Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Esta tecnologia microfluídica visa medir a funcionalidade dos neutrófilos humanos diretamente de uma gota de sangue em uma plataforma que pode ser multiplexada. A câmara de carga central serve como fonte de sangue total e também atua como um sumidouro para os gradientes de atração de quimioterapia que se formam a partir das 16 câmaras quimiotáticas focais. A filtração mecânica exclusiva dos glóbulos vermelhos permite sondar a função dos neutrófilos no contexto natural do sangue, componentes celulares e bioquímicos.

A bifurcação entre um canal que leva à câmara quimiotática focal e um canal que sai do dispositivo permite a quantificação e modulação da direcionalidade dos neutrófilos migratórios. Assim, os resultados podem demonstrar como os neutrófilos que migram ativamente migram facilmente pelos glóbulos vermelhos presos e se acumulam em números ao longo do tempo. Uma característica única de nossos dispositivos microfluídicos é que eles são muito fáceis de fabricar e configurar.

Eles consistem em uma camada de PDMS fundido em um wafer microfabricado que unimos em um fundo de vidro, placa de poço único ou múltiplo. A principal vantagem dessa técnica é que ela requer apenas uma gota de sangue total. Os dispositivos podem ser usados com pipetas padrão, não têm partes móveis, não requerem tubulação ou bombas de seringa externas.

As implicações dessa técnica se estendem a aplicações clínicas em comparação com as nossas exigidas com as técnicas tradicionais. Nossa abordagem leva minutos desde o momento da coleta de sangue até os ensaios de migração de neutrófilos. Os novos pentes filtrantes de glóbulos vermelhos impedem que as hemácias bloqueiem a migração ativa de neutrófilos e diferenciam esse método de outros métodos microfluídicos.

Isso requer a remoção do sangue antes da realização dos ensaios de quimioterapia. A interferência mecânica dos glóbulos vermelhos e canais distingue nossa tecnologia e permite o teste de neutrófilos em nosso ambiente fisiológico de sangue total, incluindo soro e plaquetas. Portanto, a tecnologia é precisa e fácil de usar e pode avançar significativamente nossa compreensão do papel dos neutrófilos e do sistema imunológico inato na saúde e na doença.

Fabrique o wafer do molde mestre para definir os canais de migração de acordo com as instruções do fabricante Primeiro padrão. A primeira camada fotorresistente negativa à base de epóxi de três mícrons padroniza a segunda camada de 50 mícrons para definir a carga celular e as câmaras de quimiocinas. Agora, para os dispositivos fundidos de polimetil soano, misture vigorosamente 20 gramas de PDMS com dois gramas de iniciador por cinco minutos.

Despeje cuidadosamente o PDMS no wafer padronizado e desgaseifique em um dessecador a vácuo por uma hora. Em seguida, asse e cure os dispositivos microfluídicos PDMS em um forno a 65 graus Celsius por pelo menos três horas. Para garantir que o PDMS seja cozido na temperatura correta, certifique-se de monitorar a temperatura interna do forno com um termômetro.

Perfure as câmaras centrais de carga de sangue total de 1,5 milímetro de diâmetro. Também perfure dispositivos inteiros em forma de rosquinha de 5,0 milímetros de diâmetro. Remova as partículas dos dispositivos de rosquinha usando fita adesiva.

Em seguida, enxágue uma placa de vários poços com água deionizada e seque com nitrogênio depois de colocar a placa em um forno a 60 graus Celsius por cinco minutos. Tratamento de plasma de oxigênio por 35 segundos. Em seguida, adicione os dispositivos de rosquinha e o plasma de oxigênio.

Trate novamente por mais 35 segundos. Transfira cuidadosamente os dispositivos para os poços do prato e asse com dispositivos colados em uma placa quente de 80 graus Celsius por 10 minutos. Após o tratamento com plasma de oxigênio, o dispositivo é hidrofílico e os efeitos capilares podem promover o escorvamento dos pequenos canais no dispositivo.

Para a solução quimioatrativa, misture cinco microlitros de FMLP 10 micromolar com cinco microlitros de um miligrama por mililitro de fibronectina e 490 microlitros de HBSS. Pipete lentamente a solução de quimioterapia para a pipeta da câmara de carga de sangue total e mais 20 microlitros do atrativo de quimioterapia ao redor da parte externa do dispositivo. Coloque o prato em um desidratado por 15 minutos.

Aplique um vácuo no dispositivo para prepará-lo com solução quimioestimulante. Remova a placa do dessecador e confirme o umedecimento do canal do dispositivo diminuindo gradualmente o tamanho da bolha de ar. Em seguida, lave toda a câmara de carga de sangue e a parte externa do dispositivo para remover o excesso de solução quimioestimulante.

Em seguida, para gerar um gradiente de atrativo quimioterápico de cada uma das câmaras quimiotáticas focais para o centro do dispositivo. Injete suavemente 100 microlitros de PBS no orifício para que uma gota de PBS se forme na parte superior do dispositivo. Incline a placa e pipete um mililitro de PBS ao redor do dispositivo para coletar no fundo do poço, aspire o líquido e repita a lavagem com PBS três vezes.

Em seguida, preencha cada poço com mídia para submergir os dispositivos e aguarde 15 minutos para que o gradiente se estabilize. Em seguida, pipete lentamente dois microlitros de sangue total em cada câmara de carga de sangue total. Para coleta de sangue por picada no dedo, lave as mãos com água e sabão.

Seque a pele como uma solução anticoagulante. Adicione um mililitro de 0,2% HSA e 10 microlitros de ganchos micromolares de 32,4%. Manchar em um tubo de coleta de sangue de heparina, picar o dedo do doador saudável e limpar a primeira gota de sangue.

Colete 50 microlitros de sangue na solução de coloração anticoagulante e misture suavemente. Configure a biocâmara para 37 graus Celsius, 80% de umidade e 5% de CO2. Inicie imediatamente a imagem de lapso de tempo com ampliação de 10 x ou mais para uma análise estatística significativa rastreie manualmente pelo menos 50 neutrófilos em cada amostra.

Conte as células que entram nas câmaras de quimiotaxia focal ao longo do tempo. Em seguida, usando a imagem J, calcule as velocidades dos neutrófilos no canal entre o WBLC e o FCC. Em seguida, para quantificar a direcionalidade dos neutrófilos, conte o número de células que passam pela bifurcação e calcule a razão entre o número de células que se voltam para as câmaras de quimiotaxia focal e as células que saem do dispositivo.

As células que não são direcionais não seguem o gradiente quimiotático e, portanto, migram em números iguais em direção ao FCC e ao canal de saída. Neste experimento, o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos no sangue total foi validado medindo o acúmulo de neutrófilos em direção a um gradiente de FMLP. Os resultados confirmam que os glóbulos vermelhos são presos pelo pente de filtração, enquanto os neutrófilos são capazes de migrar ativamente para fora do sangue total.

O gradiente linear estável de quimio-atrativo formado pelo dispositivo microfluídico de sangue total foi confirmado usando dextrana marcada com FSE e os níveis de fluorescência foram medidos ao longo do tempo. Os resultados obtidos usando a nova plataforma de quimiotaxia WB revelam que neutrófilos de todas as fontes sanguíneas migram com velocidade consistente e com células migratórias totais semelhantes. É importante ressaltar que este sistema permite a quantificação dos neutrófilos, portanto, diferencia a quimiotaxia da quimioterapia Kinesis Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em menos de 10 minutos se for realizada corretamente.

A incorporação de nosso dispositivo em uma placa de 12 ou 24 poços usando técnicas padrão de sala limpa, instalações, a triagem de várias condições simultaneamente. Usando essa técnica, somos capazes de medir a velocidade e a direcionalidade dos neutrófilos no nível de uma única célula. Ao contrário dos métodos tradicionais que medem a migração de células de endpoint em massa, lembre-se de preparar cuidadosamente o dispositivo microfluídico e carregar ambas as amostras lentamente para que as hemácias não sejam empurradas para além do com do dispositivo.

O protocolo descrito é particularmente útil para medir deficiências quimiotáticas transitórias de neutrófilos, permitindo amostragens repetidas em vários pontos de tempo, mas também pode ser adaptado para medir a migração de outros tipos de células de diferentes organismos modelo. Este método pode fornecer informações sobre alterações temporárias da funcionalidade dos neutrófilos em pacientes com várias condições associadas a maior incidência de infecções, incluindo pacientes com trauma, pacientes após cirurgia de grande porte e pacientes com câncer recebendo quimioterapia.