Name: Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de sensibilização de AMPc em células para triagem de alta vazão usando células criopreservadas e tecnologia HTRF. Este método acelera a descoberta de vias moleculares em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer o Sr. Richard Zink e Todd Wiernicki para treinamento e orientação metodológica ensaio. Agradecemos também a John Paul Spence para a leitura cuidadosa e sugestões editoriais. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company por meio do Programa de Pesquisa Prêmio Lilly (LRAP).

1. Expansão e criopreservação de células Ensaio Pronto <ol><li> Cultura de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) sobre uma cultura de células prato 15 centímetros 2 em meio F12 de Ham enriquecido com 1,0 uM de L-glutamina, 800 ug / mL de G418, 300 ug / higromicina ul, 100 U / ul penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 até as células são 90-95% confluentes. Lavar as células com 10 uL de Tampão Fosfato Salino (PBS), e colher as células por adição de 3 ul de tampão de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Ressuspender as células utilizando 12 mL dos meios de cultura e contagem de células usando exclusão do azul de tripan. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 mL de meio de congelação (10% de dimetil sulfóxido, 90% FBS). Dilui-se a suspensão de células para se conseguir a concentração desejada de células (por exemplo, 1-20 x 10 6 células / mL). </li><li> Alíquota 1,0 mL da solução de célula para cada cryovial. Incubar as criotubos em um recipiente de congelação de células a -80 ° C durante a noite. Transferir os criotubos para um líquido N2 tanque para o armazenamento de longo prazo. </li></ol> 2. Cultivo de células Pronto Ensaio (e transfecção reversa opção) <ol><li> Rapidamente descongelar um criotubo gelado de células em um banho de água a 37 C º. Uma vez que as células são descongelados, transferir as células para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de Opti-MEM, e misturar invertendo o tubo 3-5x. </li><li> Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de Opti-MEM. </li><li> Contar as células usando exclusão com azul de tripano para determinar a viabilidade das células e diluir as células viáveis, conforme necessário (por exemplo. De 3 x 10 5 células / mL de concentração) emOpti-MEM. Placa 10 uL / ​​poço de células em cultura de tecidos tratados placa de 384 poços com uma pipeta multicanal. </li><li> Fazer diluições seriadas de AMPc em Opti-MEM para gerar uma curva padrão para estimar a produção de cAMP por as células (de acordo com a recomendações do fabricante - ver Secção 7). Adiciona-se 10 uL / poço dos padrões de cAMP à placa Nota:. Uma curva padrão único pode ser preparado sobre uma placa separada ou poços em branco sobre uma das placas de ensaio. </li><li> Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 1 hora. </li></ol> 3. SiRNA transfecção opção Inverter * Esta secção é opcional e relevante para a Figura 3. <ol><li> Prepara-se uma solução de siRNA em DDH RNase 2 O (por exemplo, de 0,4 pmol / ul). Adicionam-se 5 ul a poços individuais de placas de 384 poços, e centrifugar a placa a 100 xg por 15 sic à temperatura ambiente. </li><li> Diluir Lipofectamina 2000, em Opti-MEM por um fator de 0,006 (por exemplo, adicionar 6 mL de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), e misture por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Incubar a solução Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 5 ml da solução de Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluída para poços individuais de placas de 384 poços que já contém siRNA. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Células prontas ensaio em placa, como descrito acima (Seção 2). Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Retornar placa de ensaio para incubadora humidificada a 37 ° (5% CO 2) C durante 48-96 horas, tal como determinado para o gene alvo derrubar (ver discussão). </li></ol> 4. Pequeno Screening Molecule <ol><li> Dilui-se o fármaco de interesse (por exemplo, inibidores. Moléculas pequenas) em Opti-MEM a 6x a concentração final desejada. Diluições em série pode ser concluída usando pipetas de mão ou uma estação de tratamento de líquido. </li><li> Adicionar 2,5 mL / poço de composto de teste ou tampão contendo veículo (por exemplo, DMSO) para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente (incubação é opcional). </li></ol> 5. Persistente tratamento com o agonista <ol><li> Prepara-se uma de 600 nm (ou seja. 6 vezes a concentração final desejada de 100 nM), solução de quinpirole em Opti-MEM. </li><li> Adicionar 2,5 mL / poço de solução quinpirole 600 nM para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 2 horas. </li></ol> 6. Estimulação de AMPc Acumulação <ol><li> Durante a incubação de 2 horas, preparar as stimulatiem solução em Opti-MEM. A solução de estimulação é composta por 40 uM de forscolina, 2 uM de 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 uM espiperona (todas as concentrações no passo 6 são 4x a concentração final desejada). </li><li> Adicionar 5 uL / ​​poço da solução de estimulação para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora. </li></ol> 7. Têmpera e Estimativa de cAMP Acumulação <ol><li> Produção de AMPc pelas células é medida utilizando o kit de cAMP dinâmica 2, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, reconstituir anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 em água destilada. Congelar alíquotas a -20 ° C para armazenagem de curta duração. </li><li> Dilui-se uma alíquota de anti-AMPc-criptato e uma alíquota de cAMP-D2 separadamente em tampão de lise de acordo com as instruções do fabricante para fazer soluções de trabalho. </li><li> Add 10 ul / poço de solução de trabalho de anti-cAMP-criptato e 10 ul / poço de solução de trabalho de cAMP-D2 para a placa de 384 poços com uma pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Leia a placa em um leitor de placas de fluorescência (configuração de escala automática para a sensibilidade) com uma excitação de 337 nm e medir as emissões em 620 nm e 665 nm por instruções do fabricante. </li><li> Aplicar análise raciométrica para avaliar curva padrão cAMP por instruções do fabricante. Usando os valores resultantes, extrapolar a acumulação de AMPc estimada nos poços de teste, utilizando o software de análise de dados. </li></ol>

<ol><li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha%28i%2Fo%29-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li>
<li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids%3A+tolerance%2C+withdrawal+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li>
<li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens%2Fstriatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li>
<li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m-Opioid+receptor+desensitization+by+%CE%B2-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li>
<li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms%3A+insights+from+knockout+and+overexpression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+type+5+%28AC5%29+is+an+essential+mediator+of+morphine+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li>
<li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets%3A+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Interv%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6%3A+A+progress+report%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li>
<li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%5BTitle%5D)+AND+%22Adenylyl+cyclase+isoform-specific+signaling+of+GPCRs.+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Structure%2C+Signaling%2C+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li>
<li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li>
<li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li>
<li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li>
<li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li>
<li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas%3A+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li>
<li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D%282%29+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).</li>
<li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+%28CAD%29-D2L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).</li>
<li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot%3A+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li>
<li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li>
<li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li>
<li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+dopamine+D2+receptor%2Fbeta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li>
<li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening%3A+a+paradigm+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg.+Focus%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Geneti%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li>
<li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22genome-to-lead%22+approach+for+insecticide+discovery%3A+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D%281%29-like+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Em um esforço para facilitar os estudos de sensibilização heteróloga, temos extensivamente modificado nosso método anterior alcançar uma simplificada &quot;mix e ler&quot; formato que pode ser alterada a seleção de alto rendimento e mecanismo de exame ação. As modificações importantes nosso protocolo pode ser resumido como se segue: 1) o uso de células criopreservadas como reagentes de ensaio &quot;pronto&quot;, 2) a miniaturização do ensaio em formato de 384 poços, e 3) a utilização da medição de HTRF cAMP. <p clas...

Um adenililciclase adaptativo (AC) de sinalização de resposta conhecida como a sensibilização de super-heteróloga ou foi descoberto pela primeira vez no laboratório do Prêmio Nobel, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg proposto que o aumento da capacidade de resposta AC observado após a ativação do receptor opióide δ crônica era um mecanismo envolvido na tolerância e dependência de opiáceos 1. Além disso a activação do receptor opióide δ crónica, esta resposta neuroadaptativo de sinalização AC também ocorre a seguir a activação persistente de vários outros Gαi / acoplada-o-receptores 2. Notavelmente, muitos destes receptores estão associados com a dor, distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, e incluem opióide μ / κ, D 2/4 da dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 receptores muscarínicos 2. Além de descobertas do Dr. Nirenberg, um grande corpo de evidências que liguem sensibilização de sinalização AC para a ativação do receptor opióide crônica tanto <em&gt; in vitro e in vivo 3-7. Sensibilização de CA também tem sido associado com uma variedade de doenças que envolvem receptores de dopamina D-2, como incluindo esquizofrenia e da doença de Parkinson (para revisão ver referência 2). Apesar da importância potencial de sensibilização, o mecanismo preciso (s) associado com a ativação persistente Gαi / acoplada-o receptor que leva ao aumento da capacidade de resposta AC permanece em grande parte desconhecido. Estes estudos fornecem a justificativa para examinar os mecanismos de sensibilização dos adenililciclase como um importante alvo neurobiológica. Da mesma forma, a relevância fisiológica da AC sinalização 8 e a importância que as isoformas individuais de corrente alternada conter nesta resposta adaptativa também deve ser reconhecido 2,9,10. No contexto de nossa pesquisa, as características gerais associadas com a sensibilização heteróloga das isoformas recombinantes de AC paralelo essas características descrita para estudar as isoformas endógenos de AC. Especificamente, pesquisas anteriores descobriram que a ativação de proteínas Gαi / o e subunidades posterior liberação / βγ rearranjo são requisitos importantes para a sensibilização do receptor induzida de todas as isoformas de AC. Além disso, diversos estudos sugerem que a sinalização de proteina-quinases e subunidades Gβγ esteja envolvido na sensibilização 2,11-13. ACs individuais também exibir padrões de sensibilização únicas e distintas 12. Por exemplo, a exposição persistente de receptores D 2 de agonistas está relacionado com a sensibilização de AC1 e AC8 em Ca 2 + / calmodulina 14,15 estimulação, ao passo que a AC3 estreitamente relacionada não é sensibilizado 2. AC2, AC4, e AC7 estão intimamente relacionados, no entanto, apenas a actividade da PKC-AC2 é estimulado de forma robusta sensibilizadas depois de exposição prolongada de receptores D 2 de agonistas 7,14,16,17. Além disso, AC5 e AC6 mostram um acentuado grau de hetersensibilização para ologous e Gás-acumulação de AMPc estimulada por forskolin após a ativação de receptores D 2 14,18-20, mas parecem diferir em sua exigência para Gβγ subunidade-AC interações 21. Embora a maioria dos estudos de sensibilização AC usaram linhagens de células modelo (por exemplo, células HEK293 expressando isoformas AC individuais), parece que estes resultados traduzem-se em modelos de células neuronais nativos 4,22. Mais recentemente, os efeitos de inibidores selectivos de pequenas molécula de isoformas AC identificados em células HEK293 que expressam as isoformas AC também podem ser convertidos para os estudos in vivo do comportamento 23. A falta de um mecanismo molecular para a identificação de sensibilização heterólogo provavelmente reflecte a complexidade da resposta adaptativa, bem como as propriedades reguladoras únicas do indivíduo AC isoformas 12. Desvendando tal complexidade é ainda mais complicada pelo uso de metodologia pesado tchapéu limitou investigadores académicos de empregar abordagens imparcial. Por exemplo, os nossos estudos mecanísticos envolveu o uso de modelos celulares continuamente cultivadas utilizando 24 - e 48-formato de poço de cultura de tecidos de 15. As células em cultura foram normalmente cultivadas durante 48 horas e, em seguida, submetido a tratamento com drogas agonistas (2-18 horas), seguido por uma série de lavagens e incubações de células (Figura 1). AC-isoforma específica de cAMP de acumulação protocolos foram então empregues, seguido por medição da acumulação de cAMP utilizando um processo trabalhoso e demorado [3 H] metodologia 15,24 ligação cAMP. A duração do início ao fim, para cada ensaio, geralmente requerido um total de quatro a cinco dias de plaqueamento de células para análise de dados (Figura 1). A aplicação de novas tecnologias e automação tem levado a melhorias marcado para estudos de sensibilização no ambiente industrial e HTS centro. Por exemplo, um grupo de trabalho com o Centro Nacional de Chemical Genomics relatou um dia dois HTS processo de ensaio para identificar pequenas moléculas inibidoras da μ do receptor opióide sensibilização induzida no formato 1536-25 bem. O presente artigo descreve os nossos esforços para desenvolver um ensaio HTS para estudos de sensibilização heteróloga utilizando tecnologias que estão disponíveis na maioria das instituições de pesquisa acadêmica. Esta estratégia foi conseguida por incorporação do uso de células criopreservadas de modelos celulares expressando heterologamente o receptor de dopamina D 2 em combinação com as isoformas de adenilil-ciclase recombinante endógenos ou individuais (CHO-D 2L ou células HEK-AC6 / D 2 L). Para melhorar o nosso rendimento, redesenhamos nosso ensaio de sensibilização 48 bem (cerca de&gt; 20 passos mais 4-5 dias) para um de cinco etapas, ensaio dia único em formato de 384 poços que era essencialmente &quot;misturar e ler&quot;. O novo formato utiliza um tempo homogêneo de fluorescência resolvida disponível comercialmente (HTRF) ensaio para medir cAMP accumulation em células intactas com um leitor de placa de multi modo. O ensaio é robusto e passíveis de triagem pequena molécula, e pode ser efectivamente aplicado a triagem de inibidores de sensibilização heteróloga. Além disso, podemos fornecer dados que permitem o uso deste ensaio com transfecção reversa de siRNA para triagem ampla biblioteca siRNA alvo ou genoma, com apenas uma pequena modificação para a abordagem geral.

<table><tbody><tr><td>Células CHO-K1-DRD2L</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12 media</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pratos de 15 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>tampão fosfato Salino</td><td></td> Cryovials <td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td></td><td>976171</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC tratadas com placas de 384 poços</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-) Sulpirida</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 reagente de transfecção</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Vida Tecnologias</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr>MP<td>livre de água, DNase e RNase</td><td>Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA siRNA</td><td></td><td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Dharmacon Controle de siRNA não direcionado</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

induzida por drogas sensibilização de adenililciclase: racionalização ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e sirna triagem applications

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilização de adenilil-ciclase (AC) de sinalização tem sido implicada numa variedade de distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, incluindo o abuso de substâncias e na doença de Parkinson. Activação aguda de Gαi / O-ligada receptores inibe a actividade de AC, enquanto que a activação persistente de estes receptores resulta na sensibilização heteróloga de CA e um aumento dos níveis de AMPc intracelular. Estudos anteriores demonstraram que esta melhoria da capacidade de resposta de CA é observada tanto in vitro e in vivo a seguir a activação crónica de vários tipos de receptores Gαi / ligada a O, incluindo D 2 da dopamina e μ receptores opióides. Apesar de sensibilização heteróloga do AC foi relatada pela primeira vez há quatro décadas, o mecanismo (s) que estão na base deste fenômeno são ainda desconhecidas. A falta de dados mecanicistas presumivelmente reflete a complexidade envolvida com esta resposta adaptativa, o que sugere que as abordagens nonbiased poderia ajudar na identificaçãoção das vias moleculares envolvidas na sensibilização heteróloga do AC. Estudos anteriores têm implicado quinase e sinalização Gbγ como sobreposição de componentes que regulam a sensibilização heteróloga do AC. Para identificar alvos sobrepostos únicos e adicionais associados com a sensibilização da AC, o desenvolvimento ea validação de um ensaio de sensibilização cAMP escalável é necessário para uma maior taxa de transferência. As abordagens anteriores para estudar sensibilização são geralmente complicado que implica a manutenção de cultura de células contínuo, bem como uma complexa metodologia para medição da acumulação de AMPc que envolve vários passos de lavagem. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de base celular robusto, que pode ser utilizado para rastreio de alto rendimento (HTS) em um formato de 384 poços iria facilitar estudos futuros. Usando dois modelos celulares D 2 receptores de dopamina (ie. CHO-D 2D e HEK-AC6 / D 2D), convertemos o nosso ensaio de sensibilização 48 poços (&gt; 20 passos 4-5 dias) para um período de cinco step, ensaio dia único em formato de 384 poços. Este novo formato é passível de triagem pequena molécula, e que demonstram que este desenho do ensaio também pode ser facilmente utilizado para a transfecção reversa de siRNA em antecipação de rastreio da biblioteca de siRNA alvo.

Parte I. Desenvolvimento de um ensaio de sensibilização bem heterólogo 384 para a identificação de inibidores de moléculas pequenas utilizando um modelo de células comercialmente disponível. Estudar sensibilização heteróloga em um modelo de celular, fizemos uma série de melhorias que nos permitiu agilizar o ensaio em um formato &quot;misturar e ler&quot;. Várias das modificações principais são destacadas a seguir, e são descritos em mais pormenor na discussão. O primeiro pas...

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um ensaio celular de sensibilização cíclica ao A MP em um único dia, para aplicações de triagem em alta escala, incluindo a triagem de bibliotecas químicas. Isso é realizado primeiramente descongelando e semeando células criopreservadas previamente preparadas e prontas para o ensaio. O segundo passo consiste em adicionar compostos de teste ou antagonistas às células, seguido pela adição da droga sensibilizadora da adenilciclase.Em seguida, adiciona-se um ativador da adenilato ciclase na presença de inibidor de fosfodiesterase para estimular o acúmulo de AMP cíclico. O passo final consiste em interromper a reação com detecção homogênea de fluorescência com resolução no tempo ou reagentes HTRF para AMP cíclico, em tampão de lise, e então medir a fluorescência. Em última análise, o uso de células criopreservadas e da tecnologia HTRF para AMP cíclico permite a realização de um ensaio de sensibilização em um único dia para triagem de moléculas de pequeno porte.Tivemos pela primeira vez a ideia desta abordagem quando passamos a ter interesse em utilizar triagem de alto rendimento para estudar a sensibilização heteróloga mediada por receptor de uma ciclase dentária. Duas técnicas fundamentais utilizadas aqui incluem o uso de células criopreservadas como reagentes prontos para uso e o ensaio homogêneo de tempo resolvido. Para kits de ensaio de cAMP, as metodologias básicas utilizadas aqui podem ajudar a responder perguntas fundamentais na sinalização celular e na descoberta de fármacos utilizando ensaios baseados em células. Para começar, cultive células CHO-D2L em uma placa de cultura celular de 15 centímetros conforme descrito no protocolo textual, incube as células a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com 5% de CO2 até que as células atinjam 90 a 95% de confluência, então lave as células com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS, recolha as células com três mililitros de tampão de dissociação celular após uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.Após ressuspender as células utilizando 12 mililitros do meio de cultura, conte as células utilizando a exclusão com azul de tripano, centrifugue a suspensão celular a 500 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em cinco mililitros de meio de congelamento; após diluir a suspensão celular para atingir a concentração celular desejada, alíquotas de um mililitro da solução celular em cada criovial. Incube as crioviais em um recipiente de congelação celular a -80 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, transfira os tubos de criopreservação para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para plaquear células prontas para ensaio, descongele rapidamente um tubo de criopreservação congelado de células em banho-maria a 37 graus Celsius. Assim que as células estiverem descongeladas, transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros contendo nove mililitros de OptiMEM e homogeneíze invertendo o tubo de três a cinco vezes. Após a centrifugação das células a 500 ×g por cinco minutos, aspire o sobrenadante e re-suspenda as células em um mililitro de OptiMEM, à temperatura ambiente.Conte as células utilizando a exclusão com azul de tripano para determinar a viabilidade celular antes de diluir as células viáveis conforme necessário. E plaque uma quantidade ideal de 10 microlitros de células por poço em uma placa de cultura de tecidos tratada com 384 poços. Utilizando uma pipeta multicanal.Realize diluições seriadas de AMP cíclico e otimizado para gerar uma curva padrão para estimar a produção de AMP cíclico pelas células. Adicione 10 microlitros por poço dos padrões de AMP cíclico à placa. Centrifugue a placa a 100 ×g por 15 segundos à temperatura ambiente e incube a 37 °C em incubadora umidificada com 5% CO₂ por uma hora.Para uma triagem de moléculas pequenas, primeiro dilua o fármaco de interesse no meio até seis vezes as concentrações finais desejadas. A diluição seriada pode ser realizada usando pipetas manuais ou uma estação de manipulação de líquidos. Adicione 2,5 microlitros por poço do composto em teste ou do veículo contendo tampão.Adicione a solução na lateral das cavidades utilizando uma pipeta multicanal e centrifugue a placa a 100 ×g durante 15 segundos. Para o tratamento agonista contínuo à temperatura ambiente, prepare uma solução de 600 nanomolar de Quin parol e optimum, e então adicione 2,5 microlitros por poço da solução de Quin parol 600 nanomolar na lateral das cavidades. Utilizando uma pipeta multicanal, centrifugue a placa novamente antes de incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por duas horas.Durante a incubação de duas horas, prepare a solução de estimulação no meio ótimo conforme descrito no protocolo do texto. Adicione cinco microlitros por poço da solução de estimulação ao lado dos poços usando uma pipeta multicanal após centrifugar a placa como antes, incubada à temperatura ambiente por uma hora. A produção de AMP cíclico pelas células é medida usando o kit dinâmico de AMP cíclico dois, conforme instruções do fabricante: brevemente, reconstitua o anticorpo contra PK-AMP cíclico e o AMPc-D2 em água destilada; dilua separadamente um alíquota do anticorpo contra PK-AMP cíclico e um alíquota do AMPc-D2 no tampão de lise, conforme instruções do fabricante, para preparar as soluções de trabalho. Para interromper o acúmulo de AMP cíclico na placa de 384 poços, adicione 10 microlitros por poço da solução de trabalho do anticorpo contra PK-AMP cíclico e 10 microlitros por poço da solução de trabalho do AMPc-D2.Usando uma pipeta multicanal, centrifugue a placa novamente a 100 ×g por 15 segundos à temperatura ambiente antes de incubar à temperatura ambiente por uma hora. Leia as placas em um leitor de placas com fluorescência usando uma excitação de 337 nanômetros e meça as emissões em 620 nanômetros e 665 nanômetros, conforme instruções do fabricante. Aplique análise ratiométrica para avaliar a curva padrão de AMP cíclico conforme instruções do fabricante. Usando os valores resultantes, extrapole o acúmulo estimado de AMP cíclico nas poças de teste utilizando software de análise de dados.Células CHO D duas L criopreservadas foram semeadas diretamente em placas de ensaio de 384 poços para demonstrar que ensaios de sensibilização podem ser realizados em formato de 384 poços, reduzindo o número de etapas de mais de 20 para cinco. Os estudos revelaram que um pré-tratamento de duas horas com Quin Perol potencializou o acúmulo subsequente de AMP cíclico quatro estimulado de maneira dependente da dose, compatível com sensibilização heteróloga. A segunda série de experimentos investigou se este novo ensaio simplificado poderia ser utilizado para avaliar inibidores da sensibilização.Os resultados iniciais revelaram que o pré-tratamento com haloperidol ou Perone, antagonistas prototípicos do D2, impediu completamente a sensibilização induzida pela Quin parol na acumulação cíclica de AMP estimulada por quatro fatores. Este método foi então utilizado para avaliar a potência de uma série de antagonistas do D2, a fim de testar se esses compostos inibiam a sensibilização de maneira semelhante aos resultados anteriores. Esses estudos demonstraram que os antagonistas do D2 inibiram a sensibilização induzida por agonistas de forma dependente da dose.O próximo objetivo foi desenvolver um ensaio de sensibilização em placa de 384 poços que possa ser usado para realizar triagem escalonável de biblioteca de siRNA por transfeção reversa, conforme descrito no protocolo textual. Os resultados revelaram que a exposição das células ao agonista Quin parole por duas horas levou a uma acentuada potencialização da acumulação de quatro skull e do AMP cíclico estimulado. O aumento na acumulação de AMP cíclico tanto com 100 nanomolares quanto com 300 nanomolares de quatro scullin foi superior a 15 vezes em comparação com as células tratadas com veículo. A transfeção reversa de GSS irna em células que expressam o receptor D dois bloqueia a sensibilização induzida por agonista da adenilato ciclase.Quando o agonista do receptor D2 Quin Perol foi adicionado e cíclico, a acumulação de MP foi estimulada e medida utilizando H-T-R-F-A; a resposta de sensibilização 15 vezes foi reduzida em 94%. Uma vez dominado, este ensaio completo pode ser realizado em menos de oito horas, se realizado corretamente segundo este procedimento. Outras moléculas sinalizadoras, como IP1 e Phospho ERK, também podem ser medidas para examinar vias de sinalização adicionais do receptor.

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, demonstramos o ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado - um ensaio de proximidade baseado em esferas. Ele utiliza grânulos aceptores e doadores de tamanho homogêneo, imobilizados com duas proteínas que tendem a interagir para rastrear pequenas moléculas potenciais que inibem as interações proteicas.

Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificada: um ensaio de proximidade baseado em esferas para rastrear pequenas moléculas que inibem as interações proteína-proteína

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Um protocolo é fornecido para selecionar aptâmeros de comutação de estrutura para alvos de moléculas pequenas com base em um método de seleção de esferas magnéticas de rigor ajustável. Os aptâmeros selecionados com propriedades de comutação de estrutura são benéficos para ensaios que requerem uma mudança conformacional para sinalizar a presença de um alvo, como o ensaio de nanopartículas de ouro descrito.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aprenda a desenvolver um ensaio de sensibilização de AMPc em células para triagem de alta vazão usando células criopreservadas e tecnologia HTRF. Este método acelera a descoberta de vias moleculares em neurociência.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications (Vídeo) | JoVE Journal

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Explorar mais vídeos