Name: Medição dos Efeitos de bactérias em C. Elegans Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a medir o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans usando o ensaio EIW. Este método permite quantificar respostas comportamentais a substâncias ambientais e patógenos.

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Os autores gostariam de agradecer a junho Middleton para o fornecimento de E. cepas faecalis e de orientação com a cultura de bactérias. C. elegans foram fornecidos pela CGC, que é financiado pelo NIH Escritório de Programas de Infra-estruturas de Investigação (P40 OD010440).

1) Elaboração de Nematóides Crescimento Mídia (NGM) <ol><li> Para fazer com que as placas 50, adicionar 1,5 g de NaCl, 8,5 g Agar ultrapura, e 1,25 g de peptona de um 1 Lflask. </li><li> Adicionar 487,5 ml de dH 2 O para o balão. Agite bem para misturar e cobrir abertura do frasco com um pedaço de papel alumínio. </li><li> Esterilizar a solução por tratamento em autoclave, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 min.) </li><li> Deixar a solução arrefecer até 45 ° C num banho de água. </li><li> Para a solução, adicionar o seguinte na ordem: 500 ul de colesterol a 5 mg / ml de solução (dissolvido em etanol), 500 ul de 1 M de CaCl2, 500 ul de 1 M de MgSO4, e 12,5 ml de tampão KPO4 (54,15 g KH 2 PO 4 e 17,8 g de K 2 HPO 4 em 500 ml de dH2O), tal como descrito em 18. </li><li> Usando pipetas esterilizadas, adicione 10 ml de solução de agar para cada 60 milímetros de poliestireno placa de Petri. Permitir que os meios de comunicação para solidificar à temperatura ambiente overnight. </li></ol> 2) Preparação de B Caldo E. Mídia coli <ol><li> Para fazer com que cinco culturas de 100 ml, adicionar 5,0 g de Bacto-triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 5,0 g de NaCl para uma proveta. </li><li> Adicionar água destilada estéril para um volume final de 500 ml. Aquece-se a solução sobre uma placa quente, com agitação, até que os solutos se dissolveram. </li><li> Colocar 100 ml de caldo de B em cinco frascos de vidro (pelo menos, 200 ml de volume). </li><li> Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos). </li><li> Permitir B caldo de arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso. </li></ol> 3) Sementeira C. elegans Placas de Manutenção <ol><li> Depois de permitir que as placas NGM a secar à temperatura ambiente durante pelo menos uma semana, inocular 100 ml de um caldo de cultura B com algumas colónias de E. coli (OP50). </li><li> Crescer E. coli, a cultura a 37 ° C durante a noite. </li><li> Pipeta uma ou duas gotas (aproximadamente 10081; l) OP50 de cultura para o centro de cada placa NGM. As placas são geralmente empilhados do lado da tampa para cima. Quando pipetagem (seeding), começam por pipetagem a cultura na placa, na parte inferior da pilha. Trabalhe seu caminho até cada pilha. Tente não mover as placas após a sementeira, porque é importante que a cultura não fique muito perto dos bordos da placa. </li><li> Permitir que as placas semeadas a secar à temperatura ambiente durante pelo menos uma semana antes da utilização. </li><li> Placas semeadas são armazenados (invertido), em recipientes de plástico vedados à temperatura ambiente. </li></ol> 4) A manutenção C. elegans Cepas <ol><li> Para manter bem alimentado C. estoques elegans, use um verme escolher para passar três L4s ou adultos grávidas para um novo, sem sementes NGM placa a cada 3-4 dias. </li><li> Placas de Loja (invertido), de preferência dentro de uma incubadora a 15 - 22 º C. Culturas em ensaios descritos foram armazenadas a 20 ° C. C. elegans desenvolvimento é dependente da temperatura. Como maintenance a temperatura aumenta, o tempo entre os estágios de desenvolvimento diminui. </li></ol> 5) Preparação de Tryptic Soy Agar (TSA), E. faecalis Meios de Cultura <ol><li> Para fazer 50 placas, meça 500 ml de água destilada estéril para um frasco e leve para ferver, agitando, numa placa de aquecimento. </li><li> Adicionar 20 g de pó de ágar TSA ao balão e permita que a solução para dissolver. </li><li> Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos). </li><li> Deixar a solução arrefecer até 45 ° C num banho de água. </li><li> Usando pipetas esterilizadas, adicione 10 ml de solução de agar para cada 60 milímetros de poliestireno placa de Petri. Permitir que os meios de comunicação para solidificar à temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> 6) Preparação de Tryptic Soy Broth (TSB), E. faecalis Meios de Cultura <ol><li> Para fazer com que os tubos 250 de cultura, medida a 500 ml de água destilada estéril para um frasco e quente numa placa de aquecimento com agitação. </li&gt; <li> Adicionar 15 g de pó de ágar TSB para o frasco e para permitir que o pó se dissolver. </li><li> Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos). </li><li> Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida, pipeta de 2 ml, em tubos de ensaio de 5 ml esterilizadas. </li></ol> 7) Preparação de Heart Infusion (BHI) Mídia Cérebro, com estreptomicina, para E. faecalis Cultura <ol><li> Medir 500 ml de água destilada estéril para um frasco e leve para ferver, agitando, numa placa de aquecimento. </li><li> Adicionar 26 g de meio BHI ao balão e permitir que a solução para dissolver. </li><li> Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos). </li><li> Deixa-se arrefecer a 45 ° C num banho de água. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, adicionar 0,5 mL de uma solução de estoque de 10 mg de estreptomicina / ml e agite para misturar. </li><li> Adicionar 10 ml da solução a cada 60 milímetros de Petri de poliestireno. </li><li&gt; Permitir mídia para solidificar à temperatura ambiente durante a noite. Placas de Loja (invertida) a 4 ° C até algumas horas antes do uso. </li></ol> 8) Mantendo E. faecalis Cepas <ol><li> Para manter E. estoques faecalis, use uma agulha esterilizada para raia colônias individuais em ágar placas de soja trípticos separados (TSA). </li><li> Crescer as culturas a 37 ° C durante a noite. Placas de Loja (invertida) em um saco ou caixa selada à temperatura ambiente durante várias semanas. </li></ol> 9) Preparar E. Placas faecalis para EIW Assay <ol><li> Inocular uma cultura ml 2 TSB com uma colônia de E. faecalis e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Pipetar 20 ul de E. faecalis cultura para o centro de uma placa BHI-estreptomicina preparada, e incubar durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 10) Preparar E. Placas coli para EIW Assay (placas de controlo) <ol><li> Inocular um ml B-bro 100º cultura com uma colônia de E. coli OP50 e incubar durante a noite a 37 ° C </li><li> Pipetar 20 ul da cultura OP50 para o centro de uma placa NGM unseeded e permitir que as placas semeadas a secar à temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> 11) Ovo em Ensaio Worm <ol><li> Escolha 15-20 encenou-L4 C. elegans (Figura 1) para o centro de uma camada de bactérias numa preparada BHI-Strep-E. placa faecalis. Tenha cuidado para não transferir um monte de OP50 a placa BHI. Escolha o mesmo número de L4s a um controle de placa NGM-OP50. </li><li> Incubar as placas durante 40 horas a 20 ° C. </li><li> Preparar a solução de água sanitária a 20%. Misture a água sanitária comercial (hipoclorito de sódio a 6,0%) com o volume adequado de água destilada. </li><li> Adicione 10 gotas mL de solução de água sanitária para dez locais distintos em uma tampa de plástico (de um worm ou placa bacteriana). </li><li> Usando uma picareta verme, transferir um verme em cada gota de água sanitária. Agite suavemente a ponta dopegar na gota de água sanitária para certificar-se o worm tem lavado o fim da escolha (confirmar vendo a gota sob um microscópio de dissecação). </li><li> Permitir que a cutícula para dissolver durante cerca de 10 min ou até que os vermes se abriu, expelindo os ovos (Figura 2). Tenha cuidado para não transferir os ovos a partir da placa. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, a contagem dos ovos em cada gota de água sanitária. </li></ol>

<ol><li>Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+octopamine+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 216, 1012-1014 (1982).</li>
<li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genetic+and+cellular+analysis+of+modulated+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans+%5B%5D%22">Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]</a>. , Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Trent, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genetic+and+behavioral+studies+of+the+egg-laying+system+of+Caenorhabditis+elegans+%5B%5D%22">Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]</a>. , Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1982).</li>
<li>Chase, D. L., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+RGS+protein+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).</li>
<li>Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg-laying+defective+mutants+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 104, 619-647 (1983).</li>
<li>Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+analysis+of+neurotransmitters+controlling+egg+laying+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).</li>
<li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21, 203-214 (1998).</li>
<li>Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+cellular+basis+for+acetylcholine+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).</li>
<li>Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285HT%29%2C+fluoxetine%2C+imipramine+and+dopamine+target+distinct+5HT+receptor+signaling+to+modulate+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> Genetics. 169, 1425-1436 (2005).</li>
<li>Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchafer%2C+WR+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2005).</li>
<li>White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+pathway+for+the+development+of+the+Caenorhabditis+elegans+HSN+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons.</a> Nature. 336, 638-646 (1988).</li>
<li>Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhmurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+pseudomallei+kills+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+an+endotoxin-mediated+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis.</a> Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+life-+history+traits+of+Caenorhabditis+elegans+in+stressful+environments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments.</a> BMC Evol. Biol. 8, 15(2008).</li>
<li>Harvey, S. C., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+eggs+are+not+equal%3A+the+maternal+environment+affects+progeny+reproduction+and+developmental+fate+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 6, e25840(2011).</li>
<li>Klass MR, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing.+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais importantes na realização com êxito neste ensaio são os seguintes: 1) usando stocks bem alimentados de C. elegans, 2) cultura de tipos individuais de bactérias na placa de ensaio, 3) identificação precisão encenado L4 vermes para a exposição a E. faecalis, 4), mantendo o tempo de exposição a E. faecalis consistentes em todos os ensaios e 5) branqueamento tempo não deve exceder 10 minutos para impedir a desintegração do ovo. Para este ensaio, é import...

Caenorhabditis elegans, um microscópico, lombriga de vida livre, é um organismo modelo tradicionalmente usado para estudar os processos de desenvolvimento e de sinalização celular por causa de sua anatomia transparente, o desenvolvimento bem caracterizada, totalmente sequenciado o genoma, em tempo de geração curto, e homologia genética de seres humanos . Mais recentemente, C. elegans tornou-se um organismo modelo no campo da toxicologia ambiental e imunidade inata 10, 11. Esses vermes hermafroditas auto-fertilização se tornam sexualmente maduros dentro de dois a três dias de incubação do ovo. Durante o seu ciclo de vida, C. elegans passa por quatro estágios larvais (L1-L4), antes de atingir a idade adulta. Um isolado hermafrodita pode produzir, em média, 300 filhotes dentro de três dias de pico de fecundidade. Em reprodutivamente madura C. elegans hermafroditas, os ovos fertilizados são retidos no interior do útero durante várias horas antes de ser colocada. Onúmero normal de ovos armazenados no útero em qualquer momento (durante o pico da fecundidade) situa-se entre dez e quinze 12. O número de ovos no útero é uma função de ambos, a taxa de produção de ovos e a taxa de postura de ovos. Os ovos fertilizados são expulsos do útero pela contração da musculatura dezasseis vulvares dispostas em torno da abertura da vulva 13. Neurónios motores específicos do hermafrodita (do HSN) e neurónios motores VC sinapse para os músculos da vulva que afetam a contração muscular e, assim, postura comportamento 5,7,13,14. Expulsão dos ovos do útero ocorre devido à atividade coordenada de neurônios e músculos. Culturas de laboratório de C. elegans normalmente são levantadas em uma dieta de não patogênicas de Escherichia coli OP50. No ambiente natural, C. elegans entrar em contacto com uma variedade de fontes de alimentos, tais como as bactérias patogénicas, que podem ser potencialmente prejudiciais. Quando expostos a substâncias nocivas emambiente, C. elegans reter ovos até que o ambiente torna-se mais favorável. Presumivelmente, esta retenção de ovos é um esforço para proteger sua prole. Neste verme ovo em ensaio (EIW), C. elegans estão expostos às bactérias potencialmente patogénicas, Enterococcus faecalis, que é encontrada no meio ambiente. A exposição a formas patogénicas de E. faecalis pode causar infecção intestinal persistente e até mesmo a morte em C. elegans 15. A exposição a outras formas de bactérias patogénicas têm demonstrado afectar a retenção de ovo 16,17, no entanto, o efeito não foi quantificado. Além disso, o efeito de suavemente estirpes patogénicas de E. faecalis, as estirpes que não são imediatamente letal, sobre o comportamento de postura não foi estudado. EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans 4. Embora C. eleganssão transparentes, os ovos que se acumulam no útero pode ser difícil de quantificar num animal intacto. O ensaio EIW envolve branqueamento gravídico adulto C. elegans que foram expostos a bactérias, por um período fixo de tempo. A solução de água sanitária dissolve a cutícula externa deixando os ovos para trás. Os ovos são de refracção para os efeitos de branqueamento, devido à presença de uma casca de ovo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos libertados do útero dos vermes após o branqueamento. O ensaio é descrito um método simples, barato e rápido para quantificar o número de óvulos no útero de uma só vez, e, assim, quantificar os efeitos de E. faecalis sobre retenção de ovo. Este ensaio pode ser utilizado para quantificar o efeito de outros tipos de bactérias, toxinas ou medicamentos ambientais sobre a retenção de ovo. Este ensaio tem também o potencial de ser usada como uma tela para patogenicidade.

<table><tbody><tr><td>Ágar, ultrapuro</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Triptona</td><td>Becton Dickinson</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Cérebro Infusão de coração meio desidratado</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>781781</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans, cepa N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>Placas de cultura</td><td>de colesterol Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>para C. elegans</td><td>Tritech Research Inc.</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura para cepas</td><td></td><td></td> de E. faecalisFisher Scientific-Fisherbrand 875713<td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>E. faecalis</td> fornecidas por J. Middleton.<td></td><td></td><td> Todos os isolados foram confirmados como enterococos</td></tr><tr><td colspan="4">observando-se o crescimento em ágar enterococosel (BBL) e em caldo de NaCl a 6%;</td></tr><tr><td colspan="4"> todas as cepas cresceram a 44,5 &�rd; C e foram catalase negativa e esculina hidrolisada. Um sistema simplificado chave dicotômica baseada em reações de pigmentação e fermentação para seis açúcares&nbsp; (arabinose, manitol, metil-&alfa;-D-glicopiranosídeo (MGP), ribose, sorbose e sorbitol) permitidos&nbsp; identificação presuntiva de todos os E. Cepas faecalis (Efs não tem pigmentação e é arabinose, MGP&nbsp; e sorbose negativa e sorbitol, manitol e ribose positiva). Todas as cepas presuntivas de Efs&nbsp; foram confirmados usando o sistema API 20 STREP (Biomerieux). </td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Motic</td><td>SMZ 168B</td><td>qualquer microscópio com iluminação transmitida e ampliação de 50X deve ser suficiente</td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Tríptica (Meio de Ágar Soja-Caseína Digest), Difco</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticase (meio de digestão de soja-caseína), BBL</td><td>Becton Dickinson</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>extrato de levedura</td><td>Acros</td><td>61180-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

medição dos efeitos de bactérias em<em&gt; c. elegans</em&gt; comportamento usando um retenção ensaio egg

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans comportamento de postura de ovos é afetado por estímulos ambientais, como a osmolaridade 1 e vibração 2. Na ausência total de alimentos C. elegans também deixará postura de ovos e manter ovos fertilizados em sua 3 útero. No entanto, o efeito de diferentes fontes de alimentos, especialmente bactérias patogénicas e, particularmente, Enterococcus faecalis, sobre o comportamento de postura não está bem caracterizado. O ensaio in ovo sem-fim (EIW) é uma ferramenta útil para quantificar os efeitos de diferentes tipos de bactérias, neste caso E. faecalis, sobre o comportamento de postura. EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans 4. O ensaio EIW envolve branqueamento encenado, grávida adulto C. elegans para remover a cutícula e separar os ovos retidos do animal. Antes do branqueamento, os vermes são expostos a bactérias (ou qualquer tipo de sinalização ambiental) Por um período fixo de tempo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos retidos no interior do útero dos vermes. Neste ensaio, a um aumento na retenção quantificável de ovos após E. exposição faecalis pode ser facilmente medido. O ensaio EIW é um ensaio comportamental que poderia ser utilizado para rastrear para bactérias potencialmente patogénicos ou a presença de toxinas ambientais. Além disso, o ensaio EIW pode ser uma ferramenta para o rastreio de fármacos que afectam a sinalização de neurotransmissores, pois o comportamento de postura é modulada por neurotransmissores, tais como serotonina e acetilcolina 5-9.

Este ensaio permite a quantificação do número de ovos retidos no interior C. elegans após exposição a E. faecalis. L4 encenado vermes (caracterizados por espaço aberto transparente acima de sua vulva, Figura 1) foram expostos a E. faecalis até a idade adulta. Após 40 horas de exposição a E. faecalis, branqueamento foi realizado. À medida que a cutícula desintegrado na gotícula de lixívia, os ovos se tornou mais evidente (Figura 2). O número de ovos re...

Um ensaio ovo-in-worm (EIW) é um método útil para quantificar o comportamento de postura. Alterações na postura de ovos pode ser uma resposta comportamental do organismo modelo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; A substâncias ambientais potencialmente prejudiciais, tais como os produzidos por bactérias patogénicas.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

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Research

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Biology

Biologia

C. elegans O comportamento de postura de ovos pode fornecer informações importantes em estudos de desenvolvimento, reprodutivos e anatômicos. Este vídeo apresenta as etapas importantes de um ensaio de postura de ovos e mostra um experimento de amostra no qual um medicamento é testado quanto à toxicidade reprodutiva.

Ensaio de postura de ovos: um método para quantificar o comportamento de postura de C. elegans

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Apresentamos uma configuração e protocolo de gravação de comportamento que permitem análise automatizada do nematóide, preferência de Caenorhabditis elegans por compostos solúveis em um ensaio populacional. Este artigo descreve a construção de uma câmara de comportamento, o protocolo de ensaio comportamental e o uso de software de análise de vídeo.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.

Medir o efeito de produtos químicos sobre o crescimento e a reprodução de Caenorhabditis elegans

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Esse protocolo oferece um procedimento simples e de baixo custo para quantificar a taxa de letalidade embrionária em Caenorhabditis elegans. Ele permite a detecção direta de anomalias embrionárias em populações, sem equipamentos especializados ou expertise em coleta de vermes. O protocolo pode ser usado para quantificar os efeitos de mutações genéticas, derrubamentos gênicos mediados por interferência de RNA e dieta.

Quantificando a Taxa de Letalidade Embrionária em Caenorhabditis elegans

Aprenda a medir o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans usando o ensaio EIW. Este método permite quantificar respostas comportamentais a substâncias ambientais e patógenos.

Medição dos Efeitos de bactérias em

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