Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

O objetivo geral dos experimentos a seguir é observar a atividade do inflamassoma em células dendríticas humanas in vitro utilizando ensaios simples de detecção de IL-1β. Primeiro, adicione R 8 48 às células para induzir a expressão intracelular de pró-IL-1β. Em seguida, adicione nige para ativar a formação do inflamassoma NLRP3.

Isso, por sua vez, desencadeia a clivagem da pró-IL-1β em IL-1β madura antes da secreção. Em seguida, colete as amostras e meça a pró-IL-1β intracelular e a IL-1β madura extracelular; os resultados são obtidos mediante a quantificação da secreção de IL-1β por células previamente sensibilizadas e ativadas, por meio de imunofluorescência, western blot e ELISA. A detecção demonstra que a sensibilização de DCs humanas resulta na produção intracelular de pró-IL-1β em células sensibilizadas com R848 e na secreção de IL-1β por células sensibilizadas e ativadas com Nigericina e ATP.

Este método pode fornecer informações sobre o papel do inflamassoma NLRP3 na resposta de células dendríticas humanas a ligantes sintéticos. Também pode ser aplicado a outros sistemas projetados para testar estímulos fisiológicos, como bactérias, vírus e doenças autoinflamatórias. Aliquotar 200 microlitros de células dendríticas derivadas de monócitos recém-isoladas em seu estado de repouso em uma placa de fundo redondo com 96 poços.

Inicie com as quatro condições padrão de controle negativo não estimulado, apenas primeamento, apenas ativação e primeamento seguido por ativação. Em seguida, de acordo com o delineamento experimental, inclua controles de diluente para R 8 48 e nissina; para ensaios downstream de coloração intracelular de citocinas, inclua duplicatas para os controles de isotipos para ativar o inflamassoma. ADICIONE R 8 48, adicionando uma concentração final de 10 micromolar às poças apropriadas.

Coloque as células em um incubador a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 18 horas. Em seguida, para ativar o inflamassoma NLRP3, adicione nige em uma concentração final de 20 micromolar. Retorne as culturas ao incubador por mais seis horas para colher as amostras; centrifugue a placa de cultura a 974 ×g por três minutos sem perturbar os pellets celulares.

Transfira cada sobrenadante para uma placa separada de fundo redondo para medir a secreção de citocinas por EISA. Agora, lave os pellets celulares três vezes com 200 microlitros de PBS 1X para remover qualquer IL-1β extracelular das amostras celulares para análises posteriores por diversas técnicas, como detecção por Western blot de pró-IL-1β. Lisar as células diretamente em 10 microlitros de tampão de lise desnaturante. Após transferir os lisados para tubos de 1,5 mililitro, aqueça as amostras por 10 minutos a 100 graus Celsius para detecção fluorescente por citometria de fluxo de IL-1β.

Adicione 100 microlitros de meio com 5% de PHS às amostras celulares e um microlitro de anticorpos marcados com fluoróforo aos marcadores de fenótipo ou controle de isotipo; incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após três lavagens com PBS, fixe as células com 100 microlitros de PFA a 4% por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão permeabilizante por 30 minutos, seguido por 62 nanogramas de anticorpo anti IL-1β conjugado com FSE ou controle de isotipo; incube as amostras por duas horas a 37 graus Celsius.

Lave as células três vezes com 200 microlitros de tampão permeabilizante e ressuspenda em um XPBS. Envolva as amostras com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius. Se for detectar IL-1β por microscopia, marque as células com DAPI, adicione montagem e coloque cuidadosamente uma lamínula sobre uma lâmina de vidro.

Deixe a amostra curar durante a noite antes de capturar imagens de microscopia para detecção fluorescente por citometria de fluxo. Adquira os dados uma amostra por vez. Defina os parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral nas células viáveis. Em seguida, selecione as células positivas para CD11C e negativas para CD14.

Por fim, analise a população de MODC com base na marcação de pró-IL-1β em dados de aquisição de microscopia. Ajuste o tempo de exposição com a amostra tratada com R 8 48, que apresenta marcação positiva. Em seguida, determine a porcentagem de MODCs que expressam pró-IL-1β para detecção por western blot.

Carregue todo o volume da amostra no gel de poliacrilamida. Execute a 140 volts até que a frente do corante saia do gel. Transfira a proteína do gel de poliacrilamida para a membrana FL com A-P-V-D-F imo.

Bloqueie a membrana com BSA 5% em TBST por uma hora. Incube com o anticorpo primário sob agitação a quatro graus Celsius durante a noite. Após três lavagens com TBST de cinco minutos, incube com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora; após mais três lavagens com TBST, image a membrana ao medir citocinas secretadas por ELISA, equilibrando as amostras à temperatura ambiente.

Centrifugar as amostras para consolidar a condensação do sobrenadante e seguir as instruções do fabricante para a medição da citocina intracelular IL-1β. A coloração para pró-IL-1β permite análises por microscopia e leituras de dados em células dendríticas derivadas de monócitos CD11c positivas e CD14 negativas. Ambas as técnicas podem ser quantificadas em relação a um controle de células não ativadas ou em repouso, bem como a um controle de isotipo. A porcentagem de células coradas para pró-IL-1β é multiplicada pela mediana geométrica dessa população para fornecer a intensidade mediana de fluorescência.

O MFI é comparável à quantidade de pró-IL-1β presente nas células com coloração positiva. Aqui, técnicas de imunoblotagem são utilizadas para medir a pró-IL-1β a partir dos lisados celulares. Os dados quantitativos são expressos em relação a um controle celular interno, como a tubulina beta, conforme esperado.

A imunomarcação para pró-IL-1β em células tratadas com NI-Nigericina revela uma diminuição na pró-IL-1β. Isso é acompanhado por um aumento concomitante na IL-1β nos sobrenadantes, medido por ELISA apenas após as condições com NI-Nigericina. A quantificação simultânea de outras citocinas inflamatórias, como TNF-α, IL-10 e IL-6, assegura que a Nigericina seja específica na indução da secreção de IL-1β.

O nível de priming depende do tempo e da dose. Experimentações adicionais, como a medição da concentração de proteínas extracelulares, a detecção de quimioluminescência proveniente da geração da forma madura de IO-1β ou o bloqueio do inflamassoma, ajudariam a determinar se a IO-1β extracelular é a forma clivada madura e se a secreção de IO-1β é dependente da atividade do inflamassoma NLRP3.