Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG _35-55) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

O objetivo geral deste procedimento é induzir um modelo animal de encefalomielite autoimune experimental que imite as características clínicas e fisiopatológicas da esclerose múltipla. Isso é feito preparando primeiro o antígeno e o adjuvante e a toxina da coqueluche. O segundo passo é injetar o antígeno e a emulsão CFA por via subcutânea e a toxina da coqueluche intraperitoneal.

Dois dias depois, os m são novamente injetados com toxina pertussis intraperitoneal. Em seguida, os animais são pesados e seu escore clínico é avaliado diariamente. Em última análise, os sinais clínicos de autoimune experimental e encefalomielite geralmente podem ser observados entre o nono e o 14º dia após a imunização.

A principal vantagem dessa técnica dos protocolos existentes, que envolvem, por exemplo, agentes tóxicos como rizônio ou diferentes variantes da EIE, é por isso que todos eles imitam características da EM que diferem tremendamente em características patológicas subjacentes, como o envolvimento do sistema imunológico adaptativo. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao difícil manuseio da imunização. É absolutamente necessário reduzir o estresse dos animais e garantir a imunização ideal após o seu desenvolvimento.

Esse modelo abriu caminho para pesquisadores da área de neuroimunologia caracterizarem animais nocauteados. Para identificar novos alvos moleculares de drogas ou para testar candidatos promissores a drogas Para preparar a solução peptídica, comece diluindo o peptídeo MOG 35 a 55 liofilizado em água bidestilada até uma concentração final de dois miligramas por mililitro. São necessários 100 microlitros desta solução por camundongo e algum volume é perdido durante a preparação.

Portanto, faça 1,5 a duas vezes a quantidade de solução necessária. Armazene a solução peptídica a menos 20 graus Celsius para fazer um adjuvante completo ou CFA coloque 100 miligramas de micobactéria desidratada na tuberculose. H 37 RA em um pilão e triture-o com um pilão para obter um pó fino.

Em seguida, adicione 10 mililitros de adjuvante de frons incompleto para obter uma solução de meia CFA de 10 miligramas por mililitro. O estoque de CFA pode ser armazenado a quatro graus Celsius até que seja necessário no dia da imunização. Diluir a solução-mãe de CFA com adjuvante de fres incompleto a uma concentração final de dois miligramas por mililitro bem misturada para ressuspender o material particulado e colocá-lo no gelo.

Depois de descongelar, uma alíquota da solução peptídica MOG 35 a 55. Coloque-o no gelo. Use uma seringa de dois mililitros e uma cânula de calibre 27 para extrair um mililitro do CFA.

Em seguida, use uma segunda seringa de dois mililitros e uma cânula de calibre 20 para extrair um mililitro da solução MOG 35 a 55. Remova todas as bolhas de ar e conecte ambas as seringas com uma válvula de três vias. Com a válvula de três vias quase fechada, empurre a emulsão de uma seringa para a outra e volte a misturar bem por pelo menos 10 minutos.

Quando terminada, a solução deve ser branca, rígida e viscosa, sem separação de fases. Agora deixe a emulsão descansar por pelo menos 30 minutos ou até vários dias antes da imunização Verifique se ainda está emulsionada. No dia da imunização, coloque a solução em uma das duas seringas e conecte uma cânula de calibre 27.

Reconstitua 50 microgramas de toxina da coqueluche em 500 microlitros de água bidestilada Para uma solução estoque de 100 microgramas por mililitro, armazene a solução estoque a quatro graus Celsius até que seja necessário. No dia da imunização, dilua a solução estoque de coqueluche de um a 50.

Com PBS, prepare uma seringa com 200 microlitros da solução diluída de coqueluche para injeção, que contém 400 nanogramas de toxina da coqueluche e retire mais 100 microlitros para o espaço morto do cubo da agulha. Depois de anestesiar um camundongo com iso flúor, avalie o nível de anestesia usando uma pinça no dedo do pé. Injetar 100 microlitros da emulsão CFA do antígeno por via subcutânea em dois locais diferentes em cada flanco posterior.

Após a injeção, uma massa bulbosa deve se formar sob a pele, que deve persistir durante todo o experimento. Em seguida, injete a seringa preparada contendo 200 microlitros de toxina pertussis intraperitoneal. Certifique-se de que os mouses individuais possam ser facilmente identificados para avaliação diária.

Por exemplo, por marcações de cores na base da cauda.