Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução
14 de março de 2014
Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.
O objetivo geral deste procedimento é isolar mitocôndrias associadas a mRNAs em processo de tradução. Isso é realizado primeiramente colhendo células de levedura cultivadas em condições que enriquecem mitocôndrias. O segundo passo é lisar suavemente as células na presença de cicloheximida.
Em seguida, as mitocôndrias são separadas dos componentes solúveis por centrifugação diferencial. O passo final é a extração de RNA das mitocôndrias e das amostras controle. Por fim, a análise northern é utilizada para demonstrar a pureza e qualidade do RNA associado às mitocôndrias.
A principal vantagem desta técnica é que muitos tipos de RNA podem ser isolados em uma única preparação. Assim, pode-se realizar uma análise comparativa. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia celular, como o direcionamento intracelular e a função de organelas.
Neste procedimento, mitocôndrias serão purificadas a partir de 100 a 150 mililitros de células de levedura cultivadas até uma DO 600 de 1 a 1,5 a 30 graus Celsius em um meio de crescimento não fermentável. Centrifugue as células a 3000 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e lave o pellet com água bidestilada, centrifugando novamente.
Após descartar o sobrenadante, pese o pellet celular. Normalmente, cerca de 0,6 gramas são obtidos a partir de 100 mililitros de células. Resuspenda o pellet em um mililitro de tampão DTT por 0,5 gramas de células.
É importante tratar as células com um agente redutor para quebrar as ligações dissulfeto na parede celular, melhorando assim a hidrólise; incubar as células por 10 minutos a 30 graus Celsius com agitação suave. Em seguida, centrifugar as células a 3000 ×g por cinco minutos à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet.
Em um mililitro de tampão xmal liase por 0,15 gramas de células, não agite em vórtex. Meça a DO 600 de uma alíquota de 10 microlitros das células em 990 microlitros de água e registre este valor. Adicione xmal liase recém-preparada às células para hidrolisar polímeros de glicose nas ligações beta um três glucana e gerar esferoplastos.
A partir daqui, os esferoplastos devem ser mantidos em uma solução isotônica para evitar lise; incubar as células por 15 minutos a 30 graus Celsius com agitação suave. Para verificar a hidrólise da parede celular e a formação de esferoplastos, misture 10 microlitros das células com 990 microlitros de água e meça a DO 600. Os esferoplastos devem sofrer lise devido à diferença osmótica, e a DO 600 deverá ser pelo menos dez vezes menor do que o valor determinado antes da adição de xmal liase. Caso contrário, continue a incubação com xmal liase por mais 15 minutos.
Re-suspendir o PHE do Plast com 100 mililitros de meio de recuperação e transferir a esfera de plast para um frasco de Helen Meyer. Incubar por uma hora a 30 graus Celsius com agitação. Esta etapa de recuperação é necessária porque a tradução é interrompida e a localização do mRNA é perturbada durante o tratamento com XYs.
Após uma hora, adicione 0,1 miligramas por mililitro de cyclo heide e transfira o Sphero plast para tubos cónicos de 50 mililitros previamente resfriados. A adição de cyclo heide é importante para congelar a associação dos ribossomos com os RNAm. Assim, a associação do RNAm dependente de ribossomos com as mitocôndrias é mantida.
Centrifugue a esfera de plass a 3000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave duas vezes com manitol frio. Reutilize o tampão.
Suspenda a esfera de plass com quatro mililitros de tampão de manitol frio e transfira a suspensão para um homogeneizador tipo doun, com capacidade de 15 mililitros, equipado com pistilo bem ajustado. Quebre suavemente a esfera de plass com 15 movimentos e transfira o lisado para um tubo de 13 mililitros. Centrifugue o lisado a 1.500 ×g durante seis minutos a quatro graus Celsius.
Para pelotizar os núcleos e células intactas. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo. Reserve um mililitro ou 25% da amostra como amostra não fracionada ou total.
Transfira 50 microlitros desta amostra para um novo tubo e adicione 15 microlitros de quatro XLSB. Para análise sanguínea pelo método western, o RNA será precipitado do restante da amostra total para análises northern e de microarranjo. Centrifugue o sobrenadante a 10.000 vezes.
Centrifugue por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para obter o pellet de mitocôndrias, transfira o sobrenadante para um novo tubo e mantenha-o em gelo. Esta é a fração citosólica.
Transfira 50 microlitros desta amostra para um novo tubo e adicione 15 microlitros de quatro XLSB. Para análise por western blot, o RNA será precipitado do restante da amostra citosólica para análises por northern e microarranjo. Lave o pellet com três mililitros de manitol, tamponado, e centrifugue novamente a 10.000 vezes.
Centrifugar por 10 minutos a quatro graus Celsius. Suspender novamente o pellet com três mililitros de tampão de manitol. Esta amostra contém as mitocôndrias e é denominada fração mitocondrial.
Transfira 50 microlitros desta amostra para um novo tubo e adicione 15 microlitros de quatro XLSB para análise de Western blot. Para iniciar este procedimento, adicione a cada amostra um volume de oito molar guad dium, HCEL e dois volumes de etanol 100%, vórtex e incube por pelo menos duas horas a menos 20 graus Celsius. Centrifugue as amostras a 10.000 vezes a gravidade por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante. Tenha cuidado, pois o pellet pode ser instável. Após lavar o pellet com etanol 70%, suspenda o pellet com 400 microlitros de água livre de RNAses e transfira a amostra para um novo tubo eppendorf.
Precipite o RNA novamente adicionando 0,1 volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e dois volumes de etanol a 100%, vórtex e incube por pelo menos duas horas a menos 20 graus Celsius. Centrifugue as amostras a 20.000 vezes a gravidade por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e lave com etanol 70%. Seque o pellet ao ar e ressuspenda com água livre de RNAses. Armazene as amostras de RNA a menos 80 graus Celsius.
As amostras podem subsequentemente ser usadas para análises de northern blot ou microarranjo. Para preparar o RNA para análise de microarranjo, primeiro ressuspenda cada pellet de mRNA obtido pela precipitação com guanidina HCl e etanol em 650 microlitros de água livre de RNAses e transfira para um tubo com tampa de rosca. Em seguida, adicione 650 microlitros de fenol ácido-clorofórmio e vortexe vigorosamente; centrifugue em velocidade máxima por dois minutos.
Transfira 500 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo. Evite coletar a interfase, pois ela contém DNA. Além disso, tenha cuidado para não coletar fenol, que pode inibir a reação de transcrição reversa.
Remova a heparina da amostra de RNA por precipitação com cloreto de lítio. Adicione cloreto de lítio até uma concentração final de dois molar e incube as amostras durante a noite a menos 20 graus Celsius no dia seguinte. Descongele as amostras a quatro graus Celsius e centrifugue a 20.000 vezes.
Centrifugar por 20 minutos a quatro graus Celsius. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o pellet com etanol a 80%, centrifugando novamente. Descartar o sobrenadante, secar ao ar e ressuspender o pellet em 150 microlitros de água livre de RNAses. Precipitar novamente com 0,1 volume de acetato de sódio três molar, pH 5,3, e três volumes de etanol a 100%, incubando a menos 20 graus Celsius por pelo menos duas horas.
Centrifugue em velocidade máxima por 20 minutos a quatro graus Celsius. Lave cuidadosamente o pellet transparente com etanol 80% e seque ao ar. Por fim, ressuspenda o pellet com 25 microlitros de água livre de RNAses e mantenha as amostras a menos 80 graus Celsius.
O sucesso deste protocolo na separação de uma fração contendo mitocôndrias de componentes citosólicos é melhor testado mediante análise northern e análise western em amostras provenientes das diferentes etapas de isolamento. Neste exemplo, as amostras foram obtidas antes da fracionamento ou da fração total, da fração citosólica e da fração mitocondrial. A análise northern foi realizada para os seguintes RNAm, COB e um RNA.
Isso é transcrito dentro das mitocôndrias, um CO1 e um mRNA que codifica uma proteína que é importada para as mitocôndrias. Um CT1, um mRNA que codifica a proteína de actina citosólica e SEC61, um mRNA que codifica uma proteína residente do retículo endoplasmático. O painel inferior mostra uma coloração com azul de metileno da membrana norther, onde duas bandas proeminentes de RNA, 25S e 18S, são detectadas.
Como o COB é transcrito dentro das mitocôndrias, seu sinal deve estar exclusivamente nas mitocôndrias, conforme observado neste estudo. A presença de COB na fração citosólica indicará lise mitocondrial durante o preparo.
ACO um codifica uma proteína que é importada para as mitocôndrias e aparece principalmente na fração mitocondrial. CT um codifica uma proteína citosólica e, portanto, aparece principalmente na fração citosólica. A presença de SEC 61 na fração mitocondrial indica a presença de componentes do retículo endoplasmático nessa fração.
Os sinais dos RNAs aparecem em ambas as frações, indicando a presença de ribossomos. Foi realizada análise western para as seguintes proteínas: POR1 mitocôndria, proteína da membrana externa HXK1, proteína citosólica CUE1 e proteína do retículo endoplasmático RPL39. Uma proteína ribossomal, conforme esperado, o sinal de POR1 foi detectado apenas na fração mitocondrial.
Se um sinal de POR fosse detectado na fração citosólica, isso sugeriria dissociação de componentes mitocondriais durante o preparo. Além disso, como esperado, hx K um foi detectado apenas na fração citosólica. O forte sinal de CUE um na fração mitocondrial indica que quantidades significativas de material relacionado ao retículo endoplasmático são coisoladas na fração mitocondrial.
Isso pode ser um resultado dos contatos físicos conhecidos entre o retículo endoplasmático e as mitocôndrias. O sinal de RPL39 aparece em ambas as frações, novamente, confirmando a presença de ribossomos em ambas as frações; a exclusão da etapa de recuperação do procedimento resulta no desaparecimento de ribossomos da fração M, o que afetará a associação de mRNA com mitocôndrias. Além de verificar a qualidade da separação entre componentes mitocondriais e citosólicos, é importante confirmar que o RNA ou as proteínas nas amostras estão intactos e que não há perdas severas de RNA ou proteínas durante o preparo das amostras.
RNA e proteínas intactas devem ser detectadas como bandas distintas nas análises, conforme mostrado aqui. Para o mRNA do cCCP, que codifica uma proteína importada para as mitocôndrias, o aparecimento de bandas adicionais mais curtas ou manchas indicará degradação. Perdas severas resultarão em uma diferença significativa entre a quantidade total e a quantidade relativa do sinal, o que não foi observado, considerado em conjunto.
Esses resultados validam este protocolo como um método eficaz para o isolamento de RNAm, ribossomos e proteínas em um único procedimento. Após este procedimento, podem ser realizados métodos em nível de genoma inteiro, como RNA-Seq ou análise proteômica, com o objetivo de identificar características principais e únicas das funções organelares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar RNA associado a mitocôndrias.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para isolar mitocôndrias associadas a RNAs mensageiros em tradução em levedura. O método envolve a coleta de células de levedura, sua lise e a separação de mitocôndrias dos componentes solúveis por meio de centrifugação diferencial.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
- Neurociência
Antecedentes
- As mitocôndrias desempenham um papel crucial no metabolismo celular.
- A tradução localizada de RNAs mensageiros é importante para a função mitocondrial.
- Compreender a localização dos RNAs mensageiros pode revelar informações sobre os processos celulares.
- O levedo atua como organismo modelo para o estudo da biologia mitocondrial.
Objetivo do Estudo
- Isolar mitocôndrias juntamente com seus RNAs mensageiros e ribossomos associados.
- Investigar os mecanismos de localização de RNAs mensageiros próximos às mitocôndrias.
- Fornecer um protocolo aplicável sob diversas condições de crescimento.
Métodos Utilizados
- Coleta de células de levedura cultivadas em condições que enriquecem mitocôndrias.
- Lise suave das células na presença de cicloheximida.
- Centrifugação diferencial para separar mitocôndrias de componentes solúveis.
- Extração de RNA de mitocôndrias e amostras controle.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de mitocôndrias associadas a RNAs mensageiros em tradução.
- Demonstração da pureza e qualidade do RNA isolado por meio de análise northern.
- Informações sobre a localização de RNAs mensageiros em relação à função mitocondrial.
- Aplicações potenciais do protocolo em diversas condições experimentais.
Conclusões
- O método descrito isola efetivamente mitocôndrias e RNAs mensageiros associados.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão dos mecanismos de tradução localizada.
- Estudos futuros podem se basear neste protocolo para explorar mais a fundo a biologia mitocondrial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que pesquisadores da indústria biofarmacêutica isolinem RNAs mensageiros e ribossomos associados a mitocôndrias em leveduras, apoiando estudos mecanicistas da tradução localizada relevante à importação de proteínas mitocondriais. Ao preservar as interações nativas entre RNA e proteína por meio do tratamento com cicloheximida e centrifugação diferencial, o método fornece um sistema confiável para reduzir riscos em hipóteses sobre expressão gênica específica de organelas. A abordagem oferece valor preditivo para a validação de alvos na biologia mitocondrial e permite o perfilhamento transcriptômico ou proteômico em larga escala para identificar elementos regulatórios que influenciam a produção de proteínas terapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar a localização de mRNA com a eficiência da importação mitocondrial e o rendimento funcional de proteínas.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da avaliação direta das associações entre ribossomos, mRNA e mitocôndrias em condições próximas às nativas.
- Valor Preditivo: Apoia a seleção de projetos ao identificar características do mRNA que se correlacionam com localização mitocondrial bem-sucedida e menor risco de expressão ectópica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara frações mitocondriais validadas para triagem downstream por RNA-seq ou microarranjo, a fim de identificar sinais de localização e fatores *trans*-ativos.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio do isolamento em um único passo de RNAm, ribossomos e proteínas, melhorando a reprodutibilidade entre ensaios.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma para análise comparativa sob diferentes condições genéticas ou ambientais, apoiando a progressão de alvos iniciais a alvos líderes em programas de alvos mitocondriais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta dados de localização de mRNA da fase de descoberta à validação pré-clínica, permitindo o isolamento consistente de transcritos associados às mitocôndrias em diferentes sistemas modelo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Concentra-se na redução preditiva de riscos de alvos envolvidos na biogênese mitocondrial mediante a confirmação do co-isolamento de componentes do retículo endoplasmático e mitocondriais, contribuindo para avaliações de especificidade.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de biomarcadores traducionais por meio da validação por northern blot da distribuição de mRNA mitocondrial versus citosólica, auxiliando na clarificação do mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial do descobrimento, apoiando a verificação de hipóteses na validação de alvos e permitindo leituras omicas escalonáveis que orientam a identificação de compostos líderes e a tomada de decisões pré-clínicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de RNAs mensageiros associados a mitocôndrias para testar mecanismos de tradução localizada e regulação específica de organelas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de análise quantitativa por northern blot ou microarranjo do RNA isolado, fornecendo leituras reprodutíveis para comparar a localização de mRNA em diferentes condições.
- Análises: Gera saídas mensuráveis, como razões de enriquecimento de RNA e métricas de pureza da fracionamento, permitindo que as equipes comparem condições e avaliem a consistência técnica.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer um método padronizado para isolar material associado a mitocôndrias para validação funcional subsequente em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Posiciona o protocolo como uma capacidade de plataforma reutilizável, e não como uma técnica de uso único, apoiando a padronização entre projetos em programas de biologia mitocondrial.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da observação direta da co-localização de mRNA-mitocôndria-ribossomo, reduzindo a ambiguidade mecanicista na expressão gênica mitocondrial.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de um único procedimento que isola múltiplas classes de macromoléculas, minimizando a variabilidade do fluxo de trabalho.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar ou não ao permitir a avaliação precoce da eficiência de direcionamento mitocondrial, reduzindo o risco de falha em estágios avançados do desenvolvimento de terapias proteicas.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados de localização de mRNA, apoiando o avanço eficiente em termos de capital de alvos com fortes evidências de associação mitocondrial.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células de levedura, isolamento de organelas e manipulação de RNA para manter a integridade da amostra durante todo o procedimento.
- Depende do acesso a equipamentos de centrifugação diferencial e ambientes livres de RNase para recuperação confiável de mitocôndrias e RNA.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de lise e fracionamento para garantir resultados consistentes entre laboratórios ou projetos.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a sistemas não pertencentes a leveduras, uma vez que os passos relacionados à integridade da parede celular e da membrana são específicos do organismo.
- As limitações práticas incluem a possível co-isolação de material derivado do retículo endoplasmático devido aos sítios de contato entre membranas conhecidos, o que deve ser levado em conta na interpretação dos dados.
