Name: Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a fabricar tecido cartilaginoso humano em 3D usando uma impressora inkjet modificada com polimerização UV simultânea. Este método avança a engenharia de tecidos para medicina regenerativa.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do New York Região Capital Alliance Research Grant.

1. Bioprinting Plataforma Estabelecimento A modificação de impressora foi baseada em uma impressora jato de tinta térmica HP Deskjet 500 e HP 51626A cartucho de tinta preta. <ol><li> Remova a tampa plástica superior da impressora e cuidadosamente retire o painel de controle a partir da tampa. </li><li> Retire os 3 conexões de cabo entre a parte superior da impressora e base. Remova a parte superior da impressora a partir da base. </li><li> Na parte superior da impressora, remova o pequeno plástico e acessórios de borracha (sistema de limpeza da cabeça de impressão) no lado direito sob o cartucho de tinta. </li><li> Retire a base da bandeja de papel, com molas. </li><li> Remova a placa metálica que cobre a barra de alimentação de papel de plástico. </li><li> Corte a barra de alimentação de papel de plástico na posição da roda de alimentação meio usando uma serra de mão ou outra ferramenta de corte. </li><li> Retire os 2 rodas de alimentação de papel expostos depois da etapa anterior. O plástico roda é muito difícil e um eletrônicoserra será útil. </li><li> Limpe a poeira e detritos usando lenços de ar e etanol enlatados. </li><li> Prenda a parte superior da impressora para a base. </li><li> UV esterilizar a impressora modificada para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo laminar antes de usar. </li><li> Corte a tampa de um cartucho de tinta HP 51626A usando um serrote ou outra ferramenta de corte. </li><li> Esvaziar a tinta e remover o filtro que cobre o poço reservatório inferior da cartilagem. </li><li> Lavar o cartucho cuidadosamente, com água corrente. </li><li> Ultrasonicate o cartucho no desionizada (DI) de água durante 10 minutos para remover a tinta residual. </li><li> Examinar o cartucho para certificar-se que toda a tinta foi removida. Lavar ou pulverizar o cartucho cuidadosamente com etanol a 70% para a esterilização, seguido por água DI esterilizado. </li><li> Configurar uma lâmpada ultravioleta de longo comprimento de onda sobre a plataforma de impressão para fornecer capacidade de fotopolimerização simultânea. </li><li> Medir a intensidade UV a uma plataforma da impressão utilizando uma luz UVmetros. Ajustar a distância entre a lâmpada de UV e a plataforma de impressora, de modo a intensidade para o objecto de impressão é entre 4-8 mW / cm2 (cerca de 25 cm de distância da lâmpada para a plataforma de impressora). </li></ol> 2. Bioink Preparação <ol><li> Expansão monocamada de condrócitos <ol><li> Placa 5.000.000 condrócitos humanos em cada balão de cultura de tecidos T175 por expansão das células em Dulbeccos Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro de vitela e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). As células de cultura a 37 ° C com ar humidificado contendo 5% de CO 2. Altere o meio de cultura a cada 3 dias até que o frasco é de 85% de confluência. Use células da mesma passagem. </li></ol></li><li> Dissolver PEGDA em PBS para uma concentração final de 10% w / v Adicionar fotoiniciador I-2959 a uma concentração final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar a solução. </li><li> Suspender condrócitos humanos cultivados na solução PEGDA preparado a 5 x 10 6 células /ml. </li></ol> 3. Cartilagem de tecido de impressão <ol><li> Ligue a impressora e laptop. </li><li> Criar um padrão de impressão de um círculo sólido com 4 mm de diâmetro, utilizando o Microsoft Word ou Adobe Photoshop. <ol><li> Ajuste a posição do padrão e verifique se ele será impresso exatamente no molde plástico. </li><li> Calcule o número de cópias necessárias para atingir a espessura desejada de andaime. Para 4 mm de altura, 220 impressões são necessários para criar o andaime desejado. </li></ol></li><li> Carregue o bioink para o cartucho de tinta. Cubra o cartucho com papel alumínio para proteger da exposição UV direto durante a impressão. </li><li> Enviar comando de impressão para a impressora. Puxe o sensor de papel quando a impressora começa a imprimir. O processo de impressão de todo deve ter menos do que 4 minutos para um andaime com 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura. </li><li> Transferência impresso neocartilage para uma placa de 24 cavidades e adicionar 1,5 ml de meio de cultura a cada poço. </li></ol><ol><li> Incubar a neocartilage impresso no VIVO / solução de trabalho MORTOS viabilidade / citotoxicidade em temperatura ambiente por 15 min no escuro. </li><li> Corte o hidrogel célula-laden ao meio e tirar imagens fluorescentes de área de corte. </li><li> Contagem vivo (verde) e as células mortas (vermelho) por um observador cego em cinco imagens tiradas aleatoriamente. Calcular a viabilidade celular através da divisão do número de células vivas pelo número total de células vivas e mortas. </li></ol>

<ol><li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvasculature+fabrication+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+three-dimensional+bioprinting+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology.</a> Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+fibroblast+growth+factor-2+and+transforming+growth+factor-beta1+enhances+bioprinted+human+neocartilage+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).</li>
<li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+deposition+of+human+microvascular+endothelial+cells+and+biomaterials+for+human+microvasculature+fabrication+using+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22NIP24%2Fdigital+Fabrication+2008%3A+24th+International+Conference+on+Digital+Printing+Technologies%2C+Technical+Program+and+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing.</a> NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).</li>
<li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+evaluation+of+thermal+inkjet+printed+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).</li>
<li>Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+three-dimensional+co-culture+of+mesenchymal+stem+cells+with+meniscus+cells+promotes+meniscal+phenotype+without+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).</li>
<li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocytes+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).</li>
<li>Elisseeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoencapsulation+of+chondrocytes+in+poly%28ethylene+oxide%29-based+semi-interpenetrating+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).</li>
<li>Buskirk, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+A+High-Resolution+Thermal+Inkjet+Printhead%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).</li>
<li>Harmon, J. P., Widder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+Printhead+Into+the+HP+Deskjet+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+cartilage+tissue+engineering+to+regenerate+the+zonal+organization+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+manufacturing+for+in+situ+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects.</a> Biofabrication. 2, (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum interesse financeiro neste estudo.

Este sistema bioprinting 3D com capacidade fotopolimerização simultânea fornece uma resolução de impressão significativamente maior do que o melhor método anteriormente relatado de impressão em in situ de defeitos osteocondrais, utilizando uma seringa extrudido um hidrogel de alginato celular 16. Resolução de impressão mais elevada é particularmente crítica para a engenharia de tecidos de cartilagem para restaurar a cartilagem organização zonal anatómica. Fotopolimerização simultânea durante a montag...

Bioprinting baseada na impressão a jato de tinta térmica é uma das mais promissoras tecnologias de base no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com controle digital e alto rendimento cabeças fatores células, andaimes e crescimento podem ser precisamente depositado ao desejado bidimensional (2D) e posições (3D) tridimensionais rapidamente. Muitas aplicações de sucesso foram alcançados utilizando esta tecnologia em engenharia de tecidos e medicina regenerativa 1-9. Neste trabalho, uma plataforma bioprinting foi criada com a Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 impressora jato de tinta térmica modificado e um sistema de fotopolimerização simultânea. Hidrogéis sintéticas formuladas a partir de poli (etileno glicol) (PEG) revelaram a capacidade de manter a viabilidade dos condrócitos e promover a produção de ECM condrogénica 10,11. Além disso, a foto-reticulável PEG é altamente solúvel em água, de baixa viscosidade, o que o torna ideal para polímeros usados ​​em simultâneozação durante bioprinting 3D. Neste trabalho, os condrócitos humanos suspensas em poli (etileno) diacrilato glicol (PEGDA; MW 3.400) foram precisamente impresso para construir neocartilage camada por camada, com 1.400 dpi de resolução em 3D. Observou-se distribuição homogênea de células depositadas em um andaime 3D, o que gerou tecido cartilaginoso, com excelentes propriedades mecânicas e produção ECM reforçada. Por contraste, na fabricação manual, as células acumuladas na parte inferior do gel, em vez das suas posições inicialmente depositadas, devido à lenta polimerização andaime, o que levou a formação de cartilagem não homogénea após cultura 2,3.

<table><tbody><tr><td>Impressora a jato de tinta térmica HP Deskjet 500</td><td>Hewlett-Packard</td><td>C2106a</td><td>Descontinuada. Comprado recondicionado de fornecedor de internet.</td></tr><tr><td>Cartucho de tinta preta HP</td><td>Hewlett-Packard</td><td>51626a</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada ultravioleta</td><td>UVP</td><td>B-100AP</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de luz UV</td><td>Ferramentas Gerais</td><td>UV513AB</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 510</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG)</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade/citotoxicidade vivo/morto</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA)</td><td>Glycosan Biosystems</td><td>GS700</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Especialidades Químicas</td><td>I-2959</td><td></td></tr><tr><td>Condrócitos articulares humanos</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr></tbody></table>

cartilagem human tissue fabricação usando tridimensional inkjet tecnologia de impressão

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, que está baseada na impressão a jato de tinta térmica, é um dos mais atraentes tecnologias facilitadoras no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com as células de controlo digitais, os suportes, e os factores de crescimento podem ser depositada precisamente a desejada bidimensional (2D) e os locais (3D) tridimensional rapidamente. Portanto, essa tecnologia é uma abordagem ideal para fabricar tecidos que imitam suas estruturas anatômicas nativas. Para o engenheiro da cartilagem com organização nativa zonal, composição da matriz extracelular (MEC), e as propriedades mecânicas, desenvolvemos uma plataforma bioprinting usando uma impressora jato de tinta comercial com fotopolimerização simultânea capaz de engenharia de tecidos de cartilagem 3D. Condrócitos humanos suspensas em poli (etileno glicol) Diacrilato (PEGDA) foram impressos para a construção neocartilage 3D via montagem camada por camada. As células foram fixadas impressos nas suas posições originais depositados, suportado pelo surroFINANCIAMENTO andaime em fotopolimerização simultânea. As propriedades mecânicas do tecido impresso foi semelhante à cartilagem nativa. Em comparação com a fabricação do tecido convencional, a qual requer a exposição de UV mais, a viabilidade das células impressos com fotopolimerização simultânea foi significativamente maior. Neocartilage impresso demonstraram excelente glicosaminoglicanos (GAG) e a produção de colagénio de tipo II, o que era consistente com a expressão do gene. Portanto, esta plataforma é ideal para distribuição célula precisa e arranjo para a engenharia de tecidos anatômico.

A impressora jato de tinta térmica modificado foi capaz para celular e deposição de andaime no alto rendimento e excelente viabilidade celular. Combinando com fotopolimerização simultânea e biomateriais fotossensíveis, esta tecnologia é capaz de corrigir as células e outras substâncias impressos para os locais inicialmente depositados. De acordo com as propriedades da impressora a jacto de tinta térmica modificada, a resolução de impressão 2D foi 300 dpi com um único volume de gota de tinta de 130 pl. Existem 50 bicos d...

Os métodos descritos neste trabalho mostram como converter uma impressora jato de tinta comercial em um bioprinter com polimerização UV simultânea. A impressora é capaz de construir a estrutura do tecido 3D com células e biomateriais. O estudo demonstrou aqui construiu uma neocartilage 3D.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

O objetivo geral deste procedimento é construir um tecido cartilaginoso humano tridimensional para testar a viabilidade da impressão de tecidos 3D, utilizando uma impressora jato de tinta térmica modificada com foto-polimerização simultânea. Isso é realizado primeiramente modificando uma impressora jato de tinta térmica Hewlett Packard deskjet 500 comercialmente disponível e 5 1 16 2 6, um cartucho de tinta monocromático, para transformá-los em uma bioimpressora. O segundo passo consiste em combinar uma plataforma simples de impressão 3D e uma lâmpada de luz ultravioleta de comprimento de onda longo para proporcionar a polimerização instantânea da bio-tinta injetada durante o processo de fabricação.Em seguida, a bio-tinta é preparada suspensando condrocitos articulares humanos expandidos em uma solução a 10% de polietilenoglicol a 5 milhões de células por mililitro. O passo final consiste em imprimir o tecido cartilaginoso camada por camada com fotopolimerização simultânea. Por fim, microscopia confocal e histologia.A coloração é utilizada para demonstrar a distribuição uniforme de condrocitos impressos em um hidrogel tridimensional e a excelente produção de matriz extracelular car

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Bioengineering

Bioengenharia

Tridimensionais (3D) vigas mistas microstructured são fabricados através da infiltração dirigida e localizada de nanocompósitos em redes porosas microfluídicos 3D. A flexibilidade deste método de fabrico permite a utilização de diferentes materiais termo-endurecíveis e nanopartículas, a fim de alcançar uma variedade de 3D funcional reforçados nanocompósito produtos macroscópicos.

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