Name: Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no Drosophila Antena (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a técnica de imunomarcação em montagem total de antenas de Drosophila para visualizar neurônios receptores olfatórios. Este método permite estudar os mecanismos moleculares da diversificação neuronal no sistema olfativo.

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Este estudo foi apoiado pelo Programa MEXT-suportada para a Fundação de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas e JSPS Jovem Cientista B subvenção para HT Gostaríamos de agradecer Ohtake Norihito para editar os vídeos.

1. Prepare placa maçã <ol><li> Misture 12,5 g de agar, 125 ml de sumo de 100% disponível comercialmente de maçã, 12,5 g de glucose, e 375 ml de H 2 O. Microondas a mistura durante 1 a 2 minutos e derramar para o prato de cultura de 3 centímetros de células. Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cruzamento genético <ol><li> Use o seguinte cruzamento genético representativo: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118 3. Dissecção e coloração protocolo <ol><li> Anestesiar a voar e, em seguida, cortar a cabeça voar verticalmente, segurando-o com uma pinça. </li><li> Com cuidado, coloque a parte que contém antenas em uma placa de maçã. </li><li> Corte o terceiro segmento da antena com uma tesoura de dissecção finas. </li><li> Colocar 90 mL de solução de fixação (4% de paraformaldeído em 0,1% de PBST (PBS com 0,1% de Triton X-100)) para o meio de um prato de cultura de fundo de vidro. </li><li> Gentilmente transferir o antenn dissecadoae com uma agulha fina diretamente para a solução de fixação. Se necessário, submergir fisicamente as antenas na solução usando agulha. </li><li> Incubar durante 40 minutos à temperatura ambiente (RT). Lava-se a antenas de 0,4% de PBST (PBS com 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutos em cada um, mantê-los no mesmo prato. Utilize pontas amarelas para remover e adicionar solução PBST. Utilizar 90 mL de solução de lavagem de cada vez. NOTA: Não coloque o prato em um shaker durante imunohistoquímica. Antes de retirar ou acrescentar a solução para o prato, trazer todas as antenas para o centro do prato utilizando a agulha e cuidadosamente adicionar ou retirar a solução a partir da borda do prato. </li><li> Bloquear as antenas com 90 ul de 5% de soro normal de cavalo a 0,1% em PBST, durante 20 minutos à RT. </li><li> Após a remoção da solução de bloqueamento, incubar as antenas com 90μl de anticorpos primários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C em um recipiente tal como descrito previamente humedecida <saté&gt; 8. </li><li> Lava-se a antenas de 6x 10 minutos em 0,4% de PBST. </li><li> Incubar a antenas com 90 ul de anticorpos secundários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C. Lavar 6x 10 minutos usando 0,4% de PBST. </li><li> Para montar as antenas, remover PBST a partir do prato de cultura, tanto quanto possível, e, gradualmente, apresentar duas concentrações diferentes de glicerol às antenas. Primeiro adicionar 40% de glicerol para o prato durante 1 a 2 minutos; em seguida, retire este e adicionar 80% de glicerol. </li><li> Extrair cuidadosamente as antenas (incluindo 80% de glicerol) da placa de cultura com ponta amarela e colocá-las em um slide. Delicadamente, coloque uma lamela em cima e selar as bordas lamela com unha polonês. As antenas estão agora prontos a ser trabalhada por meio de microscopia de fluorescência. </li></ol>

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<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
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<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A dissecção da antena Drosophila descrevemos é simples e fácil de executar em um ambiente de laboratório. Para garantir uma dissecção bem sucedido, é essencial utilizar uma tesoura fina gumes. Enquanto a antena imunocoloração dissecado, que é importante para incubar em um recipiente cheio de humidade para evitar a evaporação da solução de anticorpo. A antena dissecados tem uma tendência para flutuar na solução. Utilizando 0,1% de Triton em PBS, durante a fixação e bloqueio passos irá facilitar a submersão da an...

O sistema olfactivo é usado para distinguir entre uma imensa variedade de moléculas de odor e, subsequentemente, para enviar a informação resultante para os centros do cérebro superior. Esta entrada é usada para controlar com precisão os comportamentos animais fundamentais, como alimentação e acasalamento 1-6. Como cada tipo de neurônio olfativo está associada a um conjunto específico de odores, a diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s é essencial para o bom funcionamento do sistema olfativo 7. Genética de Drosophila nos permite realizar investigação único nível celular que envolve mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento de ORN e função fisiológica 8-16. Whole immunostaining montagem de Drosophila antenas nos permitiu compreender em maior detalhe os mecanismos moleculares envolvidos na diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s 7. Aqui nós fornecemos uma descrição completa de um método simples para achieve este.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de dissecção Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura com fundo de vidro&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-ELAV</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>7E8A10</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Rato anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Burro Anti-Coelho IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr>Diluição de <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Anti-Rato Burro</td> 1<td>:200</td></tr></tbody></table>

monte todo imunomarcação de neurônios receptores olfatórios no<em&gt; drosophila</em&gt; antena

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Moléculas odoríferas ligam aos seus receptores-alvo de forma precisa e coordenada. Cada receptor reconhece um determinado sinal e retransmite essa informação para o cérebro. Como tal, a determinação de como a informação é transferida para olfactiva do cérebro, modificando tanto a percepção e comportamento, a investigação mérito. Curiosamente, não há evidências emergentes que transdução celular e transcrição fatores estão envolvidos na diversificação de neurônio receptor olfativo. Aqui nós fornecemos um todo robusto montar método de marcação imunológica do ensaio in vivo olfativo organização neurônio receptor. Usando este método, identificamos todos os neurônios receptores olfativos com o anticorpo anti-elav, um marcador pan-neural conhecido e Or49a-mCD8 :: GFP, um neurônio receptor olfativo especificamente expressos em Nba neurônio usando anticorpo anti-GFP.

A garantia de que tanto a dissecção e fixação são realizadas rapidamente é um fator chave para alcançar o sucesso com este protocolo. Usando uma tesoura fina e pinças também é crucial. Após imunocoloração, fluorescentes rotulado antenas foram examinados sob um microscópio confocal. Nós, normalmente, seções 1 Hm usando uma lente de 20x. Nós rotulado Nba 7 ORNs usando Or49a-mCD8 :: GFP e contou o número de Nba ORNs no tipo selvagem antena. O repórter mCD8-GFP está localizada membrana celular e por isso a expres...

Aqui descrevemos o processo de imunomarcação de montagem total de antenas de Drosophila, o que nos permite entender melhor os mecanismos moleculares envolvidos na diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

O objetivo geral do seguinte experimento é visualizar os neurônios receptores olfativos utilizando coloração de antenas em montagem inteira. Primeiro, anestesie a mosca para cortar sua cabeça verticalmente. Em seguida, coloque a cabeça da mosca dissecada em uma placa de maçã.Em seguida, corte o terceiro segmento da antena e coloque-o no recipiente de cultura com fundo de vidro para realizar a imunohistoquímica. Após montar as antenas em uma lâmina de microscopia, podemos visualizar os diversos tipos de neurônios receptores olfativos por meio de microscopia confocal hi. Estamos trabalhando no sistema olfativo.O sistema olfativo é usado para distinguir entre uma imensa variedade de outras moléculas. A ampla gama de neurônios olfativos distintos que existem neste sistema permite a transmissão precisa e coordenada de informações dos receptores-alvo para os neurônios dentro do cérebro. Hoje descreveremos a coloração de antena em preparação inteira para detectar a diversificação desses neurônios receptores olfativos.Para garantir uma coloração bem-sucedida de antenas em montagem inteira, é essencial preparar um lote fresco de fixador imediatamente antes de iniciar o protocolo. Anestesie a mosca e, em seguida, corte a cabeça da mosca verticalmente segurando seu corpo com uma pinça. Agora, coloque cuidadosamente a antena dissecada em uma placa de maçã.Corte o terceiro segmento da antena usando tesoura de dissecação fina. Coloque 90 microlitros de solução fixadora no centro do recipiente. Usando uma agulha afiada, transfira suavemente a antena dissecada diretamente para a solução fixadora.Agora, deixe a fixação prosseguir sem interrupção por 40 minutos à temperatura ambiente para finalizar a fixação. Lave as antenas três vezes com PBST durante 10 minutos por lavagem durante a remoção da solução de lavagem. Primeiro, reúna todas as antenas no centro do recipiente usando uma agulha.Em seguida, remova a solução da lateral do recipiente. A agitação durante a incubação é desnecessária. Para preparar a coloração, remova a última lavagem com PBST e bloqueie as antenas fixadas preenchendo a câmara com 90 microlitros de soro de cavalo a 5% em PBST a 0,1%, substituindo então a solução de bloqueio por anticorpos primários diluídos em uma mistura de soro de cavalo a 5%.Em PBST, os anticorpos primários utilizados são anti-GFP de camundongo na diluição de um para 400 e anti-eof de rato, diluído na concentração de um para 200 para evitar que as amostras de antenas sequem. Coloque um papel-toalha úmido na tampa da placa de cultura e envolva-a com parafina. Em seguida, coloque a placa de cultura em um recipiente plástico contendo papéis-toalha úmidos.Incube as antenas nos anticorpos primários por 48 horas a quatro graus Celsius após 48 horas. Remova os anticorpos primários não ligados com seis lavagens em PBST durante 10 minutos por lavagem. Semelhante ao procedimento anteriormente descrito para remoção do fixador.Após uma hora de lavagens com PBST, adicione a solução de anticorpo secundário diluída em uma mistura de 5% de soro de cavalo em PBST; neste exemplo, os anticorpos são SI dois anti-IgG de coelho e SI três anti-IgG de rato. Cubra o recipiente com papel alumínio a partir deste momento para evitar a fotodegradação do fluoroquromo. Em seguida, incube a antena no anticorpo secundário por 48 horas a quatro graus Celsius.Neste momento, a antena está pronta para ser montada. Remova o máximo possível de PBST da placa de cultura e comece gradualmente a introduzir glicerol nas antenas. Em seguida, adicione glicerol a 40% à placa por um a dois minutos, depois remova-o e adicione glicerol a 80%, deixando por cinco minutos.A coloração fluorescente revelou neurônios positivos para Elof e os neurônios olfativos direcionados. Ao combinar este procedimento com outros métodos semelhantes, incluindo a geração de mosais genéticos de neurônios olfativos, esperamos iniciar a elucidação dos mecanismos que controlam a desdiversificação dos neurônios olfativos e responder a outras questões científicas importantes.

whole-mount-immunolabeling-olfactory-receptor-neurons-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e...

Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

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Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Os cílios dos neurônios sensoriais olfatórios contêm proteínas da cascata de transdução de sinal, mas uma análise espacial detalhada de sua distribuição é difícil em criossecções. Descrevemos aqui uma abordagem otimizada para marcação de montagem inteira e visualização em face de proteínas ciliares.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

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Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

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Aqui, apresentamos um protocolo para estágio e dissecar a desenvolver o tecido olfativo de espécies de Drosophila . O tecido dissecado mais tarde pode ser usado para análises moleculares, como quantitativa de RT-PCR (Reverse transcrição-Polymerase Chain Reaction) ou RNA sequenciamento (RNAseq), bem como na vivo de análise como a imuno-histoquímica ou em situ hibridização.

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Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

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Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda a técnica de imunomarcação em montagem total de antenas de Drosophila para visualizar neurônios receptores olfatórios. Este método permite estudar os mecanismos moleculares da diversificação neuronal no sistema olfativo.

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