Prova

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um ensaio simples em labirinto em Y para testar a olfação em Drosophila melanogaster. Isso é realizado primeiramente pela privação alimentar das moscas por 16 a 18 horas, de modo que fiquem motivadas a explorar novos ambientes com estímulos voláteis. O segundo passo do procedimento consiste em montar o equipamento em labirinto em Y contendo as fontes de odor em papel filtro, como ácido acético em solvente versus solvente puro.

O terceiro passo é introduzir rapidamente e suavemente as moscas no tubo de carregamento. Após várias horas, o passo final é pontuar a localização das moscas no labirinto. Em última análise, os resultados podem mostrar uma resposta ao odorante a partir dos dados obtidos com o labirinto em Y.

Nós tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos desenvolver uma técnica simples e de baixo custo para testar a resposta olfativa de filos. Uma vantagem desta técnica em relação a outras opções é que ela permite que as moscas tomem uma decisão sem sofrer estresse excessivo. Quem demonstrará o procedimento será Megan Simon, aluna de doutorado do meu laboratório. Para este protocolo, tenha em mãos uma linhagem de moscas isogenicamente padronizada, com fenótipos comportamentais estáveis e robustos. Qualquer linhagem desse tipo pode servir como controle de referência para o teste olfativo; para cada linhagem genética a ser utilizada no experimento, faça retrocruzamentos com a linhagem de referência por cinco gerações.

Acasale fêmeas da linhagem experimental única com alguns machos isogênicos para cada retrocruzamento. Para experimentos olfativos, mantenha a drosófila em meio padrão de farinha de milho com um antibiótico, sob ciclo de luz 12:12 e a 25 graus Celsius.

Os experimentos devem sempre ser realizados a 25 graus Celsius e sob luz no espectro vermelho distante, não visível para drosófila. Também deve ser possível ventilar completamente o ambiente entre os experimentos antes de realizar o ensaio na manhã seguinte. Ao final do dia, transfira grupos de 10 a 20 linhagens experimentais para frascos de vidro com umidade fornecida por um pano úmido.

As moscas devem ser testadas em 16 a 18 horas, ou poderão morrer de desidratação ou inanição no dia seguinte. Monte o labirinto em Y. Comece unindo o conector em formato de Y a dois frascos de vidro usando conectores de espuma com pontas de pipeta aparadas, cujo formato cônico confere a esses dutos o caráter de passagens unidirecionais.

O terceiro ramo do Y está ligado a um tubo de carregamento feito a partir da parte maior de uma ponta de pipeta e permite a passagem do frasco de carregamento até o ponto de escolha do labirinto. Após cada túnel cônico há um frasco de vidro, um dos quais deve ser carregado com uma substância odorífera. Essas substâncias são bolus de 40 microlitros absorvidos em quadrados de papel de filtro de 28 milímetros.

Qual dos dois contém o odorizante deve alternar aleatoriamente para realizar primeiro o teste. Resfrie. Coloque as moscas no gelo brevemente, para que fiquem desaceleradas. Isso deve ser feito sob luz vermelha distante proveniente de lâmpadas LED e a 25 graus Celsius; solte suavemente o grupo de moscas no frasco de carregamento e carregue o labirinto em Y com as moscas de teste.

Não use anestesia com gás. É realmente essencial transferir as moscas para o frasco de carga rápida e cuidadosamente. Na verdade, esta é a etapa mais difícil deste experimento, pois as moscas precisam acordar rapidamente antes da difusão das demais na massa Y.

As moscas devem ter permissão para explorar o labirinto durante 24 horas, de modo que um número máximo de moscas migre para um ou outro frasco de vidro. O número de moscas presentes nos diferentes tubos serve para calcular o índice olfativo. Métodos estatísticos padrão devem ser aplicados a esse valor obtido a partir do comportamento de até 10 moscas.

Se 10 grupos de moscas não estiverem fornecendo resultados consistentes, os ensaios podem ser realizados com 20 grupos de moscas. Para limpar os componentes do labirinto, deixe-os desmontados em imersão em RBS 35 MD durante a noite. Em seguida, enxágue-os com água da torneira e faça uma última lavagem com água DI antes da secagem ao ar.

Respostas padrão a um odorante. Utilizando o labirinto em Y, incluem-se atração, indiferença ou evitação. Por exemplo, moscas Canton demonstram forte evitação ao ácido acético a 10%, enquanto não evitam o ácido fenilacético a 10%.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este ensaio de onda pode representar um ambiente artificial para as moscas. Após seguir este procedimento como um método, ensaios complementares como arenas de companheiros ou ensaios internos podem ser realizados para confirmar as respostas olfativas das moscas sob diferentes condições. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar simplesmente as respostas olfativas de *Drosophila melanogaster* utilizando o ensaio de onda.