Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

O objetivo geral deste procedimento é construir um tecido tridimensional de cartilagem humana para testar a viabilidade da impressão de tecido 3D, usando uma impressora jato de tinta térmica modificada com fotopolimerização simultânea. Isso é feito modificando primeiro uma impressora a jato de tinta térmica Hewlett Packard desk jet 500 disponível comercialmente e 5 1 16 2 6, um cartucho de tinta monocromática para uma impressora biológica. O segundo passo é combinar um estágio simples de impressão 3D e uma lâmpada UV de comprimento de onda longo para fornecer polimerização instantânea da tinta biológica injetada durante o processo de fabricação.

Em seguida, a biotinta é preparada suspendendo condrócitos articulares humanos expandidos em solução de polietilenoglicol a 10% a 5 milhões de células por mililitro. A etapa final é imprimir o tecido cartilaginoso camada por camada com fotopolimerização simultânea. Em última análise, microscopia confocal e histologia.

A coloração é usada para mostrar a distribuição uniforme dos condrócitos impressos em um hidrogel 3D e excelente produção de matriz extracelular de cartilagem na neocartilagem homogênea durante a cultura. A principal vantagem dessa tecnologia sobre as medidas existentes, como polimerização após fabricação manual ou células sentadas após a varredura para a fabricação, é que as células impressas são entregues com precisão no local tátil e permanecem na posição na matriz. Em vez de pensar no fundo do andaime devido à gravidade, ele forma um cartucho homogêneo.

A modificação da impressora demonstrada neste vídeo é baseada em uma impressora a jato de tinta térmica Hewlett Packard desk jet 500 e um cartucho de tinta preta 5 1 6 2 6. Comece removendo a tampa plástica superior da impressora e retirando cuidadosamente o painel de controle da tampa. Desconecte as três conexões de cabo entre a parte superior e a base da impressora.

Em seguida, remova a parte superior da impressora da base. Em seguida, os pequenos acessórios de plástico e borracha que compõem o sistema de limpeza do cabeçote de impressão são removidos da parte superior da impressora. Remova a base da bandeja de papel com molas.

A placa metálica que cobre a barra de alimentação de papel plástico também deve ser removida. Além disso, a barra de alimentação de papel de plástico deve ser cortada na posição da roda de alimentação do meio e as duas rodas de alimentação de papel removidas. Para o propósito deste vídeo, esses componentes já foram removidos.

Depois de limpar a poeira e os detritos usando ar comprimido e lenços umedecidos com etanol, prenda a parte superior da impressora à base antes de usar o UV. Esterilizou a impressora modificada por pelo menos duas horas em uma capela de fluxo laminar. Para modificar o cartucho de tinta, primeiro corte a tampa.

Usando uma serra manual, esvazie a tinta e remova o filtro que cobre o reservatório do poço inferior do cartucho. Enxágue bem o cartucho com água corrente da torneira para remover os ultras residuais de tinta. Sonicar o cartucho em água desionizada durante 10 minutos.

Examine o cartucho para certificar-se de que toda a tinta foi removida. Pulverize o cartucho completamente com 70% de etanol para esterilização, seguido de água deionizada esterilizada. Por fim, instale uma lâmpada UV de comprimento de onda longo sobre a plataforma de impressão para fornecer capacidade de fotopolimerização simultânea.

Meça a intensidade UV na plataforma de impressão usando um medidor de luz UV. Ajuste a distância entre a lâmpada UV e a plataforma da impressora, de modo que a intensidade no assunto de impressão fique entre quatro a oito miliwatts por centímetro quadrado. Essa distância entre a lâmpada e a plataforma da impressora deve ser de aproximadamente 25 centímetros.

A bio tinta é preparada a partir de condrócitos humanos para expandir os condrócitos em uma placa de monocamada. 5 milhões de condrócitos humanos em cada frasco de cultura de tecidos T 1 75 para expansão celular Em DMEM suplementado com 10% de soro de bezerro e uma x células de cultura de glutamina estreptomicina de penicilina a 37 graus Celsius com ar umidificado contendo 5% de dióxido de carbono. Troque o meio de cultura a cada três dias até que as células estejam 85% confluentes.

Use células da mesma passagem. Prepare a solução de polietilenoglicol DL ou peda. Dissolva peda em PBS até uma concentração final de 10% em peso por volume.

Adicione o iniciador de fotos I 2 9 5 9 a uma concentração final de 0,05% de peso por filtro de volume. Esterilize a solução quando os condrócitos humanos cultivados estiverem 85% confluentes. Colete as células após calcular a concentração celular.

Transferir o volume de suspensão celular necessário para preparar a bio in a 5 milhões de células por mililitro para uma centrífuga de tubo cónico a 1200 RPM durante cinco minutos. Para granular as células, aspire o sobrenadante e suspenda as células na solução Pega preparada para formar a tinta biológica. Para iniciar este procedimento, ligue a impressora e o laptop usando o Microsoft Word, crie um padrão de impressão de um círculo sólido com um diâmetro de quatro milímetros.

Coloque o molde de plástico na impressora. Ajuste a posição do padrão e certifique-se de que ele será impresso exatamente no molde de plástico. Calcule o número de impressões necessárias para atingir a espessura desejada do andaime.

Para uma altura de quatro milímetros, são necessárias 220 impressões para criar o andaime desejado. Coloque a tinta biológica no cartucho de tinta. Cubra o cartucho com papel alumínio para proteger da exposição direta ao UV.

Durante a impressão, envie o comando de impressão para a impressora. Quando a impressora começar a imprimir, puxe o sensor de papel para continuar a impressão. Na ausência de papel passando pela impressora, todo o processo de impressão deve levar menos de quatro minutos para um andaime de quatro milímetros de diâmetro e quatro milímetros de altura.

Transfira a neocartilagem impressa para uma placa de 24 poços e adicione 1,5 mililitros de meio de cultura a cada poço. Para avaliar a viabilidade celular, incube a neocartilagem impressa na viabilidade de mortos-vivos. Solução de trabalho de citotoxicidade à temperatura ambiente por 15 minutos no escuro, corte o hidrogel carregado de células ao meio Depois de adquirir imagens fluorescentes da área de corte, faça com que um observador cego conte células vivas e mortas em cinco imagens tiradas aleatoriamente para calcular a viabilidade celular.

Um tecido de neocartilagem impresso representativo com um diâmetro de quatro milímetros e uma altura de quatro milímetros é mostrado nesta foto com base nas propriedades da impressora jato de tinta térmica modificada. Para uma construção desse tamanho, o volume e a espessura de cada camada impressa durante a construção camada por camada foram de 0,23 microlitros e 18 mícrons, respectivamente. Todo o processo de impressão para construir o tecido neocartilaginoso levou menos de quatro minutos.

Essas imagens são de condrócitos marcados com corantes fluorescentes verdes e laranja. O painel A mostra uma distribuição celular uniforme de condrócitos impressos no andaime 3D. Devido à fotopolimerização simultânea do andaime circundante durante a deposição da célula, o processo de impressão e fotopolimerização foi concluído em quatro minutos com uma viabilidade celular de 90%Por outro lado, o painel B mostra que, sem fotopolimerização simultânea, em vez de permanecer em seus locais inicialmente depositados, a célula afundou na interface horizontal inferior devido à gravidade.

Foram necessários 10 minutos de exposição UV ao gel, uma construção do mesmo tamanho de um A com viabilidade celular de 63% de açafrão e o coloração de condrócitos impressos no hidrogel PEG mostra aumento gradual da produção de prot glicano durante a cultura, indicando o fenótipo congênito de condrócitos impressos em 3D e a formação de uma neocartilagem homogênea. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar uma impressora a jato de tinta térmica modificada para criar tecido calculado tridimensional com distribuição uniforme de células em um andaime 3D.