Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

O objetivo geral dos experimentos a seguir é observar a atividade do inflamassoma em células dendríticas humanas in vitro usando ensaios simples de leitura IL one beta. Primeiro, adicione R 8 48 às células para induzir a expressão intracelular de pro IL uma beta. Em seguida, adicione nige para ativar a formação de três inflamassoma NLRP.

Isso, por sua vez, desencadeia a clivagem de pró IL um beta em IL maduro um beta antes da secreção. Em seguida, coletar as amostras e medir os resultados intracelulares pro IL one beta e os resultados extracelulares maduros IL one beta obtidos medindo a secreção de IL one beta de células preparadas e ativadas por imunofluorescência, western blot e eli. Uma detecção demonstra que o priming humano DCS resulta na produção intracelular de pró-IL um beta em células primed R 8 48 e secreção de IL one beta de células preparadas e ativadas com juris nigeriano.

Este método pode fornecer informações sobre o papel do inflamassoma NLRP três na resposta das células dendríticas humanas a ligantes sintéticos. Também pode ser aplicado a outros sistemas projetados para testar gatilhos fisiológicos, como bactérias, vírus e doenças autoinflamatórias. Alíquota 200 microlitros de células dendríticas derivadas de monócitos recém-isolados em seu estado de repouso em uma placa inferior redonda de 96 poços.

Comece com as quatro condições padrão de controle negativo não estimulado, apenas preparação, apenas ativação e preparação seguida de ativação. Então, de acordo com o projeto experimental, inclua controles de diluente para R 8 48 e nissina para ensaios de coloração de citocinas intracelulares a jusante, inclua duplicatas para os controles de isotipo para preparar o inflamassoma. ADD R 8 48, adicionar uma concentração final de 10 micromolares aos alvéolos apropriados.

Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 18 horas. Em seguida, para ativar o NLRP três inflamassoma, adicione nige a uma concentração final de 20 micromolares. Retorne as culturas à incubadora por mais seis horas para colher as amostras, centrifugue a placa de cultura a 974 vezes G por três minutos sem perturbar os grânulos celulares.

Transfira cada sobrenadante para uma placa inferior redonda separada para medir a secreção de citocinas por EISA. Agora lave os pellets celulares três vezes com 200 microlitros de um XPBS para remover qualquer IL extracelular um beta das amostras celulares para análise posterior por uma variedade de técnicas para detecção de western blot de pró IL um beta lyce as células diretamente em 10 microlitros de tampão de lise desnaturante. Depois de transferir os lisados para tubos einor de 1,5 mililitros, aquecer as amostras durante 10 minutos a 100 graus Celsius para detecção fluorescente por citometria de fluxo de IL um beta.

Adicione 100 microlitros de meio 5%PHS às amostras celulares e um microlitro de anticorpos marcados com fluorescência aos marcadores de fenótipo ou controle de isotipo incube por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após três lavagens de PBS, fixe as células com 100 microlitros de 4% de PFA por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão permeável por 30 minutos, seguido por 62 nanogramas de anticorpo anti IL um beta FSE ou amostras de controle de isotipo por duas horas a 37 graus Celsius.

Lave as células três vezes com 200 microlitros de tampão permeável e ressuspenda em um XPBS. Embrulhe as amostras em papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius. Se detectar IL um beta por microscopia corar células com dappy, adicione montanha e coloque uma lamínula suavemente em cima de uma lâmina de vidro.

Deixe a montanha curar durante a noite antes de capturar imagens de microscopia para detecção fluorescente por citometria de fluxo. Adquira dados uma amostra de cada vez. Defina as portas espalhadas para a frente e para o lado nas células vivas Próxima porta nas células CD 11 C positivas CD 14 negativas.

Por fim, analise a população MODC com base na coloração pro IL one beta na aquisição de dados de microscopia. Definir o tempo de exposição com a amostra tratada com coloração positiva R 8 48. Em seguida, determine a porcentagem de pró IL um beta expressando MO dcs facilidade para detecção de western blot.

Carregue o volume total da amostra no gel de poliacrilamida. Execute a 140 volts até que a frente da matriz saia do gel. Transfira a proteína do gel de poliacrilamida para A-P-V-D-F immo na membrana FL.

Bloqueie a membrana com 5% BSA em TBST por uma hora. Incube com o anticorpo primário enquanto agita a quatro graus Celsius durante a noite. Após três lavagens de TBST de cinco minutos, incubar com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora, após mais três lavagens de TBST, obter imagens da membrana ao medir as citocinas secretadas pelo ELI SA equilibrar as amostras à temperatura ambiente.

Reduza as amostras para consolidar a condensação do sobrenadante e siga as instruções do fabricante para medição de IL uma beta, a coloração de citocinas intracelulares para pró IL uma beta permite leituras de microscopia e fatos de células dendríticas derivadas de monócitos CDs 11 C positivos para CD 14 negativos. Ambas as técnicas podem ser quantificadas em relação a um controle de célula não primo ou em repouso, bem como a um controle de isotipo. A porcentagem de células da coloração pro IL um beta é multiplicada pela mediana geométrica dessa população para fornecer a intensidade fluorescente mediana.

O MFI é comparável à quantidade de pró-IL um beta presente nas células de coloração positivas. Aqui. Técnicas de immunoblotting são usadas para medir pró-IL um beta dos lisados celulares. Os dados quantitativos são expressos em relação a um controle celular interno, como a beta tubulina, conforme esperado.

O immunoblotting para pró-IL um beta em células NI tratadas na Nigéria revela uma diminuição no pró-IL um beta. Isso é complementado por um aumento simultâneo em IL um beta em sobrenadantes, medido por E ELI a apenas um R 8 48, seguido por condições NI nigerianas. A medição simultânea de outras citocinas inflamatórias, como T NF alfa, IL 10 e IL seis, garante que o Níger seja específico para causar a secreção de IL um beta.

O nível de priming depende do tempo e da dose. Experimentos adicionais, como medir a concentração de proteínas ex extracelulares, detecção de quimioluminescência de I maduro uma geração beta ou bloquear o inflamassoma, ajudariam a determinar se ex extracelular IO um beta é a forma clivada madura e se IO uma secreção beta é nlrp. Três dependentes da atividade do inflamassoma.