM) onde foram realizadas as aquisições. Eles agradecem Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget por sua ajuda em diferentes partes do protocolo. Este trabalho foi apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Todos os procedimentos com animais neste protocolo estão em estrita observância com as diretrizes da Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia, de 24 de Novembro de 1986 (86-609/EEC). Casa dos ratos no grupo, permitindo que alimentos e água ad libitum. Mantê-los em um ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de umidade), com uma hr 12: 12 luz hr: ciclo escuro (luz às 7:00 am). 1 Cultura de Células Murino preliminares:. Rato embrionárias fibroblastos (MEFs) <ol><li> Autoclave fórceps finos, bem como uma pinça curvos e as tesouras de dissecção. Guarde em um recipiente estéril. Use estéril D-PBS (Phosphate-Buffered Saline Dulbecco). Prepare meio MEFs completa: meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 1% de aminoácidos não-essenciais, e 0,5 mM de 2-mercaptoetanol e quente a 37 ° C. </li><li> Euthanize um rato grávidas (em 13,5 dias pós-coitum (DPC)) Por deslocamento cervical. Retire os cornos uterinos do rato higienizado com 90% EtOH. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em 37 ° C pré-aquecido D-PBS. Abra a chifres, lugar os embriões em um 100 milímetros estéril de plástico placa de Petri, limpá-los a partir do material do cordão umbilical e lavá-los com água morna D-PBS para remover o excesso de sangue. Sob um binocular, remover membros do embrião, os órgãos internos e a parte superior da cabeça contendo o cérebro. </li><li> Em uma nova placa de Petri, mediu o embriões em pedaços muito pequenos com um cirúrgico estéril lâmina ou tesoura (pelo menos durante 1 minuto). No caso de embriões de diferentes genótipos, ter o cuidado de colocar cada embrião em pratos individuais de Petri e manter a cauda ou a cabeça superior para genotipagem. </li><li> Cobrir o embrião com 1x tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 hora num banho a 37 ° C incubadora. Adicionar 10 ml de completaMédio MEFs para parar reação tripsina. Pipeta cima e para baixo para remover todos os agregados. Deixar repousar a suspensão de células para um tubo de 50 ml (preenchido com meio completo) durante 10 minutos, e centrifugar o sobrenadante, durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em meio completo (6 ml para um embrião). Células nucleadas viáveis ​​podem ser contadas usando tripan azul (Cerca de 5 x 10 6 células pode ser esperado a partir de um embrião). Placa 3 ml por 60 milímetros placa de Petri. </li><li> Troca da mídia no dia seguinte e permitir que as células cresçam até que os pratos são confluentes. Muitos tipos de células pode ser visto, mas apenas os fibroblastos vão sobreviver subcultura. </li><li> Dividir as células e permitir-lhes crescer em pratos de 35 mm com fundo de vidro (importante para o tempo de experimentação lapso), até 50-70% de confluência para a transfecção. Teste para Mycoplasma e patógenos do mouse. </li></ol> 2. Cultura Adaptations em Caso de Neurônios <ol><li> O dia antes da cultura, revestimento 35 milímetros placas de Petri de fundo com poli-L-lisina (200 ul de 0,1 mg / ml) sob um capuz estéril e limpo, e deixar durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, enxaguar com água pura esterilizada, duas vezes durante 5 min e depois durante 45 minutos a 1 hora. Substituir com 2 ml de meio DMEM mais 10% de FBS e manter numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Dissecar embriões em 18,5 dpc. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em HBSS frio estéril (Solução Salina Balanceada de Hank) em 100 milímetros placa de Petri. Filhotes neonatais também pode ser usado em vez de embriões, a fim de preservar a vida da barragem e que possa produzir mais descendentes, especialmente no caso de animais transgénicos, que pode ser difícil de obter. Em pratos individuais de Petri, tome cada embrião ou recém-nascido e cortou a cabeça com uma tesoura. Segure a cabeça através da inserção de uma pinça curva para os olhos, cortar a pele e cuidadosamente abrir o crânio mole da parte de trásda cabeça, até os olhos, em cada um dos lados da cabeça. Cortar os nervos ópticos e do tronco cerebral, remova o cérebro, e colocá-lo em uma nova placa de Petri contendo HBSS. Sob um estereoscópio, remova todas as meninges utilizando duas pinças finas. Separa-se o hipocampo, no córtex ou qualquer outra parte do cérebro que, dependendo da estrutura de estudar. </li><li> Imergir a estrutura do cérebro dissecado em 4,5 ml de HBSS frio preparado anteriormente em tubos de 15 ml e guardar em gelo até a digestão com tripsina. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina e incubação a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Lavar o 3x de tripsina com HBSS, sendo extremamente cuidadoso para não descartar as partes do cérebro digeridos. </li><li> Ressuspender em 500 mL (hipocampo) a 1 ml (córtex) DMEM acrescido de 10% FBS e pipeta cima e para baixo várias vezes com uma micropipeta de 1 ml equipado com uma ponta de 1 ml, em seguida, equipado com 1 ml mais 200 dicas ml, até que haja nenhum agregado visível. </li><li> Distribuir 100-200 mL de suspensão de células a cada botto vidro 35 milímetrosm prato contendo DMEM acrescido de 10% FBS e deixar os neurônios aderem a 37 ° C durante pelo menos 3 horas. Substituir por neurónio pré-aquecido meio completo (meio Neurobasal suplementado com 250 uM de L-glutamina e NS21, preparado como descrito em Chen et al. 19) e deixar a 37 ° C para permitir o crescimento neuronal. Transfecção os neurônios em 5 a 14 dias in vitro (div) (a eficiência de transfecção é maior depois de algumas conexões sinápticas div mas é melhor estabelecida 7-10 div). </li></ol> 3. Transfecção de EGFP-G3BP1 Construct Transfectar as células com um vector contendo o cDNA da sua proteína de interesse (de qualquer componente de SG) fundido com um marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 ug de plasmídeo purificado por 35 milímetros prato. <ol><li> Transfectar as MEFs usando um método comercial, seguindo o protocolo do fabricante (ver o quadro de Materiais / Reagentes). </li><li> Transfecção de neurônios com um cálciométodo do fosfato adaptado de Xia et al 20 Resumidamente.: <ol><li> Preparar as soluções: DMEM-wash: DMEM contendo KCl 25 mM; solução de transfecção: DMEM-lavagem contendo 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, vermelho de fenol); e solução de choque: HeBS 1x, DMKY 1x, e DMSO a 2% (v / v); e mantê-los a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia dos neurônios, filtrado, e mantê-lo a 37 ° C. Lavar com DMEM-lavagem, em seguida, substitua-o por meio de transfecção e manter a 37 ° C durante a preparação dos precipitados de fosfato de ADN-plasmídeo de cálcio. </li><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar (por esta ordem) Braun água (volume final de 50 ul), 5 ul de CaCl2 2,5 M, e 3 ug de DNA de plasmídeo. Largue essa mistura em 50 mL de HeBS 2x já introduzidas em um tubo de polipropileno de fundo redondo. Misture o tubo por rotação, juntamente com a queda. Deixe o formulário precipitado à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionar o precipitate gota a gota, para os neurónios e deixar a 37 ° C durante 30 a 50 min. </li><li> Substitua com solução de choque para 1 min, em seguida, enxaguar com DMEM-lavagem e finalmente reintroduzir o meio pré-condicionado. Manter as células a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualização de G3BP Contendo Assembléia e Dynamics SG <ol><li> Substituir o meio das células que contém vermelho de fenol por fenol médio vermelho-free. </li><li> Use um microscópio confocal equipado com fluorescência para as aquisições. Ligue os sistemas de microscópio: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Aquecer a câmara a 37 ° C, pelo menos 20 minutos antes do início das aquisições. </li><li> A expressão mais de G3BP induz a formação espontânea de um tipo de SG. As células podem, portanto, ser observado para o conjunto da SGS 24 hr direita após a transfecção sem indução de estresse. Alternativamente, o stress pode ser induzido para induzir ainda mais a montagem da SGS. Adicionar arsenito de sódio 0,5 mM e estrelat a aquisição logo após a adição do composto (grânulos será assim formado dentro de 1 hora). </li><li> Adicione o óleo para a objetiva de imersão (use 40X ou 63X objetivos) e instalar a placa de Petri sobre o objetivo do titular microscópio adaptado 35 milímetros, estabilizado no suporte do palco. Verifique se o prato é plana caso contrário, as aquisições serão alterados. Ligue a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo relevante e visualizar células transfectadas. Desactivar a fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade. </li><li> No &quot;adquirir guia&quot;, selecione os lasers, dependendo do comprimento de onda de excitação do fluoróforo tag (488 nm em nosso protocolo que utiliza G3BP EGFP-marcadas) e selecione o período de emissão adaptado para a PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar a potência de laser (geralmente não mais do que 10%), para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e ajustar o ganho eo deslocamento para modificar a relação sinal-ruído.Digitalização rápida (1.000 Hz), a fim de minimizar o tempo de exposição do laser (linha média 2, quadro médio 1). Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para ser capaz de reconstruir a imagem em 3D (um passo Z de 1 mícron é geralmente bem com as células). Determine o tempo de intervalo entre cada uma das aquisições: intervalos menores permitem obter um filme mais coerente, mas isto pode provocar a fotodegradação e toxicidade (um intervalo de 20 segundos foi usado nas experiências descritas). Duração de aquisição total pode variar, dependendo do tipo de stress. Muitos SG contendo G3BP são formadas muito rapidamente sob tratamento arsenito e são bem visíveis após 1 hora do tratamento: nesse caso, escolher rapidamente as células para filmar e iniciar as aquisições logo após o stress, com uma duração total de aquisições de 15 - 20 min largamente suficientes para observar a montagem de vários GV. </li><li> Salve as imagens e reconstruir as pilhas e filme usando o software ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos no protocolo preocupação a transfecção e mais particularmente as aquisições lapso de tempo, que devem ser cuidadosamente monitoradas a fim de baixar a citotoxicidade. Cultura de células primárias não é uma parte difícil, desde que sejam mantidas condições estéreis e cuidado é tomado para evitar danos durante as etapas de dissecação e de dissociação celular. MEFs pode ser mantido congelado no início passagens. Neuron transfecção com fosfato de cálcio tem sido demonstra...

Grânulos de estresse (SGs) são focos citoplasmática não-membranoso formado como uma resposta protetora celular ao estresse ambiental, tais como temperatura elevada, estresse oxidativo, hipóxia, choque osmótico, a irradiação UV, a privação de glicose, ou infecção viral 1. Eles podem ser quimicamente induzida por tratamento com compostos como o arsenito de sódio, o que desencadeia o stress oxidativo. SG acumular tradução preso parado mensageiro ribonucleoprotein (mRNPs) complexos 2, sequestrando mRNAs da maquinaria de tradução, e sua montagem pode ser desencadeada pela fosforilação de eIF2α (fator de iniciação eucariótico 2 α). SG são estruturas dinâmicas que trocar componentes com os polissomos e outros grãos, como os corpos P. Eles constituem um &quot;centro de triagem&quot;, onde mRNAs são classificadas e processadas para qualquer tradução, reinício, degradação, ou embalagem em estáveis ​​mRNPs não polissomal 3. A montagem da SGS é rápido but é um processo gradual, com vários pequenos agregados iniciais que se aglutinam em grânulos maiores. O uso de inibidores químicos que perturbam ou estabilizar os microtúbulos mostra que é necessária a rede de microtúbulos para a dinâmica de SG, incluindo os processos de montagem, desmontagem e coalescência. O conjunto dinâmico de SG é também promovida pela agregação de proteínas de ligação a ARN específicas (RNA-BP) como TIA-1 (células T interna antigénio-1) e TIAR (proteína relacionada com o TIA-1), que são capazes de formar dímeros e promover polysome desmontagem e encaminhamento de mRNAs em SG 4. G3BP (proteína de ligação de domínio SH3 RasGAP) é um tal ARN-PA que se localiza SGs, quando as células são forçadas a arsenito ou a alta temperatura, e a sobre-expressão de G3BP desfosforilado pode induzir GV de montagem 5. G3BP é um evolutivamente conservada RNA-BP que foi inicialmente caracterizado através de sua interação com uma proteína ativando-Ras GTPase (RasGAP p120 6); mas esta interação foi recentemente revisitou 7. A família G3BP inclui dois membros em mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) e G3BP2 8. Ambas as proteínas colocalize em SGs, quando as células são submetidas a tensão 9. G3BPs compreendem um domínio N-terminal NTf 2 sugeriu a influenciar a sua localização e oligomerização, seguido pela prolina rica (PxxP) motivos, então motivos C-terminal associada com a ligação RNA: o RNA-canônico Recognition Motif (RRM) com conservadas RNP1 e RNP2 motivos , seguido de uma caixa rica arginina-glicina (RGG). Curiosamente, a análise de diferentes partes da proteína através da construção de diferentes domínios fundidos com EGFP mostrou que o domínio NTf2-like e o domínio de ligação a ARN-se o mais eficiente recrutados para SG, sugerindo a importância das propriedades de dimerização e de ligação de ARN em a montagem da SGS. Diversos modelos têm revelado diferentes funções das proteínas G3BP in vitro 10-13.Perturbação de G3BP em ratos mostraram a importância desta proteína no crescimento do desenvolvimento e sobrevivência de 14, bem como um papel importante para G3BP no Sistema Nervoso Central (SNC), caracterizada por ataxia e defeitos em espacial da memória de trabalho 15. Deficiência G3BP leva à alteração neuronal plasticidade e cálcio homeostase, estabelecer uma ligação directa entre a formação SG e doenças neurodegenerativas 15. Assim, é importante ser capaz de estudar a dinâmica da SGS em células primárias, como neurônios. Este protocolo fornece uma maneira simples de observar a montagem de contendo G3BP1 SGS em células primárias em tratamento arsenito. Ele pode ser utilizado para estudar a montagem SG sob diferentes condições, por exemplo, diferentes tipos de stress. Ele também pode ser adaptado a outros grânulos ou outros componentes de SG. Com efeito, este protocolo incide sobre G3BP1, mas existem outros grânulos de stress como marcadores TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Retardo Mental Síndrome de proteína) 16, (proteína de ligação DNA resposta transacional 43) TDP-43 17 ou 18 Staufen. Em particular, as proteínas como TIA-1 / R são, como G3BP, proteínas de ligação de ARN de nucleação que podem induzir a montagem SGs, quando sobre-expresso, mesmo se os diferentes SGs formadas pode variar em função, regulação e transcritos associados. A transfecção de versão marcou-fluoróforo de qualquer um destes componentes-chave ou nucleadores da SGS pode ser realizada para determinada imagem montagem e dinâmica do GV.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Pré-aquecer a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Fundo de vidro B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Tratado ou não (tratado: aumenta a fixação das células aderentes)</td></tr> <tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Pré-aquecimento a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal</td><td></td><td>21103</td><td>Pré-aquecido a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Muito fino, pontas 0,1 mm (útil para remover meninges)</td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Muito fino, pontas 0,1 mm</td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Pode ser útil para remover hipocampos</td></tr><tr><td>Transfecção Polyplus Reagente JetPEI&nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfecção, siga o protocolo de encaminhamento</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser invertido</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de g3bp estresse grânulos dynamics em pilhas ao vivo

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

A SGS pode ser visualizada nas células por imunocoloração de componentes protéicos específicos ou poli + mRNAs. SG são altamente dinâmico e o estudo da sua montagem e o destino é importante entender a resposta celular ao stress. A deficiência em fatores-chave da SGS como G3BP (RasGAP SH3 domínio Binding Protein) leva a defeitos de desenvolvimento em ratos e alterações do Sistema Nervoso Central. Para estudar a dinâmica da SGS em células de um organismo, pode-se pilhas de cultura e seguir a localização de um componente marcado transfectadas da SGS. Descrevemos experiência de lapso de tempo para observar contendo G3BP1 SGS em rato embrionárias fibroblastos (MEFs). Esta técnica também pode ser usada para estudar SGs contendo G3BP em neurónios vivos, o que é fundamental, uma vez que foi demonstrado recentemente que estes SG são formadas no aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta abordagem pode ser adaptada a qualquer outro componente do corpo celular e de proteína de grânulo, e realizadacom animais transgénicos, que permite o estudo directo de grânulos, por exemplo, a dinâmica na ausência de um factor específico destes grânulos.

A formação de grânulos de stress é importante na resposta de células ao stress, permitindo uma adaptação celular com tradução parada, até que a pressão foi eliminada, associado à prevenção de apoptose. Este ensaio permite estudar as SGS em células primárias, seguindo a localização dos principais componentes proteicos SGs (Figura 1). G3BP, um fator-chave de montagem SG, está presente, em vez difusamente no citoplasma das MEFs cultivadas ou neurônios (Figura 2A A e C), e ...

Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a dinâmica de grânulos de ribonucleoproteínas em células primárias, especialmente a formação de grânulos de estresse. Isso é alcançado primeiramente cultivando células, como fibroblastos embrionários de camundongo ou neurônios hipocampais, a partir de animais de interesse. Como segundo passo, um componente marcado dos grânulos de estresse é transfectado para permitir sua visualização.Em seguida, as células são submetidas a estresse e monitoradas por microscopia confocal com registro temporal. Os resultados obtidos mostram a dinâmica de grânulos de estresse contendo G três BP um em neurônios de miotoses ou do hipocampo, com base na sua visualização direta. Esse método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a resposta ao estresse em células como os neurônios.Por exemplo, em camundongos, observaram-se defeitos neuronais após a diminuição do RNA e a inibição de proteínas essenciais para os grânulos de estresse. Assim, este método pode ajudar a compreender os mecanismos por trás dessas observações. Após a eutanásia de um camundongo grávido E 13,5, higienize o camundongo com etanol 90% e remova os cornos uterinos sob uma capela asséptica.Transfira os cornos para DPBS a 37 graus Celsius e remova os embriões. Transfira os embriões para uma placa de 100 milímetros. Remova os tecidos em excesso e lave-os com DPBS morno.Agora, sob microscópio, remova as extremidades, órgãos internos e a parte superior da cabeça contendo o cérebro. As seções da cauda ou da cabeça podem ser usadas para genotipagem. Pique os tecidos restantes em um recipiente separado por pelo menos um minuto.Não combine genótipos se eles devem variar dentro da ninhada. Cubra o tecido picado com uma vez a solução de tripsina-EDTA e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio mes completo.Para interromper a reação, solte o tecido com uma pipeta e transfira a suspensão resultante para um tubo de 50 mililitros. Complete o tubo com meio e deixe o conteúdo sedimentar. Em seguida, decante as células suspensas.Em seguida, centrifugue a suspensão a 300 Gs durante cinco minutos. À temperatura ambiente, re-suspenda o pellet em seis mililitros de meio completo por embrião. A contagem de células nucleadas viáveis deve ser de cerca de 5 milhões por embrião.Em seguida, plaque placas de 60 milímetros com três mililitros de suspensão celular e cultive-as. Troque o meio no dia seguinte e deixe as células crescerem até a confluência. Quando as células forem subcultivadas, apenas os fibroblastos sobreviverão.Divida as placas confluentes em placas de vidro de 35 milímetros. Cultive essas placas até atingirem entre 50 e 70% de confluência e prossiga com a transfeção.Para cada placa de 35 milímetros, prepare três microgramas de plasmídeo purificado para a transfeção. O uso de um kit de transfeção disponível comercialmente será suficiente. Neste exemplo, um vetor que expressa o RAs gap.A proteína de ligação de três domínios SSH é transfectada. É um componente importante dos grânulos de estresse. O procedimento é, é claro, aplicável ao estudo de qualquer vetor de interesse em fibroblastos no dia anterior à coleta do filhote.Prepare os recipientes revestidos com lisina Pauline começando pelo recolhimento de embriões de ratas com 18,5 DPC e transferindo-os para HBSS em um recipiente grande. Se desejado, filhotes neonatos podem ser usados como substitutos para evitar o sacrifício da mãe. Corte a cabeça e remova o cérebro.Em seguida, retire os cérebros das ninhadas para um recipiente limpo com HBSS sob um microscópio. Remova todas as meninges utilizando pinças finas. Em seguida, separe as partes desejadas do cérebro, como os hipocampos.Transfira os tecidos para 4,5 mililitros de HPSS frio em tubos de 15 mililitros e mantenha-os em gelo. Degrade os tecidos adicionando 0,5 mililitros de solução de tripsina a 2,5%. Incube-os a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos.Em seguida, remova a tripsina com três lavagens de HBSS, tomando cuidado para não perder nenhum tecido. Agora, re-suspenda os tecidos em meio mililitro a um mililitro de DMM com 10% de FBS. Em seguida, homogeneíze o tecido fazendo-o passar pela pipeta.Em seguida, troque para uma ponteira de 200 microlitros e pipete a solução até que não haja agregados visíveis. Adicione então 100 a 200 microlitros da suspensão celular em placas de fundo de vidro de 35 milímetros preparadas com meio DMM FBS e incube as placas. Após três horas de cultivo, substitua o meio por meio completo pré-aquecido para neurônios pelo tempo restante de cultura.Após cinco a 14 dias em cultura, transfira os neurônios utilizando o método de fosfato de cálcio. Vinte e quatro horas após uma transfeção bem-sucedida, os grânulos de estresse começarão a se montar devido à superexpressão de G três BP. Um estresse adicional induzirá ainda mais a montagem dos grânulos de estresse; pré-aqueça os componentes do microscópio confocal por pelo menos 20 minutos, incluindo o aquecimento da platina a 37 graus Celsius.É necessário um suporte para placa de 35 milímetros logo antes da visualização das células. Faça o seguinte. Primeiro, substitua qualquer meio celular contendo vermelho de fenol por um sem vermelho de fenol.Inicie a imagem das células imediatamente. Grânulos de estresse se formarão em menos de uma hora, portanto o estresse será induzido após a visualização das células. É importante iniciar as aquisições o mais rápido possível após a indução do estresse e ajustar com precisão dois parâmetros conforme o tipo de célula e o tipo de proteína.A intensidade do laser e a duração das aquisições devem ser reduzidas para minimizar a citotoxicidade. Em seguida, visualize as células com objetivas de imersão em óleo de 40 x e 63 x. Certifique-se de que a placa esteja plana no suporte e use a luz fluorescente o mínimo possível.Uma vez localizado um campo de interesse, utilize o software para adquirir imagens. Comece com a potência do laser em 10% ou menos e ajuste o ganho e o offset para obter a melhor relação sinal-ruído possível. Faça a varredura a 1000 hertz para minimizar a exposição das células ao laser, configure a pilha de imagens conforme desejado e mantenha o intervalo de varredura o mais longo possível para preservar melhor a saúde do cultivo.Adquira dados pelo tempo necessário, pois os grânulos em MEFs se formam dentro de 10 minutos e ficam claramente visíveis em uma hora. Em neurônios, o processo é um pouco mais lento. O G três BP deve fornecer um sinal razoavelmente forte por pelo menos 45 minutos usando as técnicas descritas.A formação de grânulos de estresse foi monitorada em células cultivadas. A localização da proteína marcada com G three BP era difusa no citoplasma de mitos cultivados e também difusa no citoplasma de neurônios. Com o tratamento com arsonito, as proteínas se localizam claramente em focos definidos e maiores em ambos os tipos celulares.Estas são as granulações de estresse. As imagens obtidas podem ser reconstruídas em um filme com lapso de tempo. O primeiro e o segundo vídeos mostram fibroblastos respondendo ao estresse.O terceiro vídeo mostra o mesmo. Em um neurônio do hipocampo, as reconstruções Zack oferecem a localização tridimensional do G três B bp marcado e, portanto, uma perspectiva diferente sobre o rastreamento. Após este procedimento, a imunocitoquímica pode ser usada para visualizar os componentes do grânulo após diferentes tipos de estresse e após auto-fixação.Isso pode responder perguntas quantitativas sobre o tamanho e o número dos diferentes corpúsculos celulares em diferentes condições.

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Processos celulares, tais como a migração das células têm sido tradicionalmente estudados em duas dimensões, superfícies de plástico duro. Este relatório descreve uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e análise dinâmica de proteínas em células migrando de uma forma mais fisiologicamente relevantes, matriz tridimensional.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Este vídeo demonstra um ensaio para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos, que consistem em mRNAs, proteínas de ligação a RNA (RBPs) e várias outras proteínas.

Um ensaio de imunofluorescência para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.

Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

O protocolo a seguir apresenta a detecção de focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular utilizando sincronização do ciclo celular seguida de coloração por imunofluorescência RPA2.

Visualizando focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular

Aprenda a visualizar a dinâmica dos grânulos de estresse G3BP em células primárias vivas usando microscopia confocal de lapso de tempo. Este método permite monitorar a formação e resposta celular ao estresse em neurônios e fibroblastos.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

Explorar mais vídeos