Name: Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a ativar e mensurar a atividade do inflamassoma NLRP3 em células dendríticas humanas derivadas de monócitos usando IL-1β. Este método utiliza R848 e nigericina para avaliar respostas imunes.

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Os autores gostariam de agradecer Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O&#39;Brien, MD, pelo apoio e feedback. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e concluído com financiamento do NIH concede Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa para individuais predoctoral Fellowships (F31) para promover a diversidade na Pesquisa em Saúde Relacionados (AI089030) e SR1 (AI081848 ).

Declaração de Ética: Amostras de pesquisa são obtidos e armazenados para pesquisa com o consentimento dos doadores. Todas as amostras devem ser codificadas ou anónimos, antes da utilização. Este protocolo segue as diretrizes do nosso Conselho de Revisão Institucional. 1. Diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas derivadas de monócitos. Nota: cremes leucocitários humanos servir como fonte de células do sangue periférico humano (PBMC) e foram obtidos a partir do Centro de Sangue de Nova Iorque (New York, NY). Doadores de sangue são voluntários saudáveis. O procedimento de cinco dias começa com o revestimento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em cultura de tecidos frascos 35,36. Diferenças notáveis ​​dos protocolos publicados são os seguintes: <ol><li> Utilizar 225 centímetros 2 não pirogénicas frascos de cultura de tecido poliestireno com uma tampa de filtro de aderir um total de 2x10 8 PBMC por frasco de 10 cm em vez de poliestireno placa de cultura de tecidoss (58 cm 2) (passo 1). </li><li> Prepare meios com 5% de soro humano reunido (PHS; 30 ml) em 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampão de 5 ml de HEPES 1 M, e 1,4 mL de 50 mg / ml de gentamicina (5% mídia PHS), seguido por filtração através um filtro de 20 | iM. Adicionar um total de garrafa de cultura de 50 ml de 5% mídia PHS por 225 centímetros 2 tecidos. </li><li> Lave células aderidas três vezes com 25 ml fresco RPMI-1640. Agite vigorosamente durante 5 segundos durante cada lavagem e aspirar as células aderentes não (passo 4). </li><li> Adicionar 190 ul de 400 UI / ul IL-4 e 380 ul de 100 UI / mL de GM-CSF por balão (passo 3) no dia 0, 2, e 4. Dia 0 é definido como o dia PBMC são semeadas no Passo 1 (Passo 8). </li><li> Dia de colheita 5 moDCs a uma concentração de 1x10 6 células / mL (etapa 15). </li><li> Use moDCs imediatamente em seu estado de repouso. Passos 17-22 nunca são executadas. Nota: As amostras devem ser processados ​​o mais rápido possível após a coleta para obter melhores resultados. </li><li> MoDCs alíquotas de cada concentraçãoção de 2x10 5 células / poço (200 ul / poço de 6 a 1x10 células / ml) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (western blot, ELISA, FACS), ou para um chamberslide poli-L-lisina tratada (microscopia) para experimentação . Nota: Há pelo menos quatro condições: Completamente não estimulado (controle negativo), priming, Só ativação e condicionamento seguido de ativação. As condições podem ser expandidas para incluir controlos de diluente para R848 e nigericina se desejado. Se o ensaio a jusante é ICS, duplicatas são necessárias para controles isotipo. </li></ol> . 2 Priming o inflammasome - Sinal 1 <ol><li> Reconstituir R848 liofilizado em DMSO de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque trabalhando em RT com RPMI-1640. </li><li> Adicionar R848 a uma concentração final de 10 uM para poços de 18 horas apropriadas. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3 Ativando o NLRP3 inflammasome -. Signal2 <ol><li> Reconstituir nigericina liofilizado em etanol de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque de trabalho, à TA, com meio RPMI-1640 antes da adição às condições adequadas. </li><li> Adicionar nigericina a uma concentração final de 20 uM e retornar para o incubador a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 6 horas. Não há etapas de lavagem ocorrer entre priming e durante a ativação. Nota: A secreção de IL-1β é aumentada pela presença de ionóforo de cálcio, brefeldina A, monensina, dinitrofenol, ou cianeto de carbonilo clorofenilhidrazona 37, 38. Portanto, a adição destes inibidores de secreção não são recomendadas na análise de iniciação ou actividade inflammasome uma vez que irá alterar a secreção de IL-1β. </li></ol> 4. Coleta de Amostras IL-1ß <ol><li> Centrifugar a placa com as células e os sobrenadantes a 974 xg durante 3 min. </li><li> Sem perturbar o sedimento celular, aspirar o sobrenadante e transferir para aeparate de fundo redondo de chapa, a fim de medir a secreção de citocinas a partir dos sobrenadantes. Nota: Os sobrenadantes podem ser temporariamente armazenados a -20 ° C ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo. </li><li> Lavar os sedimentos celulares por três vezes com 200 ul de 1x PBS a 974 x g durante 3 minutos para remover qualquer extracelular de IL-1β das amostras celulares. Nota: Ao lavar pellets de células de uma placa de 96 poços, retire a lavagem por inversão placa rápida em uma caixa de coleta, de modo a não perturbar a amostra. </li></ol> 5. Medição de IL-1b a partir de amostras celulares e sobrenadantes <ol><li> Coloração de citocinas intracelulares (ICS): O protocolo ICS está descrito abaixo 39, 40. Nota: não suspender as células se o ensaio a jusante é a microscopia. Todas as lavagens e aspirações deve ser feito sem perturbar a camada de células / pelete (dependendo do ensaio a jusante). <ol><li> Adicionar 100 ul de 5% de meio PHS em poços apropriados. Adicionarvolume apropriado (cerca de 1 5 μl/2x10 células, ou 1 mL / poço) de marcado por fluorescência α-CD11c e α-CD14 (marcadores fenotípicos, clone B-ly6 e MφP9, respectivamente), ou controlo de isotipo para as células durante 10 min a RT no escuro. </li><li> Lavar três vezes com 1x PBS a 974 x g durante 3 min. </li><li> Fixar as células por adição de 100 mL de 4% de PFA durante 20 min à RT, no escuro. </li><li> Pausa Point: Lavar com 100 l 1x PBS a 974 xg por 3 min e armazenar a 4 ° CO / N em 1x PBS. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização de células durante 30 min. Nota: tampão de permeabilização é composto de 1x PBS com 0,3% de Triton X-100, e 1% de albumina de soro bovino (BSA) para a permeabilização. Não perturbe células aderentes ao ensaio a jusante é a microscopia. </li><li> Adicionar o volume apropriado (cerca de 62 ng antibody/2x10 5 células, ou cerca de 2,5 uL / poço) de α-IL-1β-FITC (clone 8516) ou controlo de isotipo para2 horas numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Lave as células três vezes com 200 ul de tampão de permeabilização em 974 xg durante 3 minutos no escuro. </li><li> Opcional: Coloração com DAPI, adicionar montagem, e colocar lamelas delicadamente no topo de uma lâmina de vidro. Permitir montagem para curar O / N antes de capturar imagens de microscopia. </li><li> Adquirir os dados por FACS ou microscopia. Nota: Compare o isotipo para cada condição para a coloração adequada na análise por FACS ou microscopia. <ol><li> CAA: Adquirir uma amostra de cada vez. Defina o FSC / SSC portão nas células vivas, seguido de gating em CD11c + CD14 - células antes de analisar a população MODC pró-IL-1β coloração. </li><li> Microscopia: Defina o tempo de exposição, usando a amostra coloração positiva - R848 tratada. Use DAPI + pró-IL-1β + e DAPI + pró-IL-1β - para determinar a percentagem de pró-IL-1β + expressam moDCs. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Página: Immunoblotting é realizado para detectar pró-IL-1β. Nota: A técnica descrita a seguir combina técnica padrão imunotransferência, gradiente de 4-20% de gel de poliacrilamida, e a detecção fluorescente ou quimioluminescente, 41, 42. <ol><li> Lisar as células directamente em 10 uL de tampão de lise desnaturante (5 ul β-mercaptoethanol/950 tampão de amostra Laemmli ul seguido por diluição a 1:1 com tampão de lise celular). Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de Eppendorf. </li><li> Lisado de calor em uma placa seca durante 10 minutos a 100 ° C. </li><li> Girar a 20.800 xg lisado num minicentrifuge durante 1 min para concentrar o volume de líquido. Pause ponto: as amostras podem ser congeladas a -20 ° C para armazenagem de curta duração. </li><li> Carregar o volume total sobre o gel de poliacrilamida. Executar 140 V através da caixa de gel para cerca de 1 hora, ou até a frente do corante sai da parte inferior do gel. </li><li> Transferir a proteína a partir do gel de poliacrilamida para uma membrana Immobilon-PVDF Membr FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear a membrana com 5% de BSA em tampão salino Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 hora. Nota: PVDF Immobilon-FL é melhor para uso com detecção fluorescente. Uma membrana com uma composição diferente é recomendado para outras técnicas de detecção para aumentar o sinal para relação de fundo. </li><li> Dilui-se anticorpos primários e secundários, em 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar as incubações de anticorpos primários a 4 ° CO / N, agitando e anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 hora, agitando. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com TBS-T, durante 5 minutos, agitando entre as incubações do anticorpo primário e secundário e de novo entre as incubações secundárias e de imagiologia. Nota: As bandas podem ser detectados utilizando fluorescente ou de detecção quimioluminescente. Siga as instruções do fabricante para a detecção. </li></ol></li><li> ELISA: As amostras que são congelados para armazenamento necessita equilibrar à temperatura ambiente antes da análise. Gire para baixo as amostras em uma centrífuga para consolidar CONDENS sobrenadanteção. Siga as instruções do fabricante para a medição de IL-1β. Nota: Neste protocolo IL-1β é especificamente medido; No entanto, a medição simultânea de TNFa, IL-6, e o imunomodulador citocina IL-10 assegurar as condições apropriadas foram sensibilizados. </li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

As citocinas inflamatórias são essenciais na condução da resposta imune inata e adaptativa para combater a infecção viral. Secretado IL-1β tem sido demonstrado que o aumento durante a infecção da gripe 3, 43, 44. Os mecanismos exactos pelos quais essas citocinas são processados, em resposta ao reconhecimento viral em células dendríticas humanas não são completamente compreendidos. Mielóides kits de isolamento DC são caros e demorados. Kits de isolamento e FAC classificação pode involuntariamente estresse ou a...

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação 7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 + e as células T CD8 + citolítica 8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de estresse celular e danos. Toll like receptors (TLRs) são receptores de reconhecimento padrão membrana ligada que reconhecem determinado patógeno fagocitada extracelular padrões associados moleculares (PAMPs) e padrões moleculares de perigo associado (amortece). Ao aceno contraste como receptores (NLRs) são citosólica e responder a uma gama diversificada de PAMPs e DAMPs. Nod like receptors reapresentar uma segunda linha de defesa contra patógenos que escapam da superfície celular e PRRs endocíticas. A interação do patógeno derivada, ou &quot;perigo&quot; associado, fatores com TLR e NLR ligantes leva a um estado de maturação DC resultando em aumento da interação DC com outras células do sistema imunológico e na promoção de células T e ativação das células natural killer 11. Interleucina-1β é um componente crucial da defesa do hospedeiro contra a infecção. Mediante o reconhecimento de um microrganismo, a citoquina altamente pró-inflamatória IL-1β, é segregada e funciona como um atractivo químico e activador de células imune inata e adaptativa. In vivo de IL-1β é em grande parte responsável pela resposta de fase aguda, incluindo febre e citocinas inflamatórias síntese 12. A maioria dos NLRs conter uma leucina do terminal C rico domínio de repetição que é pensado para funcionar na detecção do ligando, um domínio de ligação de nucleótido central (NACHT) que é important para NLRP3 oligomerização e um domínio efetor terminal de N (PYD em NLRP3) que medeia a transdução de sinal para alvos a jusante através de interações proteína proteína. A proteína NLRP3 define o complexo inflammasome mais intensamente estudado. Esta proteína é um membro da família NLR e tem a capacidade de formar um complexo de proteína molecular de vários compostos de NLRP3, o PYCARD proteína adaptadora (também conhecido como ASC), e ICE. Após a ativação inflammasome PYCARD liga a domínios terminais NLRP3 N e recruta ICE via ativação da caspase e domínio de recrutamento (cartão) domínios. A interleucina-1 da enzima de conversão é inicialmente gerado como um zimogénio que contém um motivo CARTÃO na sua extremidade N-terminal. Resultados de formação inflammasome em trazer duas moléculas ICE suficientemente perto para induzir sua ativação autocatalítica. O complexo inflammasome é necessário para activação de ICE, assim permitindo que a converter citoplasmática pró-IL-1β para amadurecer citocina. Secreção de IL sucedida-1β em DCs requer detecção de dois sinais diferentes e independentes de perigo. Primeiro, TLR detecção de PAMPs, DAMPs, ou sinalização de citocinas (TNF ou IL-1β) provoca uma regulação positiva da expressão citoplasmática de proteínas pró-IL-1β. Uma segunda, muitas vezes diferentes, o sinal é necessário para a formação do complexo inflammasome a montante de maturação ICE. Alguns inflammasome estimulando sinais incluem poros da membrana bacteriana formando toxinas (como nigericina), lisossomais interromper cristais (tais como cristais de urato monossódico, MSU) e ATP extracelular. O mecanismo montante levando a ativação NLRP3 inflammasome por esses diversos ativadores não é clara. Estudos investigando sinalizando a montante da formação inflammasome propõe que os eventos intracelulares, tais como a indução da hipocalemia ou espécies reativas de oxigênio (ROS) indiretamente ativar o inflammasome 13-28. Entre os diferentes activadores virais do inflammasome NLRP3 é gripe, que fornece both o sinal primário e secundário necessário para a secreção de IL-1β 3, 29-33. Usando modelos de mouse NLRP3 knockout verificou-se que a secreção de IL-1β em DCs é NLRP3 dependente 32. Além disso, ratinhos knockout Nlrp3 atraído menor número de leucócitos para o local da infecção e experimentaram maior mortalidade 2, 5. Dois artigos recentes sugerem um mecanismo para a ativação inflammasome NLRP3 durante a infecção pelo vírus Influenza; em primeiro lugar, por meio de priming reconhecimento de ARN viral por TLR7 TLR8 ou (dependendo expressão TLR da célula responder) ou através de detecção de bactérias comensais por outro TLR para induzir a expressão citoplasmática pró-IL-1β, seguido por um segundo sinal, a activação de NLRP3 formação inflammasome pela proteína de canal iônico viral M2 na rede de Golgi trans 33, 34. No último passo, o desencadeamento de inflammasome NLRP3 é realizado por perturbação do intracelular iónico &lt;in&gt; meio que conduz a produção de ROS, que é, simplesmente, detectada por NLPR3 como um sinal de modo a formar o inflammasome. No entanto, o mecanismo preciso de inflammasome montante activação de actividade da ICE durante a infecção da gripe ainda permanece incerto. Este trabalho descreve uma técnica valiosa para o estudo da inflammasome NLRP3 em moDCs humanos que pode ser usado como uma base para uma investigação mais aprofundada da via subjacente DC baseado secreção de IL-1β em resposta a TLR8 ligadura com R848 seguido pela ativação do inflammasome por um bem activador conhecido de NLRP3, nigericina. Variações deste método pode ser usado com outros tipos de células, incluindo, mas não limitados a: monócitos, macrófagos, outros subconjuntos DC, e células epiteliais.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R& D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>Adquirimos este item através de nossa farmácia local com uma prescrição</td></tr><tr><td>RPMI 1640 com L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares do sangue periférico</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>PBMCs foram isolados do sangue de doadores saudáveis</td></tr><tr><td>12 placas de cultura de tecidos de poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de cultura de tecidos de fundo redondo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R& Controle</td> de isotipo D <td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&beta;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>R& D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-FL membrana</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>gradiente 4-12% gel de policrilamida</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli tampão de amostra</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% solução estéril/filtrada</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>16% solução</td></tr><tr><td>Kit de matriz de esferas de citocinas inflamatórias humanas</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>Depósito no local</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 cm2, Tampa do filtro, volume de trabalho de 70 ml, 30/Cs</a></td><td>Thermo 159933</td><td></td><td></td>Científica</tr><tr><td>20 &mu; M Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-mouse IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Burro &alpha;-coelho IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Espectros multicoloridos ampla gama de proteínas ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS 10x</td><td>Bio Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine 10x</td><td>Bio Rad</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro tratado para cultura de tecidos de vaso de poliestireno de 8 câmaras</td><td>BD Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

ativação e mensuração de nlrp3 inflammasome atividade usando il-1β em células dendríticas humanas monocyte derivados

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico 1, 2. Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente 1-5. Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina. DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Estas técnicas medir TLR8 priming com R848. Coloração citocina intracelular para pró-IL-1β permite a microscopia e FACS leituras de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas as técnicas podem ser quantificados em relação a um não carregadas, ou de descanso, controlo de células, bem como um controlo do isotipo (Figuras 1 e 2). Percentagem de células pró-IL-1β + coloração é multiplicado pela média geométrica da população para fornecer a intensidade de fluorescência média (IFM). O MFI é ...

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é observar a atividade do inflamassoma em células dendríticas humanas in vitro utilizando ensaios simples de detecção de IL-1β. Primeiro, adicione R 8 48 às células para induzir a expressão intracelular de pró-IL-1β. Em seguida, adicione nige para ativar a formação do inflamassoma NLRP3.Isso, por sua vez, desencadeia a clivagem da pró-IL-1β em IL-1β madura antes da secreção. Em seguida, colete as amostras e meça a pró-IL-1β intracelular e a IL-1β madura extracelular; os resultados são obtidos mediante a quantificação da secreção de IL-1β por células previamente sensibilizadas e ativadas, por meio de imunofluorescência, western blot e ELISA. A detecção demonstra que a sensibilização de DCs humanas resulta na produção intracelular de pró-IL-1β em células sensibilizadas com R848 e na secreção de IL-1β por células sensibilizadas e ativadas com Nigericina e ATP.Este método pode fornecer informações sobre o papel do inflamassoma NLRP3 na resposta de células dendríticas humanas a ligantes sintéticos. Também pode ser aplicado a outros sistemas projetados para testar estímulos fisiológicos, como bactérias, vírus e doenças autoinflamatórias. Aliquotar 200 microlitros de células dendríticas derivadas de monócitos recém-isoladas em seu estado de repouso em uma placa de fundo redondo com 96 poços.Inicie com as quatro condições padrão de controle negativo não estimulado, apenas primeamento, apenas ativação e primeamento seguido por ativação. Em seguida, de acordo com o delineamento experimental, inclua controles de diluente para R 8 48 e nissina; para ensaios downstream de coloração intracelular de citocinas, inclua duplicatas para os controles de isotipos para ativar o inflamassoma. ADICIONE R 8 48, adicionando uma concentração final de 10 micromolar às poças apropriadas.Coloque as células em um incubador a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 18 horas. Em seguida, para ativar o inflamassoma NLRP3, adicione nige em uma concentração final de 20 micromolar. Retorne as culturas ao incubador por mais seis horas para colher as amostras; centrifugue a placa de cultura a 974 ×g por três minutos sem perturbar os pellets celulares.Transfira cada sobrenadante para uma placa separada de fundo redondo para medir a secreção de citocinas por EISA. Agora, lave os pellets celulares três vezes com 200 microlitros de PBS 1X para remover qualquer IL-1β extracelular das amostras celulares para análises posteriores por diversas técnicas, como detecção por Western blot de pró-IL-1β. Lisar as células diretamente em 10 microlitros de tampão de lise desnaturante. Após transferir os lisados para tubos de 1,5 mililitro, aqueça as amostras por 10 minutos a 100 graus Celsius para detecção fluorescente por citometria de fluxo de IL-1β.Adicione 100 microlitros de meio com 5% de PHS às amostras celulares e um microlitro de anticorpos marcados com fluoróforo aos marcadores de fenótipo ou controle de isotipo; incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após três lavagens com PBS, fixe as células com 100 microlitros de PFA a 4% por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão permeabilizante por 30 minutos, seguido por 62 nanogramas de anticorpo anti IL-1β conjugado com FSE ou controle de isotipo; incube as amostras por duas horas a 37 graus Celsius.Lave as células três vezes com 200 microlitros de tampão permeabilizante e ressuspenda em um XPBS. Envolva as amostras com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius. Se for detectar IL-1β por microscopia, marque as células com DAPI, adicione montagem e coloque cuidadosamente uma lamínula sobre uma lâmina de vidro.Deixe a amostra curar durante a noite antes de capturar imagens de microscopia para detecção fluorescente por citometria de fluxo. Adquira os dados uma amostra por vez. Defina os parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral nas células viáveis. Em seguida, selecione as células positivas para CD11C e negativas para CD14.Por fim, analise a população de MODC com base na marcação de pró-IL-1β em dados de aquisição de microscopia. Ajuste o tempo de exposição com a amostra tratada com R 8 48, que apresenta marcação positiva. Em seguida, determine a porcentagem de MODCs que expressam pró-IL-1β para detecção por western blot.Carregue todo o volume da amostra no gel de poliacrilamida. Execute a 140 volts até que a frente do corante saia do gel. Transfira a proteína do gel de poliacrilamida para a membrana FL com A-P-V-D-F imo.Bloqueie a membrana com BSA 5% em TBST por uma hora. Incube com o anticorpo primário sob agitação a quatro graus Celsius durante a noite. Após três lavagens com TBST de cinco minutos, incube com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora; após mais três lavagens com TBST, image a membrana ao medir citocinas secretadas por ELISA, equilibrando as amostras à temperatura ambiente.Centrifugar as amostras para consolidar a condensação do sobrenadante e seguir as instruções do fabricante para a medição da citocina intracelular IL-1β. A coloração para pró-IL-1β permite análises por microscopia e leituras de dados em células dendríticas derivadas de monócitos CD11c positivas e CD14 negativas. Ambas as técnicas podem ser quantificadas em relação a um controle de células não ativadas ou em repouso, bem como a um controle de isotipo. A porcentagem de células coradas para pró-IL-1β é multiplicada pela mediana geométrica dessa população para fornecer a intensidade mediana de fluorescência.O MFI é comparável à quantidade de pró-IL-1β presente nas células com coloração positiva. Aqui, técnicas de imunoblotagem são utilizadas para medir a pró-IL-1β a partir dos lisados celulares. Os dados quantitativos são expressos em relação a um controle celular interno, como a tubulina beta, conforme esperado.A imunomarcação para pró-IL-1β em células tratadas com NI-Nigericina revela uma diminuição na pró-IL-1β. Isso é acompanhado por um aumento concomitante na IL-1β nos sobrenadantes, medido por ELISA apenas após as condições com NI-Nigericina. A quantificação simultânea de outras citocinas inflamatórias, como TNF-α, IL-10 e IL-6, assegura que a Nigericina seja específica na indução da secreção de IL-1β.O nível de priming depende do tempo e da dose. Experimentações adicionais, como a medição da concentração de proteínas extracelulares, a detecção de quimioluminescência proveniente da geração da forma madura de IO-1β ou o bloqueio do inflamassoma, ajudariam a determinar se a IO-1β extracelular é a forma clivada madura e se a secreção de IO-1β é dependente da atividade do inflamassoma NLRP3.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um imunoensaio simples para medir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 beta de produção, em pacientes com fenótipos Autoinflamatórias. Pela ativação de células em culturas de sangue total com patógeno-padrões moleculares associados, especificamente com lipopolissacarídeo, a secreção de citocinas podem ser convenientemente avaliados em sobrenadantes de sangue total.

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream...

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Este vídeo demonstra um método para detectar a ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos usando sondas repórteres fluorescentes. As células são tratadas com ionóforos de potássio e glicina para induzir a montagem do inflamassoma e a ativação da caspase-1. As sondas repórteres fluorescentes visualizam a caspase-1 ativada e as células são coradas com um corante fluorescente para visualização dos núcleos.

Detecção de ativação do inflamassoma por microscopia de fluorescência

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a formação de inflamassoma contendo 3 (NLRP3) contendo domínio de pirina da família de receptores semelhantes a NOD em macrófagos primários por meio de imunofluorescência. Os macrófagos são primeiro preparados com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para regular positivamente a expressão da proteína NLRP3. A exposição dos macrófagos à nigericina - um ionóforo de potássio - leva à ativação do NLRP3 e à formação de inflamassomas, que são visualizados...

Uma técnica in vitro para estudar a formação de complexos inflamassoma em macrófagos

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Aprenda a ativar e mensurar a atividade do inflamassoma NLRP3 em células dendríticas humanas derivadas de monócitos usando IL-1β. Este método utiliza R848 e nigericina para avaliar respostas imunes.

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

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