O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a modulação de receptores acoplados à proteína G por canais de potássio, utilizando biossensores ópticos sem marcação baseados na gradação de comprimento de onda de ressonância para alcançar esse objetivo. Células HEK 293 não modificadas e células HEK 293 que expressam estavelmente o canal de potássio ativado por sódio do rato slack B são semeadas em uma placa de biossensor óptico de 384 poços e incubadas durante a noite. Em seguida, é realizada uma medição de linha de base da massa próxima à membrana plasmática e agonistas de receptores acoplados à proteína G endógenos ou GPCRs são adicionados. Como etapa final, a alteração no sinal resultante da ativação do GPCR é medida e a modulação do canal de potássio nesta resposta é calculada.

Por fim, este método pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de neurociência e sinalização celular, ao medir quantitativamente os mecanismos de sinalização entre receptores acoplados à proteína G e canais de potássio. As principais vantagens do uso desta técnica em comparação com os métodos atualmente existentes para analisar as interações entre canais e proteínas, por exemplo, ensaios de co-precipitação, são que o ensaio pode ser realizado utilizando células vivas e não requer o uso de marcadores exógenos, que poderiam alterar a estrutura da proteína interagente.

E, finalmente, dentro das células vivas, é possível acompanhar as interações em tempo real. Embora este método possa fornecer informações sobre a sinalização entre receptores acoplados à proteína G e canais de potássio, ele também pode ser utilizado para estudar respostas celulares resultantes de alterações induzidas por ligantes na adesão e espalhamento celular, toxicidade, proliferação, migração e quaisquer mudanças na proximidade da membrana plasmática em relação ao biossensor óptico.

A técnica também possui potencial para ser utilizada na descoberta de novas abordagens terapêuticas para doenças causadas por anormalidades em canais iônicos ou receptores, como muitas canalopatias, pois pode ser empregada como um método de alto rendimento para testar os efeitos de agentes farmacológicos sobre proteínas de canal. Interações proteicas. Tivemos inicialmente a ideia de usar este método quando percebemos ser necessário desenvolver um ensaio capaz de analisar interações de proteínas de canal em células vivas.

Inicie o revestimento da placa óptica de biossensor de 384 poços hidratando uma placa de dióxido de titânio com 20 microlitros por poço de água estéril, grau para cultura de tecidos, durante 15 minutos. Em seguida, utilize uma pipeta de 16 canais para lavar a placa uma vez com 50 microlitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS por poço.

Em seguida, adicione 20 microlitros de uma solução-estoque preparada de fibronectina a cada poço antes de incubar por duas horas à temperatura ambiente para criar a matriz extracelular ou ECM. Após a incubação, lave a placa uma vez com 50 microlitros de PBS por poço e, então, adicione 40 microlitros de uma solução-estoque preparada de ovalbumina a cada poço.

Incube bem a placa durante a noite a quatro graus Celsius para bloquear a placa após a ligação da ovalbumina. Lave a placa três vezes com 50 microlitros de PBS por poço. As placas revestidas com ECM podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até quatro oito horas.

Remova o meio de crescimento de células HEK 293 não ressecionadas e de células HEK 293 que expressam estavelmente o Slack B, cultivadas conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione tripsina para destacar as células da placa. Colete as células em centrífuga a 1000 vezes a gravidade por um minuto.

Remova o meio de tripsina e ressuspenda as células no meio de crescimento. Usando um hemocitômetro ou um contador automático de células, determine a concentração das células para minimizar os efeitos da evaporação durante a incubação; dilua as células para atingir o número desejado de células por poço. Em um volume de 50 microlitros de meio de crescimento para estes experimentos, 1000 células por poço.

Foram semeadas sobre o biossensor após pipetar 50 microlitros das células diluídas para cada poço, permitindo que as células aderidas fossem incubadas durante a noite em meio de crescimento a 37 graus Celsius, 5%CO2. Para preparar o ensaio do biossensor óptico por gradiente de comprimento de onda de ressonância ou RWG. Remova o meio de crescimento das células após a incubação.

Lave as células uma vez com solução salina balanceada de Hank e, em seguida, adicione 25 microlitros da solução a cada uma. Coloque a placa de biossensor no leitor e deixe as células equilibrarem à temperatura ambiente por uma a duas horas. Enquanto isso, prepare uma placa separada de compostos da qual os ligantes de interesse serão adicionados à placa de biossensor durante o ensaio.

Para esses ensaios, adicionaram-se 25 microlitros de solução contendo o composto a cada poço da placa de biossensor, atingindo um volume total de 50 microlitros. Para realizar o ensaio de biossensor óptico RWG, obtenha uma medição de linha de base com o sistema de scanner para os poços de A1 a P12, que representam metade da placa de 384 poços. Utilize uma resolução máxima de 3,75 micrômetros por pixel para os 1,5 milímetros centrais de cada poço, usando o software de varredura por ligação. Essa varredura de linha de base levará aproximadamente 30 minutos.

Em seguida, adicione 25 microlitros das soluções do composto a cada poço dos poços A1 a P12. A seguir, realize uma medição de linha de base dos poços A13 a P24. Após a linha de base desses poços, adicione 25 microlitros das soluções do composto a cada um dos poços A13 a P24.

Como etapa final, realize uma medição pós-edição do composto para os poços de A1 a P12 e repita para os poços de A13 a P24. Para analisar os dados do ensaio, abra os dados do ensaio de ligação para a medição de linha de base no Windows e clique no botão do editor de grade para habilitar a seleção de células. O software calculará as métricas de interesse definidas pelo usuário; abra os plugins, que incluem o localizador de células, e defina os parâmetros de função no localizador de células para que as células sejam distinguíveis do fundo do biossensor.

Exporte o arquivo de mapa de células, que contém os dados do localizador de células para a medição basal. Repita esses passos para os dados após a adição do composto. Em seguida, abra a base ou plugin e importe o mapa de células da medição basal.

O software calculará o deslocamento no valor do comprimento de onda de pico ou PWV entre os dados de fundo e os dados pós-composto. Selecione delta médio da célula para a saída do deslocamento médio em PWV para as células. Os dados podem então ser exportados para o Microsoft Excel para análise adicional.

Células HEK 293 estavelmente transfectadas com Slack b e células HEK 293 de controle não transfectadas foram semeadas a 1000 células por poço em placas de biossensor RWG com revestimento ECM de 384 poços. Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após a adição do composto com a varredura de ligação.

As áreas do software mostradas em vermelho representam pixels identificados como pertencentes a células, e as linhas amarelas distinguem as células do fundo cinza da placa. O software bind view foi utilizado para determinar a alteração na PWV após a adição do agonista do RCPG, subtraindo a PWV pós-adição do composto da PWV basal. Isso é mostrado por um gradiente de cores em que o vermelho representa um aumento positivo no valor do comprimento de onda de pico e o azul representa nenhuma alteração.

O receptor muscarínico endógeno M1 frente à carbacol foi aplicado tanto a células HEK 293 controle não ressecionadas quanto a células HEK 293 que expressavam estavelmente o slack B, resultando em um aumento positivo no valor do comprimento de onda de pico em comparação com as células controle. As células transfectadas com slack B apresentaram um aumento maior no valor do comprimento de onda de pico. O peptídeo pentapeptídico ativador do receptor de trombina com sequência S-F-L-L-R NH₂, sal de trifluoroacetato, e o peptídeo ativador do receptor de protease terminal N, que exibe atividade agonista frente ao receptor acoplado à proteína G (GPCR) ativado por protease um, também mostraram respostas diferenciais em células não ressecionadas e células transfectadas com slack B.

Esses resultados mostram que a presença do canal Slack B aumenta significativamente a alteração na velocidade de onda de pulso (PWV) que ocorre após a ativação do receptor acoplado à proteína G endógeno nas células K, e demonstram a viabilidade de usar este ensaio para estudar interações entre proteínas canais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver e realizar um ensaio de biossensor óptico livre de marcadores. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada ao longo de dois dias, desde que as células e reagentes tenham sido preparados com cuidado durante a tentativa deste procedimento.

É importante lembrar que os parâmetros do ensaio, como o número de células a serem semeadas, o tempo de incubação dos ligantes, entre outros, devem ser otimizados para diferentes linhagens celulares. Após realizar este procedimento, você pode utilizar outros métodos, como R e IA, para tentar determinar quais proteínas específicas são necessárias para a alteração observada no sinal. Não se esqueça de que trabalhar com culturas celulares humanas pode ser extremamente perigoso, e precauções, como trabalhar em uma cabine de segurança biológica, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.