Name: O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a usar biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação de canais de potássio por receptores acoplados à proteína G em células HEK 293 vivas. Este método avança a neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem ao Dr. Yangyang Yan no laboratório do Dr. Fred Sigworth na Universidade de Yale para a generosa doação de células HEK293 expressando estavelmente rato proteína Slack-B. Além disso, os autores agradecem ao Dr. Sigworth para crio-microscopia eletrônica de modelo de homologia de Slack exibido na introdução de vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH Grants DH067517 e NS073943 para LKK

1. Cultura de Células (Adaptado de Fleming e Kaczmarek 18) <ol><li> Células de cultura em mídia apropriada para maior do que 2, mas menos de 10 passagens antes do uso neste ensaio. Não transfectadas células HEK-293 e células HEK-293 expressando estavelmente a proteína de rato Slack-B foram cultivadas em meio de Eagle uma metade de Dulbecco Modificado e metade meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado calor e antibióticos. 500 ug / ml de geneticina (G418) é adicionado a células HEK-293 que expressam estavelmente Slack-B para seleccionar para a expressão do canal de folga. Células de passagem em confluência de 70-90% por dissociação a partir de pratos com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25%. </li></ol> 2. Matriz Extracelular (ECM) de revestimento do TiO 2 placa de 384 poços biosensor óptico com fibronectina e ovalbumina <ol><li> Preparação da mistura de fibronectina ECM e solução de bloqueio ovalbumina <ol><li> Prepare uma solução de trabalho de fibronectem salina tamponada com fosfato (PBS) com uma concentração final de 5 ug / ml de fibronectina em 20,0 ml de PBS. A partir de uma concentração de estoque de 1,0 mg / ml, adicionar 100 ul de 20,0 ml de PBS por uma diluição de 200 vezes. A solução de trabalho de fibronectina podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C após a preparação. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 5% de ovalbumina inactivado pelo calor em água estéril. Diluir ovalbumina em cultura de tecido, grau de água estéril para uma solução a 5% e aquece-inactivar durante 30 min a 60 ° C. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e a filtração estéril da solução. Alíquota da solução de ovalbumina 5% e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de 2% de ovalbumina diluindo a solução de reserva de 5% em PBS. Por exemplo, adicionar 12,0 mL de uma solução de estoque de ovalbumina a 5% para 18,0 ml de PBS para um volume final de 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384 poços da placa de revestimento do biosensor óptico <ol><li> Hidratar a placa de TiO 2 com 20,0 ul / poçocultura de tecidos de água de grau de estéril para 15 min. Os seguintes passos devem ser realizados com um pipetador de 16 canais. </li><li> Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço. </li><li> Adicionar 20.0 ul da solução de trabalho de fibronectina a cada poço e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente, para criar a ECM. </li><li> Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço. </li><li> Adicionar 40.0 ul da solução de trabalho de ovalbumina a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C para bloquear a placa. </li><li> Lavar 3x placa com 50,0 ul de PBS por poço. Placas revestidas de ECM podem ser armazenadas a 4 ° C durante até 48 horas. </li></ol></li></ol> 3. Sementeira de Células para a 384 poços Biosensor placa óptica <ol><li> Remover o meio de crescimento a partir das células e adicionar tripsina para desalojar as células da placa. Recolha das células e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Remova a mídia de tripsina e Ressuspender as células em meio de cultura. </li><li> Usando um hemocitómetro ou um automatizadocontador de células para determinar a concentração das células. </li><li> Para minimizar os efeitos da evaporação durante a incubação, 50,0 mL de meio de crescimento por poço vai ser usado. As células devem ser diluído para atingir o número desejado de células por poço num volume de 50,0 ul de meio de crescimento. Para estas experiências, 1000 células / poço foram semeadas em biossensor. </li><li> Permitir que as células semeadas a incubar durante a noite em meio de crescimento a 37 ° C sob ar / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Preparação do biossensor e Compostas placas para o ensaio GRT Optical Biosensor <ol><li> Remova a placa do incubador e remover o meio de crescimento a partir das células. Lavar as células com 1x Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). Adicionar 25.0 ul de HBSS a cada poço. </li><li> Colocar a placa de biossensor no scanner BIND e permitir que as células atinjam a temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Prepare um prato composto separado do que ligantes de interesse será added à placa biossensor durante o ensaio. Para estes ensaios, 25,0 uL de uma solução contendo o composto foi adicionado a cada poço na placa de biossensor para um volume total de 50,0 mL. Como tal, os compostos em solução foram preparadas em 2x a concentração final desejada. </li></ol> 5. Realizar o ensaio GRT Optical Biosensor <ol><li> Dê uma medição de linha de base com o sistema de scanner para poços A1-P12 (metade da SBS placa de 384 poços) com uma resolução máxima de 3,75 mM / pixel para a central de 1,5 milímetro de cada poço usando o software BIND Scan. Essa verificação de linha de base terá cerca de 30 min. </li><li> Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A1-P12. </li><li> Dê uma medida de referência de poços A13-P24. </li><li> Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A13-P24. </li><li> Dê uma medição disso pós composto por poços A1-P12, e repita para poços A13-P24. </li></ol> 6. Análise de Dados de Ensaio com BIND Ver <ol><li> Abra os dados do ensaio BIND para a medição da linha de base no Windows, e clique no botão &quot;Grid Editor&quot; para habilitar a seleção de células. O software calcula métricas de interesse definidas pelo utilizador. </li><li> Abra o &quot;Plug-ins&quot;, que incluem o &quot;Finder celular&quot; e função &quot;Baseliner&quot;. Definir parâmetros em &quot;Finder celular&quot; para que as células se distinguem do fundo do biossensor. </li><li> Exportar o arquivo de mapa de células que contém os dados &quot;Finder celular&quot; para a medição da linha de base. </li><li> Repita os passos de 6,1-6,2 para postar dados de adição de composto. </li><li> Abra o &quot;Baseliner&quot; plug-in e importar o mapa de células a partir da medição da linha de base. O software irá calcular a mudança na VOP entre os dados de base e pós compostos. </li><li> Seleccionar &quot;Δ celular médio&quot; para a saída do deslocamento significativo em VOP para as células. Os dados podem ser exportados para o Microsoft ExcEL para posterior análise. </li></ol>

<ol><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+Channels+of+Excitable+Membranes%22">Ion Channels of Excitable Membranes</a>. , Sinauer Associates. (1992).</li>
<li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+biomolecular+interactions%3A+applications+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li>
<li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+assays+on+the+BIND+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li>
<li>Hessel, A. aO., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Theory+of+Wood%27s+Anomalies+on+Optical+Gratings%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li>
<li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+biosensor%3A+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li>
<li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+K%2B+channels%2C+Na%2B+is+the+new+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li>
<li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K%2B+channels+by+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li>
<li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slack+and+Slick+K%28Na%29+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li>
<li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li>
<li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li>
<li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li>
</ol>

Steven M. Shamah é um empregado de Biociências X-CORPO.

O principal Z (Z &#39;) é um factor de método estatístico comum para quantificar a qualidade de um ensaio de rastreio de alto rendimento de 20, e porque o rastreio de agonistas de GPCR neste ensaio ocorreram numa compatível ensaio de 384 cavidades SBS, proporciona uma excelente medida da robustez e validade deste ensaio 21. Valor AZ &#39;de 1 indica um ensaio teoricamente ideal, com um número infinito de pontos de dados com desvios padrão inexistentes. Valor AZ &#39;entre 0,5-1 é considerado um exc...

Examinando as células vivas em seu contexto fisiologicamente relevante é crucial para entender as funções biológicas de alvos celulares. No entanto, os ensaios que examinam a interacção entre os canais e as proteínas citoplasmáticas de regulação, tais como ensaios de coimmunoprecipitation, geralmente fornecem pouca informação sobre o curso de tempo de interacções de células vivas. A maioria dos ensaios com base em células de corrente mede um evento celular específico, tal como a translocação de uma proteína de interesse fluorescente etiquetado. Estes ensaios requerem modificações das proteínas de interesse, o que pode, potencialmente, alteram o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo. Ensaios baseados em células não-invasiva, que não requerem a manipulação do sistema, proporcionam uma medição contínua da actividade celular e permitem estudos de células na sua mais fisiologicamente relevante estado 4. Biossensores ópticos são projetados para produziruma mudança mensurável em uma característica da luz, que é acoplada à superfície do sensor. Biossensores ópticos, que utilizam ondas evanescentes, que incluem ressonância de plasma de superfície (SPR) e comprimento de onda de ressonância grade () RWG técnicas, têm sido utilizados principalmente para detectar as afinidades e cinéticas de moléculas de ligação aos seus receptores biológicos imobilizadas na superfície do sensor. Mais recentemente, biossensores RWG comercialmente disponíveis foram desenvolvidas para permitir a detecção da mudança relativa da massa dentro da porção inferior de células aderentes à superfície do sensor em alta resolução espacial (até 3,75 mM / pixel) 5. Estes biossensores podem detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática de células vivas que resultam da estimulação, tal como a adesão de células e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação e as vias de sinalização induzidas por uma variedade de receptores de superfície celular, incluindo a proteína G Os receptores acoplados (GPCRs) 6 . Biossensores RWG detectar a relação change no índice de refracção como uma função da alteração relativa na massa a cerca de 150 nm do biossensor 7. Quando as células são plaqueadas para o biossensor, esta alteração no índice de refracção reflecte a variação da massa perto da membrana plasmática da célula, resultante de uma mudança na adesão celular para o biossensor. Este protocolo irá discutir a detecção de interações proteína-canal utilizando biossensores RWG. Sistemas de aquisição de dados RWG composto de vários componentes. Porque o X-CORPO Biociências BIND Scanner foi utilizada para estes experimentos, nos referiremos aos componentes para este sistema especial, que consiste em um leitor de placas, biossensores associados, software de aquisição de BIND Digitalizar e software BIND Ver análise 8. Os biossensores cristal fotónicas, referido daqui em diante como biossensores ópticos, são compostos de um arranjo periódico de um dieléctrico e o material em duas ou três dimensões, que impede a propagação da luz no específicacomprimentos de onda e as direcções. Estruturas de cristal fotônico são baseados em um fenômeno chamado de anomalia de Wood. Descoberto pela primeira vez por Wood em 1902, estas anomalias são efeitos observados no espectro de luz refletida por redes de difração óptica onde as variações bruscas de intensidade de determinadas ordens de difração ocorrem em determinadas faixas de freqüências estreitas. Em 1962, Hessel e Oliner apresentaram uma nova teoria de anomalias de madeira em que período finito grade gera um comprimento de onda de ressonância de pé 9. Nos biossensores ópticos descritos aqui, anomalias de madeira são utilizados para produzir um biossensor RWG que, quando estimuladas com luz branca reflecte apenas a banda estreita de comprimentos de onda (tipicamente entre 850-855 nm). Biossensores individuais consistem de um material plástico de baixo índice de refracção, com uma estrutura de superfície periódica que é revestida com uma fina camada do material de dióxido de titânio dieléctrica de refracção elevado (TiO 2). Quando os biosensou é iluminada com uma fonte de luz de comprimento de onda larga, a grade óptica de cristais fotónicas reflecte uma estreita gama de comprimentos de onda da luz que é medida por um espectrofotómetro no scanner BIND. O pico de intensidade dos comprimentos de onda reflectidos (Comprimento de onda de pico do valor, ou PWV) é então calculado a partir do sinal. O VOP de luz muda sobre uma alteração no índice de refracção, como resultado de um aumento ou diminuição da massa dentro da proximidade (~ 150 nm) da superfície do biossensor. Biossensores ópticos são incorporados numa Sociedade padrão de Ciências Biomolecular (SBS) de 384 poços de microplacas para os ensaios utilizados nestas experiências. Biossensores RWV são usadas para detectar alterações com a adição de sinais exógenos em células vivas 10. As células são cultivadas directamente sobre a superfície de um biossensor RWG e a mudança no índice de refracção do local é monitorado por meio de tratamento com estímulos específicos. A direção da mudança em massa no biosensor pode serdeterminada, porque o aumento do índice de refracção locais de resultados de um aumento da massa próximo do biossensor e é medido como um aumento na VOP. Inversamente, uma redução na massa produz uma diminuição na VOP. A mudança na VOP detectado pode ser resultado de vários eventos celulares, incluindo mudanças na adesão celular, proteínas de recrutamento / release, endocitose e reciclagem, exocitose, apoptose e do citoesqueleto rearranjo. Por exemplo, o ensaio pode ser detectar alterações em interacções proteína-canais entre os canais de potássio e outros componentes citoplasmáticos ou do citoesqueleto. O caso, no entanto, deve ocorrer dentro da zona de detecção nm ~ 150 perto do biossensor, e, no caso de uma célula em anexo, perto da membrana do plasma. Aquisição de respostas celulares é realizada com software BIND Scan e uma representação da imagem de cada um dos 384 poços na placa de SBS é gerado. Este sistema tem uma resolução de até 3,75 mM / pixel, permitindo a detecção de eventos em células isoladas, epode ser utilizado, quer com linhas celulares (tais como células CHO ou HEK293) ou com mais fisiologicamente relevante células primárias. A análise de imagem com o BIND Ver software permite a detecção de respostas celulares, tanto individual e as populações de células. Como os biosensores são incorporados padrão SBS microplacas de 384 poços, o sistema é facilmente adaptável para rastreio de alto rendimento (HTS). Ressonância comprimentos de onda ópticos ralar biossensores foram previamente usados ​​para detectar alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a ativação de GPCRs 11. O nosso laboratório clonou dois canais de potássio (K Na) ativado em sódio, Slack-B e Slick 12. A actividade de ambos os canais Slack-B e liso tem sido demonstrado ser muito fortemente influenciados pela activação directa de proteína quinase C (PKC) 13. A activação dos receptores acoplados à proteína q Gu, tais como o receptor muscarínico M1 e o mGluR1 metabotrópicos de glutamato receptor, potente regula a atividade do canal por meio da ativação da PKC. Estes canais de K de Na contribuir para a adaptação neuronal durante a estimulação prolongada e regular a precisão de tempo de potenciais de ação 14. Slack canais são conhecidos por interagir com uma variedade de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas, incluindo FMRP, a proteína X frágil Mental Retardation 15,16. Mutações no resultado Slack em vários Migrando crises parciais de Infância (MMPSI), uma forma de início precoce da epilepsia o que resulta em atraso grave de desenvolvimento 17.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>L-15 de Leibovitz Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticina G-418 Sulfato</td><td>Bioanalítico Americano</td><td>AB05057</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de carbamoilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Sal de trifluoroacetato SFLLR-NH2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8701</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette (5-50 &micro; l)</td> Sistema de scanner <td>Thermo Scientific</td><td>4662090</td><td></td></tr><tr><td>BIND</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>384 poços TiO><2 placas revestidas</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>TiO-96-CM</td><td></td></tr></tbody></table>

o uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por g receptores acoplados à proteína

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Canais iônicos controlar as propriedades elétricas dos neurônios e outros tipos de células excitáveis, permitindo seletivamente íons a fluir através da membrana plasmática 1. Para regular a excitabilidade neuronal, as propriedades biofísicas de canais de iões são modificadas por proteínas e moléculas de sinalização, o que muitas vezes se ligam aos próprios canais de modo a formar um complexo do canal heteromérico de 2,3. Ensaios tradicionais que examinam a interacção entre os canais e as proteínas reguladoras requerem rótulos exógenos que podem potencialmente alterar o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo, enquanto proporciona pouca informação sobre o curso de tempo de interacções em células vivas. Biossensores ópticos, como o sistema X-CORPO Biociências BIND Scanner, usar uma tecnologia sem rótulo novela, ressonância comprimento de onda grade (GRT) biossensores ópticos, para detectar mudanças na luz refletida ressonante perto do biossensor. Este ensaio permite a detecção da relativaalterar em massa no interior da porção inferior das células vivas aderentes à superfície do biossensor, resultante do ligando alterações induzidas na adesão celular e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação, e as alterações nas interacções proteína-proteína, perto da membrana do plasma. RWG biossensores ópticas têm sido utilizadas para detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a activação de receptores acoplados à proteína (GPCRs), tirosina-quinases receptoras, e os outros receptores da superfície celular. As alterações induzidas pelo ligando de iões de interacções proteína-canal também pode ser estudada utilizando este ensaio. Neste artigo, vamos descrever o procedimento experimental usado para detectar a modulação da Slack-B potássio ativado por sódio (Na) K canais por GPCRs.

Slack-B transfectadas estavelmente células HEK-293 transfectadas e controlam as células HEK-293 foram semeadas a 1000 células / poço em 384 bem-ECM, placas revestidas com biossensores RWG. Imagens da central de 1,5 milímetros 2 do biossensor foram gravadas com uma resolução de 3,75 mM / pixel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após adição composto com o software BIND Scan. O BIND Ver software foi utilizado para determinar a mudança de VOP em ...

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a modulação de receptores acoplados à proteína G por canais de potássio, utilizando biossensores ópticos sem marcação baseados na gradação de comprimento de onda de ressonância para alcançar esse objetivo. Células HEK 293 não modificadas e células HEK 293 que expressam estavelmente o canal de potássio ativado por sódio do rato slack B são semeadas em uma placa de biossensor óptico de 384 poços e incubadas durante a noite. Em seguida, é realizada uma medição de linha de base da massa próxima à membrana plasmática e agonistas de receptores acoplados à proteína G endógenos ou GPCRs são adicionados. Como etapa final, a alteração no sinal resultante da ativação do GPCR é medida e a modulação do canal de potássio nesta resposta é calculada.Por fim, este método pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de neurociência e sinalização celular, ao medir quantitativamente os mecanismos de sinalização entre receptores acoplados à proteína G e canais de potássio. As principais vantagens do uso desta técnica em comparação com os métodos atualmente existentes para analisar as interações entre canais e proteínas, por exemplo, ensaios

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador...

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

Fonte: Josiah, S. S., et al. Estudo das funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2 usando Western Blotting.  J. Vis. Exp. (2022). O vídeo demonstra as etapas para detectar e quantificar a proteína cotransportador 2 de cloreto de potássio fosforilada (KCC2) em um lisado celular. Este processo envolve imunoprecipitação para isolar KCC2 fosforilada e quimioluminescência para quantificar a proteína isolada.

Detecção de Cotransportador 2 de Cloreto de Potássio Neuronal Fosforilado via Western Blotting

A comunicação inter-celular é crítico para controlar várias actividades fisiológicas dentro e fora da célula. Este documento descreve um protocolo para avaliar a natureza espaço-temporal de secreção das células individuais. Para conseguir isso, uma abordagem multidisciplinar é usado que integra livre-label nanoplasmonic sentindo com imagens de células vivas.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.

Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

Aprenda a usar biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação de canais de potássio por receptores acoplados à proteína G em células HEK 293 vivas. Este método avança a neurociência.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Explorar mais vídeos