Name: A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a impressão submersa de células em superfícies modificadas usando um microspotter de fluxo contínuo. Este método permite triagem de fármacos e avaliação de citotoxicidade com alta precisão em microambientes controlados.

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Os autores gostariam de agradecer Chris Morrow para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo NIH SBIR (R43) conceder 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Célula Preparação Cultura <ol><li> Guarde os estoques celulares NIH/3T3 em nitrogênio líquido até que esteja pronto para uso. </li><li> Preparar meio completo para células NIH/3T3 utilizando Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Descongelar as células para 2-3 min num banho de água com agitação a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de meio completo e centrifugar a 1500 g durante 3 min. </li><li> Retirar o sobrenadante celular, sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro. <ol><li> Retirar 10 mL da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Adicionar 10 ul de azul de tripano para a suspensão de células e agitar com a ponta da pipeta. </li><li> Pipetar 10 ul de células coradas para uma câmara de hemocitómetro. </li><li> Contagem de células em hemocitómetro na 10xampliação. <ol><li> Contar as células vivas (bolas pequenas, brancas) para 4 dos 9 grandes praças. Só contar as células vivas que não aparecem azul escuro da mancha Trypan Blue. </li><li> Calcula-se a média do número de células por quadrado grande, resultando em o número de células de 4 x 10 células / ml na suspensão inicial de células. </li><li> Células de sementeira a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml, com um total de 5 mL em cada frasco T25. </li></ol></li><li> Células de cultura para entre 70% e 80% de confluência antes dos experimentos iniciais. Atualizar mídia a cada 2-3 dias ou quando necessário. </li></ol></li></ol> 2. Printing Preparação da Superfície <ol><li> Mark um rectângulo com marcador na parte inferior de uma tratados com cultura de tecidos de poliestireno (TCTPS) placa de 12 poços do tamanho da cabeça de impressão (7 mm × 19 mm). </li><li> Pipetar 50 mL de soro fetal bovino para a área retangular e espalhe-o sobre toda a região com a ponta. </li><li> Deixe a placa de Petrinum estéril biossegurança capuz O / N para permitir que o ponto de soro para secar completamente. Estas placas devem ser preparado não mais do que dois dias antes da utilização. </li></ol> 3. Impressão Submerso <ol><li> Lavar a cabeça de impressão com água destilada. <ol><li> Encha uma 60 milímetros placa de Petri com água destilada e encaixar a cabeça de impressão para a superfície. </li><li> Fluxo de água destilada através de cada uma das linhas de 2 min a 150 mL / min usando uma bomba pneumática. </li><li> Descarte a água da placa de Petri e encha-o com água limpa. </li><li> Mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes. </li></ol></li><li> Encaixe o centro da cabeça de impressão sobre o local revestido de soro na pré-preparados placa de 12 poços. </li><li> Primeiro a cabeça de impressão com a mídia completas pré-aquecido, a 300 mL por canal. </li><li> Imprimir células suspensas a uma concentração de 50.000 células / mL sobre a superfície e 60 mL / min, 100 ul por canal. </li><li> Coloque a cabeça de impressão, deixou ancorado contra osuperfície, e o colector, num incubador de cultura de células definido para 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Após a incubação de 2 horas, remover a cabeça de impressão e colocar a tampa no prato de cultura. O momento em que a cabeça de impressão removido é considerado o ponto de tempo 0 h. </li></ol> 4. Cultura de Células Padrão <ol><li> Adicionar 1 ml de meio pré-aquecido a uma das TCTPS de 12 poços da placa de soro-manchado, preparado no passo 2. </li><li> Tomar 1 ml da suspensão de células remanescente a partir do passo 2 e da pipeta num único poço de um de 12 poços TCTPS placa. Isto vai produzir uma cultura contendo 50.000 células no recipiente. </li><li> Colocar a placa de cultura de células dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Após a incubação de 2 horas iniciar a temporização,; para a consistência entre as amostras impressas e semeadura, este é considerado o ponto de tempo 0 h. </li></ol> 5. Visualization Cultura <ol><li> Depois de 0, 2, 24, e 48 horas as células tomada de cada um dos dois métodos described acima e imagem usando um microscópio invertido padrão. <ol><li> Corar as células com iodeto de propídio, um corante vermelho fluorescente que apenas é incorporado no núcleo de células mortas. <ol><li> Lave as células 3 vezes com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS + +) para remover todos os detritos. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido PBS + + para cada recipiente de cultura. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de estoque de iodeto de propídio (1 mg / ml) a cada recipiente de cultura. </li><li> Incubar as células coradas com iodeto de propídio a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Imagem as células usando um microscópio invertido em 10x e 40x. </li></ol></li><li> Descarte as pilhas em um recipiente apropriado de risco biológico. </li></ol>

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</ol>

Os autores são funcionários e acionistas de Wasatch microfluídica que produz reagentes e / ou instrumentos utilizados neste manuscrito.

A tecnologia de impressão 3D microfluídicos aqui descrito é o único capaz de matrizes de impressão microfluidically de células em um líquido bem cheio, ou seja, uma superfície submersa. Ao imprimir sobre as superfícies submersas, microarrays de célula pode ser produzida que manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante das células, bem como a capacidade para multiplexar as células no fundo de um único poço Figura 4. Os resultados deste estudo mostram que microfluidically impressão result...

Os recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um interesse crescente no uso de microarranjos de celulares no processo de descoberta de medicamentos para a triagem de drogas e cytotoxicological 1,2,3 análise. O desenvolvimento de ensaios in vitro de alto rendimento e métodos de rastreio utilizando microarrays de células facilitaria o desenvolvimento rápido e de baixo custo de candidatos da droga, bem como avanço a compreensão fundamental da célula 1,4. A abordagem tradicional de triagem com células usa plataformas bem-placa convencionais; No entanto, esta abordagem é limitada devido ao custo elevado, o rendimento limitado, e uma capacidade limitada para fornecer informação quantitativa sobre a função das células de 1,5. Devido a essas limitações, a pesquisa em tecnologias de microarray celular é crescente para a caracterização molecular biológica, engenharia de tecidos, e droga triagem 1,6. As vantagens de microarrays celulares incluem o uso de amostra menor, efeitos mínimos deheterogeneidade fenótipo celular mascarando informações, eo mais importante a capacidade de automatizar ensaios para mais aplicações de alto rendimento 1,7,8. A indústria farmacêutica utiliza atualmente de alto rendimento à base de células testes de rastreio com 2D culturas em monocamada de células para triagem de drogas em locais bem microplacas 9. Células de multiplexagem em poços de placas de microtitulação oferece o potencial para um maior rendimento com opções de experimentação originais. Além disso, as actuais tecnologias de micromatrizes celulares permitem que as células para secar o que poderia alterar dramaticamente o fenótipo das células in vivo a partir de 10,11. A fim de superar estes problemas, o MFCA foi concebido e é mostrado na Figura 1. O design dos fluidos MFCA 3D permite que a ponta da cabeça de impressão da Figura 1 a ser baixada para dentro de um banho e comprimida contra a superfície de modo a formar uma vedação. A ponta de silicone macio da cabeça de impressão se comporta como umjunta e forma uma vedação reversível. A tecnologia MFCA é adequada exclusivamente para fazer a interface com superfícies submersas, que é necessário para ambas as culturas de células e sistemas fatia do tecido, e é difícil ou impossível com a maioria das outras abordagens. Pinos ou impressão a jato de tinta não vai funcionar, e dispositivos microfluídicos 2D não são adequados para a deposição ou interface com grandes conjuntos de pontos discretos. Além disso, ao miniaturizar e localizando o experimento - microarray celular - o MFCA supera os principais problemas associados com a de alto rendimento à base de células de ensaios de rastreio. O CFM utiliza redes de canais 3D para ciclo de pequenas amostras de fluido de volume mais localizações pontuais microscópicas em uma superfície de 12,13. Ao imprimir com fluxo, biomoléculas, as células e os outros reagentes são mantidos em meio líquido durante todo o processo de impressão, permitindo a impressão de biomoléculas sensíveis e células, sem exposição ao ar, o que dificulta as técnicas de impressão de células actuais. É também possível imprimir directamente a partir de material em bruto, tais como sobrenadantes de hibridoma, ou, desde que exista um mecanismo de captura na superfície da matriz. O objetivo deste artigo é explicar em detalhes a impressão submersa de dois tipos de células em uma superfície.

<table><tbody><tr><td>Microspotter de fluxo contínuo</td><td>Wasatch Microfluídica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado da Dubbleco</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Meio de base para células</td></tr><tr><td>Tampão HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Aditivo de mídia celular (pH de controle)</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Aditivo de mídia celular</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Aditivo de mídia celular</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Célula de coloração para contagem</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Câmara celular para contagem de células</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Usado para verificar células</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Usado para coletar imagens</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (com cálcio e magnésio)</td> <td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Enxágue as células antes da passagem e antes da coloração com PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Usado para remover células da superfície</td></tr></tbody></table>

a impressão submerso de células em uma superfície modificada usando um contínuo fluxo microspotter

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

A impressão de células para aplicações de microarray possui desafios significativos, incluindo o problema de manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante após a impressão, má organização e distribuição das células desejadas e a incapacidade de fornecer medicamentos e/ou nutrientes para áreas-alvo na matriz. Nossa tecnologia de impressão microfluídica 3D é capaz de selar e imprimir matrizes de células em superfícies submersas de maneira automatizada e multiplexada. O design dos fluidos 3D da matriz de células microfluídicas (MFCA) permite que a ponta do cabeçote de impressão seja abaixada em um poço ou prato cheio de líquido e comprimida contra uma superfície para formar uma vedação. A ponta de silicone macia do cabeçote de impressão se comporta como uma junta e é capaz de formar uma vedação reversível aplicando pressão ou recuando. Outras tecnologias de impressão de células, como impressoras de pinos ou jato de tinta, não conseguem imprimir em aplicações submersas. A impressão de superfície submersa é essencial para manter os fenótipos das células e monitorar essas células em uma superfície sem perturbar as características da superfície do material. Ao imprimir em superfícies submersas, são produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em uma infinidade de áreas, incluindo câncer, diabetes, inflamação, infecções e doenças cardiovasculares.

As células NIH/3T3 de linha de células de fibroblastos foram semeados em impressos ou uma superfície submersa. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 X 10 4 culas por ml. As células foram semeadas utilizando técnicas de cultura de células tradicional. As células foram impressas utilizando uma grande formato, doze fluxo cabeçote célula, onde os canais são maiores (~ 500 mm) do que a utilizada para CFM proteínas e outras biomoléculas. As células foram semeadas ou impresso sobre uma superfície revestid...

Esta tecnologia de impressão microfluídica 3D imprime matrizes de células em superfícies submersas. Descrevemos como as matrizes de células são entregues microfluidicamente em células de fluxo 3D em superfícies submersas. Ao imprimir em superfícies submersas, foram produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em várias áreas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

O objetivo geral deste procedimento é imprimir fibroblastos T3 em uma superfície revestida com soro. Isso é realizado primeiramente por meio da adsorção prévia de soro sobre uma superfície de cultura de tecidos. O segundo passo consiste em imprimir uma suspensão de fibroblastos sobre a superfície utilizando um microdispensador de fluxo contínuo, seguido pela incubação das células a 37 graus Celsius por duas horas.Em seguida, as células impressas, bem como as células semeadas por meio de cultura celular padrão, são coradas com iodeto de propídio e visualizadas em microscópio invertido para comparação. Por fim, a microscopia de fluorescência é utilizada para avaliar a viabilidade, densidade e morfologia celulares em pontos temporais relevantes. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a impressão por pinos, é que a cabeça de impressão forma um selo sobre a superfície, permitindo que as células sejam impressas enquanto submersas em meio celular.Embora a impressão submersa de células seja útil para triagem de novos candidatos a fármacos quanto à segurança e eficácia, a impressão submersa em geral também é útil para outras aplicações. Por exemplo, podemos analisar novos candidatos a fármacos em fatias de tecido, ou podemos utilizá-la como modelo para sistemas de órgãos. Por exemplo, um modelo de perfusão hepática.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque, durante a escorva da impressora e a impressão celular, o ar não pode entrar nas linhas, pois isso pode causar morte celular. Para iniciar, descongele células NIH 3T3 por dois a três minutos em banho-maria agitado a 37 graus Celsius. Re-suspenda as células em cinco mililitros de meio completo e centrifugue a 1500 ×g por três minutos.Remova o sobrenadante celular sem perturbar o pellet celular. Em seguida, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio e transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. A seguir, adicione 10 microlitros de triptazol azul à suspensão celular e misture com a ponta da pipeta; pipete 10 microlitros das células coradas para uma câmara de hemocitômetro.Antes de contar as células em 10 x de aumento, conte as células viáveis que se assemelham a pequenas bolas brancas em quatro dos nove quadrados grandes. Conte apenas as células viáveis que não apresentam coloração azul-escura proveniente da coloração com trippen blue. Calcule o número médio de células por quadrado grande, resultando no número de células multiplicado por 10.000 células por mililitro na suspensão celular original.Em seguida, semeie as células numa densidade de 100.000 células por mililitro, com um total de cinco mililitros em cada frasco T25. Incube as células até atingirem um confluência entre 70 e 80% antes de iniciar os experimentos. Para preparar a superfície de impressão, use uma caneta para marcar um retângulo do tamanho da cabeça de impressão na base de uma placa de poliestireno tratada para cultura de tecidos 12.Pipete 50 microlitros de soro bovino fetal na placa de poços na área retangular e espalhe por toda a região. Com a ponta, deixe a placa de poços em uma capela de biossegurança estéril durante a noite para permitir que a mancha de soro seque completamente. Para iniciar a impressão submersa, enxágue a cabeça de impressão com água destilada.Em seguida, preencha uma placa de Petri de 60 milímetros com água destilada e acople a cabeça de impressão na superfície, fazendo a água destilada fluir por cada uma das linhas durante dois minutos a 150 microlitros por minuto, utilizando uma bomba pneumática. Depois, descarte a água da placa de Petri e preencha-a com água limpa. A seguir, mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes.Posicione o centro da cabeça de impressão sobre o ponto revestido com soro na placa de 12 poços previamente preparada. Em seguida, prepare a cabeça de impressão com meio completo aquecido previamente, utilizando 300 microlitros por canal.Se forem realizadas múltiplas impressões, adicione uma lavagem com hipoclorito além da lavagem com água entre as impressões. Prossiga com a impressão das células suspensas numa concentração de 50.000 células por mililitro sobre a superfície, a uma taxa de 60 microlitros por minuto. 100 microlitros por canal.Após a impressão celular, posicione a cabeça de impressão à esquerda, encaixada contra a superfície, e coloque o manifold em uma incubadora de cultura celular. Ajuste para 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação de duas horas, remova a cabeça de impressão e coloque a tampa sobre a placa de cultura.O momento em que a cabeça de impressão é removida é considerado o ponto de tempo zero. Para comparação, também é realizada uma cultura celular padrão. Adicione um mililitro de meio pré-aquecido a uma das placas de 12 poços com soro, em seguida, retire um mililitro da suspensão celular restante e pipete-o para um único poço da placa de 12 poços.Isso produzirá um cultivo contendo 50.000 células na placa. Coloque a placa de cultivo celular em uma incubadora a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação de duas horas, inicie a contagem do tempo para garantir consistência entre as amostras impressas e as amostras semeadas.Este é considerado o ponto de tempo zero. Após 0, 2, 24 e 48 horas, prepare as células de cada um dos dois métodos para imagem, corando com iodeto de propídio, que é incorporado apenas no núcleo de células mortas. Primeiro, lave suavemente as células três vezes com um mililitro de solução salina tamponada com fosfato contendo cálcio e magnésio para remover qualquer debris.Em seguida, adicione um mililitro do meio de cultura pré-aquecido a cada vaso de cultura e, depois, um microlitro de iodeto de propídio. Incube a solução estoque das células coradas com iodeto de propídio a 37 graus Celsius por 10 minutos antes de imaginar as células utilizando um microscópio invertido com ampliação de 10 x e 40 x. Por fim, descarte as células em um recipiente apropriado para resíduos biológicos perigosos.A linhagem celular de fibroblastos, células NIH 3T3, foi impressa ou semada sobre uma superfície submersa. Após a impressão e semeadura, as células foram visualizadas para avaliar a densidade e a morfologia nos pontos temporais relevantes. As imagens mostraram que as células possuem fenótipos quase idênticos em cada ponto temporal e em cada aumento. Com base nestes dados, determinou-se que a impressão efetiva foi mínima. A viabilidade celular foi avaliada utilizando uma coloração com iodeto de propídio e revelou que a viabilidade das células impressas não diferiu significativamente daquelas não impressas em cada ponto temporal. A principal diferença entre os dois métodos de fixação das células à superfície é a densidade das células.A densidade celular impressa diminui em mais de 50% no ponto temporal de duas horas, tanto nas células semeadas quanto nas impressas. Estudos adicionais são necessários para determinar a causa dessa redução. No entanto, as proporções gerais de densidade impressa, quando comparadas às semeadas, permanecem significativamente mais altas.A densidade de células impressas na câmara de fluxo era aproximadamente 10 vezes maior em cada ponto temporal em comparação com as células semeadas, considerando que as células foram impressas na mesma densidade de semeadura, mas em uma área menor. No ponto temporal final, as células apresentam a mesma densidade, o que provavelmente se deve à motilidade celular e às limitações de consumo de recursos. Desde seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de descoberta de fármacos estudarem os efeitos da toxicidade e eficácia de medicamentos sobre células e em doenças como câncer, doenças cardíacas e outros campos de alta demanda.Ao utilizar a impressão de células submersas em conjunto com outras tecnologias, como aderência e adesão celular programável, podemos ampliar o alcance dessa técnica para células em suspensão, a fim de aprimorar a triagem na descoberta e desenvolvimento de fármacos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão sólida de como imprimir células utilizando nossa técnica de impressão submersa.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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