A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

O objetivo geral deste procedimento é imprimir três fibroblastos T três em uma superfície revestida de soro. Isso é feito primeiro pré-adsorvendo o soro em uma superfície de cultura de tecido. O segundo passo é imprimir uma suspensão de fibroblastos na superfície usando um micro observador de fluxo contínuo, seguido de incubação das células a 37 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, as células impressas, bem como as células semeadas por meio de cultura de células padrão, são coradas com iodeto de propídio e visualizadas em microscópio invertido para comparação. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para avaliar a viabilidade, densidade e morfologia celular em pontos de tempo relevantes. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a impressão de pinos, é que o cabeçote de impressão forma uma vedação sobre a superfície, permitindo que as células sejam impressas enquanto submersas na mídia celular.

Embora a impressão submersa de células seja útil para a triagem de novos candidatos a medicamentos quanto à segurança e eficácia, a impressão submersa em geral também é útil para outras aplicações. Por exemplo, podemos analisar novos candidatos a medicamentos contra fatias de tecido ou podemos usá-lo como modelo para sistemas de órgãos. Por exemplo, um modelo de profusão hepática.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque, durante a preparação da impressora e a impressão das células, o ar não pode entrar nas linhas ou pode causar a morte celular. Para começar a descongelar NIH três células T três por dois a três minutos em banho-maria agitado a 37 graus Celsius. Suspender novamente as células em cinco mililitros de meio completo e centrifugar a 1500 Gs durante três minutos.

Remova o sobrenadante da célula sem perturbar o pellet da célula. Em seguida, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio e transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Em seguida, adicione 10 microlitros de azul triam à suspensão celular e mexa com a ponta da pipeta 10 microlitros das células coradas em uma câmara de hemocitômetro.

Antes de contar as células com ampliação de 10x, conte as células vivas que se assemelham a pequenas bolas brancas para quatro dos nove quadrados grandes. Conte apenas as células vivas que não aparecem em azul escuro da mancha azul trippen. Calcule o número médio de células por quadrado grande, resultando no número de células vezes 10.000 células por mililitro na suspensão celular original.

Em seguida, semeie células a uma densidade de 100.000 células por mililitro com um total de cinco mililitros em cada frasco T 25. Cultive as células entre 70 e 80% de fluência antes de iniciar os experimentos. Para preparar a superfície de impressão, use um marcador para marcar um retângulo do tamanho da cabeça de impressão na parte inferior de uma cultura de tecidos tratada com poliestireno 12.

Poço pipeta 50 microlitros de soro fetal bovino na área retangular e espalhe por toda a região. Com a ponta, deixe a placa de poço em uma capa de biossegurança estéril durante a noite para permitir que a mancha de soro seque completamente. Para iniciar a impressão submersa, enxágue o cabeçote de impressão com água destilada.

Em seguida, encha uma placa de Petri de 60 milímetros com água destilada e encaixe a cabeça de impressão na superfície da água destilada de fluxo através de cada uma das linhas por dois minutos a 150 microlitros por minuto usando uma bomba pneumática. Em seguida, descarte a água da placa de Petri e encha-a com água limpa. Em seguida, mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes.

Encaixe o centro da cabeça de impressão sobre o ponto revestido de soro na placa pré-preparada de 12 poços. Em seguida, prepare a cabeça de impressão com Pré-aquecimento. Mídia completa a 300 microlitros por canal.

Se estiver realizando várias impressões, adicione um enxágue com alvejante além do enxágue com água entre as impressões. Prossiga para imprimir as células suspensas a uma concentração de 50.000 células por mililitro na superfície e a 60 microlitros por minuto. 100 microlitros por canal.

Após a impressão da célula, coloque a cabeça de impressão encaixada à esquerda na superfície e o coletor em uma incubadora de cultura de células. Defina para 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por duas horas. Após as duas horas de incubação, remova a cabeça de impressão e coloque a tampa no prato de cultura.

O tempo em que a cabeça de impressão é removida é considerado o ponto de tempo de zero hora. Para comparação, a cultura de células padrão também é realizada. Adicione um mililitro de meio pré-aquecido a uma das placas de 12 poços manchadas de soro, depois pegue um mililitro da suspensão celular restante e pipete-o em um único poço da placa de 12 poços.

Isso produzirá uma cultura contendo 50.000 células no prato. Coloque a placa de cultura de células em uma incubadora a 37 graus Celsius por duas horas. Após as duas horas de incubação, comece a cronometrar a consistência entre as amostras impressas e de semeadura.

Este é considerado o ponto de tempo de zero hora. Após 0, 2, 24 e 48 horas, preparar as células de cada um dos dois métodos para a obtenção de imagens por coloração com iodeto de propídio, que só é incorporado no núcleo das células mortas. Primeiro, enxágue suavemente as células três vezes com um mililitro de solução salina inchada com fosfato com cálcio e magnésio para remover quaisquer detritos.

Em seguida, adicione um mililitro do meio de cultura pré-aquecido a cada recipiente de cultura e, em seguida, um microlitro de iodeto de propídio. A solução estoque incuba as células coradas com iodeto de propídio a 37 graus Celsius por 10 minutos antes de obter imagens das células usando um microscópio invertido com ampliação de 10 x e 40 x. Por fim, descarte as células em um recipiente apropriado de risco biológico.

A linhagem celular de fibroblastos, NIH três células T três foram impressas ou semeadas em uma superfície submersa. Após a impressão e semeadura, as células foram visualizadas para avaliar a densidade e a morfologia em pontos de tempo relevantes. As imagens mostraram que as células possuem fenótipos quase idênticos em cada ponto de tempo e em cada ampliação.

Com base nesses números, a impressão efetiva foi determinada como mínima. A viabilidade celular foi avaliada usando uma coloração de iodeto de propídio e revelou que a viabilidade para as células impressas não foi significativamente diferente das células assentadas para cada ponto de tempo. A principal diferença entre os dois métodos de fixação das células à superfície é a densidade das células.

A densidade de células impressas diminui no ponto de tempo de duas horas em mais de 50% em células sentadas e impressas. Mais estudos são necessários para determinar a causa dessa diminuição. No entanto, as taxas gerais de densidade impressa quando comparadas às semeadas permanecem significativamente mais altas.

A densidade de células impressas na célula de fluxo foi aproximadamente 10 vezes mais densa em cada ponto de tempo do que as células semeadas, considerando que as células foram impressas na mesma densidade da semeadura, mas em uma área menor. No ponto final do tempo, as células estão na mesma densidade, o que provavelmente se deve à motilidade celular e às limitações de consumo de recursos. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de descoberta de medicamentos estudarem os efeitos da toxicidade e eficácia dos medicamentos em células e auxiliares do câncer, doenças cardíacas e outros campos de alta demanda.

Ao usar a impressão de células submersas em conjunto com outras tecnologias, como adesão, adesão celular programável, podemos estender o alcance da técnica às células em suspensão para descoberta expandida de medicamentos e triagem de desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão sólida de como imprimir células usando nossa técnica de impressão submersa.