Avaliando Clearance fagocítica de morte celular em Curso Experimental de Ligatable fluorescentes Sondas
27 de maio de 2014
Nós apresentamos uma nova técnica de fluorescência para seletiva marcação in situ de células fagocíticas ativos, o que claro off corpos celulares em acidente vascular cerebral. A abordagem é importante para a avaliação da reacção à isquemia cerebral uma vez que só uma pequena proporção de fagócitos presentes no cérebro isquémico participar na depuração de morte celular.
O objetivo geral deste procedimento é rotular seletivamente as células fagocíticas ativas, que limpam os cadáveres celulares no AVC. Isso é feito primeiro preparando componentes para a reação de amplificação de sinal baseada em Tite. O segundo passo é preparar as seções.
Em seguida, a reação de marcação é realizada usando a enzima vaccinia, topoisomerase e sondas fluorescentes responsáveis. A etapa final é o aprimoramento do sinal fluorescente baseado em IDE. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para avaliar a depuração fagocítica de células mortas em seções de tecido de isquemia cerebral focal.
A depuração de células mortas pelos fagócitos desempenha um papel importante na recuperação do cérebro após a isquemia. O método apresentado determina a eficiência deste processo rotulando apenas os tamanhos de pego que removem ativamente as células mortas. Embora esse método forneça informações sobre o cérebro isquêmico, ele também pode ser usado para estudar lesões isquêmicas em outros órgãos e tecidos.
Onde a depuração ácida de células mortas é importante. Embora a amplificação do sinal IDE ou etapa TSA ocorra no estágio final da rotulagem, a preparação para essa reação pode levar mais de uma hora. Portanto, é mais conveniente fazer os reagentes TSA primeiro.
O primeiro passo é fazer a solução estoque de TYROM de quatro flúor a 300 microlitros de DMSO para os arquivos de reagentes de tirao incluídos no kit de rotulagem TSA. Em seguida, prepare o tampão de lavagem TNT para dissolver completamente o reagente de bloqueio. Ao fazer o tampão de bloqueio TNB, adicione-o lentamente em pequenos incrementos enquanto mexe, aqueça a solução gradualmente a 55 graus Celsius.
Com agitação contínua, a solução parecerá leitosa e deve ser levada à temperatura ambiente antes de usar alíquota e armazenar a 20 graus Celsius negativos para uso a longo prazo para este procedimento, as lâminas são preparadas com antecedência montando seções de cinco micrômetros de espessura. Corte de tecido fixado em formalina. Primeiro, trate as seções com xileno por 15 minutos, reidratar as seções por meio de uma série de lavagens com etanol, seguidas de duas lavagens em água.
Em seguida, faça a solução de trabalho da proteinase K diluindo uma solução estoque a 50 microgramas por mililitro em PBS. A parte mais difícil deste experimento é determinar o período de tempo ideal para os controles de digestão da proteinase K com tempos de digestão mais curtos e mais longos podem ser necessários para garantir o sucesso, dependendo do tamanho e tipo de tecido. Adicione o volume apropriado de solução de trabalho de proteína ACE K às seções e incube por 15 minutos a 23 graus Celsius.
Após a incubação, lave as seções em água destilada duas vezes por cinco minutos cada. Enquanto as seções estão de imersão, prepare a mistura de rotulagem contendo a sonda ativa. Para preparar a solução ativa da sonda, combinar os oligonucleotídeos com água de um triss molar, HCL e a vaccinia topoisomerase fornecida no kit misturada suavemente por pipetagem e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir a ativação da sonda.
Após o segundo período de lavagem, retire as mechas do frasco e aspire a água restante. Quando estiver pronto, aplique a solução de sonda ativa preparada anteriormente. Deslize as seções e incube-as por 15 minutos a 23 graus Celsius.
Após a incubação, mergulhe as lâminas em água para remover suavemente as lamínulas. Lave as lâminas em água três vezes por cinco minutos cada. Após a última lavagem, cubra as seções de tecido com tampão bloqueador de TNB e incube as lâminas em uma câmara umidificada por 30 minutos em temperatura ambiente.
Durante este tempo, prepare uma diluição de um a 100 conjugados de peroxidase descascada e de rabanete. S-A-H-R-P no tampão de bloqueio TNB, recupere as lâminas e aspire o tampão de bloqueio TNB para longe. Antes de aplicar a solução S-A-H-R-P, use reagente suficiente para cobrir toda a seção do tecido.
Depois de cobertas, incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente Após a incubação, lave as lâminas três vezes por cinco minutos cada. No tampão de lavagem TNT à temperatura ambiente, prepare uma diluição de um a 50 de estoque de fluoro quatro TY IDE em um diluente de amplificação x imediatamente antes do uso. Pipetar a solução nas lâminas que cobrem completamente a secção de tecido.
Como a solução não pode ser reutilizada, descarte qualquer porção restante não utilizada. Incube as lâminas em temperatura ambiente por três a 10 minutos. Monitore a fluorescência.
Aumente ao microscópio até que os primeiros indícios de estruturas sejam visíveis neste momento. Prossiga rapidamente para a etapa de lavagem. Lave as lâminas três vezes por cinco minutos cada.
Em TNT: Lave o tampão à temperatura ambiente com agitação. Após a lavagem, adicione a solução anti-desbotamento com DPI e lamínula. Observe os resultados em um microscópio de fluorescência.
Essas imagens mostram dois exemplos de depuração ácida do PHA. A mancha nuclear é mostrada em fluorescência azul e a sonda topo de vácuo responsável é mostrada em diagramas de fluorescência verde dos eventos apresentados nessas imagens mostram núcleos de fagócitos e núcleos extras engolfados em tiques em vários estágios de digestão. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de três horas se for executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você saberá como usar sondas fluorescentes confiáveis em seções de tecido. Você também será capaz de rotular seletivamente os idos ativos, eliminando as células mortas no cérebro isquêmico.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica de fluorescência inovadora para rotular seletivamente células fagocíticas ativas envolvidas na eliminação de corpúsculos celulares após acidente vascular cerebral. O método é fundamental para compreender a resposta do cérebro à isquemia, já que apenas uma pequena fração dos fagócitos participa desse processo de limpeza.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- A eliminação fagocítica de células mortas é essencial para a recuperação cerebral após isquemia.
- Apenas um subconjunto de fagócitos participa ativamente desse processo.
- Compreender esse mecanismo pode orientar estratégias terapêuticas.
- O método apresentado também pode ser aplicado a outros órgãos e tecidos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma técnica para rotular seletivamente fagócitos ativos.
- Avaliar a eficiência da eliminação fagocítica em tecido cerebral isquêmico.
- Fornecer informações sobre a dinâmica da eliminação de células mortas.
Métodos Utilizados
- Preparação dos componentes da reação de amplificação de sinal baseada em Tite.
- Reação de marcação utilizando vaccinia, topoisomerase e sondas fluorescentes.
- Microscopia de fluorescência para visualização de células marcadas.
- Otimização dos tempos de digestão com proteinase K para cortes de tecido.
Resultados Principais
- Marcação bem-sucedida de fagócitos ativos em tecido cerebral isquêmico.
- Visualização da atividade fagocítica por meio de microscopia de fluorescência.
- Demonstração da aplicabilidade do método a outros tecidos.
- Informações sobre o momento e a eficiência da eliminação fagocítica.
Conclusões
- A técnica desenvolvida aprimora a compreensão dos processos fagocíticos na isquemia.
- Ela fornece uma ferramenta valiosa para o estudo dos mecanismos de eliminação celular.
- Aplicações futuras podem estender-se a diversos sistemas orgânicos afetados pela isquemia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação seletiva da eliminação fagocítica ativa em acidente vascular cerebral experimental permite a redução mecanicista de riscos nas vias neuroinflamatórias e orienta a validação de alvos para estratégias de recuperação do SNC. Este método com sonda fluorescente ligável oferece confiança preditiva na avaliação da eficiência dos fagócitos de gerenciamento de resíduos, apoiando a continuidade translacional da descoberta até a pesquisa pré-clínica. Sua capacidade de distinguir fagócitos ativos de inativos aprimora a tomada de decisões em portfólios de programas terapêuticos neuroprotetores e regenerativos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de eliminação fagocítica em tecido cerebral relevante para doenças.
- Apóia a validação funcional de alvos ao distinguir fagócitos ativos de células espectadoras.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas nas vias neuroinflamatórias e regenerativas.
- Fornece dados quantitativos para previsão com confiança em programas precoces do SNC.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara seções de tecido validadas para fluxos de trabalho de imagem quantitativa posteriores.
- Padroniza a detecção de eventos fagocíticos ativos para resultados de ensaio reprodutíveis.
- Permite triagem em larga escala de moduladores que afetam a eficiência da eliminação fagocítica.
- Apóia a avaliação confiável dos efeitos de compostos na eliminação de morte celular in situ.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças de lesão isquêmica no desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Oferece continuidade do descobrimento mecanicista à validação pré-clínica de estratégias de recuperação do SNC.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para candidatos neuroprotetores e regenerativos.
- Oferece desvio preditivo de riscos para falhas biológicas em estágios tardios relacionadas à incapacidade de eliminação celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a avaliação quantitativa da eliminação fagocítica em modelos de isquemia cerebral, apoiando tanto a validação de alvos quanto o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a eliminação mediada por fagócitos e a elucidação de vias em tecidos isquêmicos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de eventos fagocíticos ativos para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Oferece medições baseadas em fluorescência para comparar a eficiência de eliminação entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos pré-clínicos relevantes para lesões e recuperação do sistema nervoso central.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para o estudo da eliminação fagocítica em diversos contextos de tecidos e doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Padroniza a quantificação da eliminação fagocítica para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao esclarecer precocemente os riscos biológicos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de programas voltados à neuroinflamação e regeneração.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e preparação de cortes de tecidos.
- Necessita de acesso a reagentes especializados, incluindo sondas fluorescentes ligáveis e kits enzimáticos.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de marcação e de imagem para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos tipos de tecidos, mas pode exigir otimização das etapas de digestão e marcação.
- Depende do controle preciso das reações enzimáticas e dos parâmetros de imagem para obter resultados quantitativos.
