Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

O objetivo geral deste procedimento é utilizar o sistema de cultura tridimensional como um meio de distinguir o fenótipo benigno da mama do fenótipo maligno da mama. Isso é feito primeiro plaqueando as células de controle e experimentais em triplicados em uma camada de matrigel reduzido por fator de crescimento em uma lâmina de câmara de oito poços. O segundo passo é dar novas mudanças completas de mídia com 2% de GFR Matrigel a cada quatro dias, permitindo que as colônias semelhantes a asininas cresçam por 10 a 15 dias.

Em seguida, as imagens de contraste de fase do aser como colônias cultivadas em 3D são adquiridas em uma resolução de cinco vezes. A etapa final é processar as culturas semelhantes a aser para análise imunocitoquímica com marcadores moleculares relevantes, seguido pela aquisição de imagens confocais de em C duas colônias semelhantes a aser de coloração imunológica no meio. Em última análise, o contraste de fase e as imagens confocais das células cultivadas em cultura 3D são usados para identificar alterações fenotípicas e moleculares celulares e, assim, diferenciar as células benignas da mama das células malignas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como culturas bidimensionais, ensaios de invasão ou migração, é que ela pode recapitular a arquitetura do tecido da mama benigna e sua perda de organização durante a transformação maligna. Assim, essa técnica pode ser efetivamente usada para diferenciar as células benignas da mama das células malignas da mama. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de mama, como defeito das vias de sinalização no fenótipo celular e na identificação de novas vias oncogênicas e/ou supressoras de tumor.

Para iniciar o experimento, descongele o fator de crescimento reduzido ou o matrigel TFG a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, aqueça o meio HME completo a 37 graus Celsius e coloque uma lâmina de câmara de oito poços no gelo para esfriar. Adicione 40 microlitros de GFR Matrigel ao centro de cada poço da lâmina pré-resfriada.

Espalhe o gel o mais uniformemente possível usando uma ponta de pipeta P 200, evitando bolhas e espalhamento excessivo, o que pode levar à formação de menisco. Em seguida, solidifique o gel matri incubando a lâmina a 37 graus Celsius e 5% CO2 enquanto o gel matri solidifica os olhos de tripsina, as células HME, colete-as em um tubo de 15 mililitros e gire as células a 150 vezes a gravidade por quatro minutos, conte as células e dilua-as para 12.500 células por mililitro. Em meios completos, adicione o matrigel GFR à suspensão celular a uma concentração final de 2% e adicione 400 microlitros da solução a cada poço da lâmina da câmara pré-codificada.

Em seguida, coloque a lâmina em uma incubadora com tamponamento de CO2. Substitua a mídia por uma nova mídia completa a cada quatro dias por 15 dias. Para estudos com inibidores, adicione inibidores de moléculas pequenas ao meio completo no momento da plaqueagem, seguido por mudanças de meio fresco suplementadas com os inibidores a cada três dias para iniciar o crescimento de células e triplicados para cada conjunto de tratamento.

Tire imagens de contraste de fase de estruturas aser de cada poço com resolução de cinco x usando um microscópio de contraste de fase conectado a um deslocador de slides e um computador. Tire as imagens movendo o slide de um quadro para outro, cobrindo todo o poço do slide com câmara. Conte o número total de estruturas aser, o número de asininas planas redondas únicas e o número de estruturas multi aser ou estruturas de crescimento aleatório sem organização.

E com processos de ramificação emanados, calcule a porcentagem de estruturas aser planas de rodada única versus estruturas malignas e plote as informações. Como um gráfico de colunas. Calcule a significância pelo teste T de Student não pareado bicaudal.

Prepare os reagentes para a coloração por imunofluorescência conforme descrito no protocolo de texto que acompanha o texto. Em seguida, use uma pipeta P 200 para aspirar cuidadosamente o meio condicionado. Em seguida, fixe o ASIN ou estruturas com formaldeído de 2% para recém-preparado à temperatura ambiente por 20 minutos após a fixação, permeie as células com 0,5% tritton X 100 por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave as culturas três vezes com glicina a 100 milímetros por 10 a 15 minutos para cada lavagem. Em seguida, bloqueie as células no buffer de bloco primário por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube as culturas em 20 microgramas por mililitro de cabra anti-rato fab dois fragmentos em tampão de bloco primário, também chamado de segunda solução de bloqueio por 30 minutos para bloquear as espécies de IgG de camundongo de reação amino no matrigel.

Após o bloqueio, incube as células com anticorpo primário na segunda solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as células três vezes com tampão de imunofluorescência ou tamponamento com balanço suave por 10 a 15 minutos para cada lavagem. Em seguida, incube as células com anticorpos secundários conjugados fluorescentes em tampão if F por 45 minutos.

Em seguida, lave as células três vezes por 10 minutos cada com tampão if F e balanço suave. Monte as lâminas com DPI contendo reagente antidesbotamento para visualizar os núcleos. Deixe as lâminas secarem durante a noite à temperatura ambiente.

Em seguida, adquira imagens confocais na seção intermediária da colônia de células que crescem no topo do matrigel e uma série de seções ópticas em todo o comprimento da estrutura de asner empilhando z de células de knockdown controladas por HME coradas com DPI e C CN seis no quinto dia mostram que as células knockdown carecem de organização. No dia 15, as células de controle são interrompidas com ASIN ou estruturas diferenciadas e lúmen bem definido divergindo das células knockdown, que apresentam um fenótipo tubular e ramificado invasivo. A coloração imunofluorescente mostra a perda de expressão de laminina v alfa seis integrina e herrina ECA, indicando a ruptura da membrana basal, perda de polaridade basal e contato celular com células, respectivamente.

Em células malignas, as células de controle exibem uma camada intacta ao redor da expressão basal asinina de alfa seis, integrina, expressão apical de GM um 30 e eca. Aqui na junção celular celular, o fenótipo maligno de CCN seis células HME knockdown foi revertido com tratamento exógeno de CCN humano recombinante purificado seis proteínas duas linhas de células mamárias altamente metastáticas, cerca de 1 49 e M-D-A-M-B 2 31. Foram tratados com inibidores de P 38 map quinase, SB 2 0 3 8 50 e SB 2 0 2 1 90, que reduziram o comportamento maligno.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar células mamárias em cultura 3D e usar efetivamente o crescimento semelhante ao sino no matrigel como uma leitura para diferenciar os fenótipos benignos dos malignos das células mamárias