Neonatal Pial Superfície Eletroporação

O objetivo geral deste procedimento é rotular e manipular geneticamente os progenitores neurais da superfície da casca. Isso é feito inserindo primeiro uma pipeta de vidro cheia de solução de DNA de plasma na região da superfície da casca. O segundo passo é injetar o DNA no espaço meníngeo, sobrepondo a superfície da casca.

Em seguida, os eletrodos são orientados para fornecer corrente adequadamente à superfície da casca. A etapa final é que o DNA é eletroporado em progenitores de superfície de casca pela aplicação de corrente. Em última análise, este método pode ser combinado com outras técnicas para mostrar a história natural e os determinantes moleculares da superfície da casca, proliferação de progenitores neurais, migração e/ou diferenciação.

As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a transdução viral, é que a eletroporação é mais segura, mais flexível e não requer a criação de partículas ou embalagens virais. Este método pode responder a questões-chave no campo das células-tronco neurais e progenitoras, como qual é a contribuição desses progenitores da superfície da casca para o tecido, histogênese e função do circuito neural. Para começar, use um extrator de pipetas para formar pipetas a partir de tubos capilares de vidro, uma vez puxados, corte a ponta com uma tesoura afiada.

Em seguida, prepare uma solução de estoque verde rápido a 1% usando água filtrada sem nuclease. Depois de diluir o tampão EDTA de interesse do DNA plasmático livre de endotoxinas, combine-o nas proporções apropriadas para a solução verde rápida a 1%. Usando uma pipeta padrão, coloque a quantidade desejada de mistura de plasmídeo a ser injetada em um pedaço de filme de cera de parafina para referência.

Em seguida, usando um microinjetor, insira cuidadosamente a pipeta de vidro montada no tubo que contém a mistura de plasmídeo. Evite tocar a ponta nas bordas do tubo para evitar quebrar. Aspire a solução para a pipeta discando lentamente o botão de transferência.

Uma vez que um volume suficiente tenha sido carregado, disque para frente até que a pressão retorne à posição neutra de zero. Hector Pascals. Em seguida, coloque a ponta ao lado da injeção de referência e use o pedal do microinjetor para ejetar um volume.

Ajuste a pressão até que a quantidade seja igual ao volume de referência pipetado anteriormente. Depois de calibrar o volume de injeção, recupere os animais para injeção de plasmídeo. Uma vez confirmada a profundidade da anestesia, segure o filhote usando o polegar e o indicador da mão menos dominante.

Use a mão dominante para atingir a região desejada, os hemisférios corticais e outras estruturas superficiais, como os colículos superiores, devem ser facilmente visíveis. Uma vez identificado o local correto, insira a pipeta além da pele e do crânio. Tomando cuidado para evitar artérias cerebrais.

Para atingir a superfície da casca, pare imediatamente de avançar a pipeta Assim que o crânio for penetrado com a ponta da pipeta na posição correta, injete a solução de plasmídeo usando o pedal do microinjetor Após a injeção, remova cuidadosamente a pipeta. Evite que a ponta seque e entupa entre as injeções, colocando-a nas gotículas de teste localizadas no filme de parafina. Repita essas etapas até que todos os filhotes sejam injetados para aumentar a condutância e evitar queimaduras na pele.

Cubra TROs de pinça de platina de três milímetros com gel de eletroporação. Em seguida, ajuste as configurações elétricas para injeções no córtex. Coloque a sonda carregada negativamente sobre a área injetada e a sonda carregada positivamente ao redor da região contralateral abaixo do olho.

A orientação do eletrodo deve estar em um ângulo de 45 a 60 graus em relação à linha média. Use o pedal para acionar a corrente e segure os TROs da pinça no lugar por três a cinco pulsos. Dependendo da idade e do peso do filhote, os pulsos devem direcionar o DNA para as células da superfície da casca subjacentes.

O pólo negativo pode ser varrido sobre a área de injeção. Entre os pulsos ou um eletrodo maior pode ser empregado para aumentar a área elétrica imediatamente após a eletroporação, limpe cuidadosamente o gel dos filhotes e coloque-os sob uma lâmpada de calor por aproximadamente cinco minutos. Os filhotes perderão agudamente seu dedo mindinho avermelhado natural nos minutos após a eletroporação devido à cianose.

Observe os filhotes para a recuperação da cor natural e o início do movimento normal antes de devolvê-los às gaiolas ou injeções no cólus superior. Localize a região alvo logo posterior e lateral ao Lambda e aproximadamente na linha média, seguindo os mesmos passos que acabamos de demonstrar. Com injeções bem-sucedidas, a mistura de plasmídeo preenche naturalmente os contornos do cólus superior.

Quando o eletro operar após injeções de colus superior, coloque a sonda carregada negativamente do eletrodo sobre a área injetada e a sonda carregada positivamente ao redor do olho, focinho ou queixo. Nesse caso, a orientação do eletrodo está em um ângulo de 25 a 40 graus em relação à linha média. Esta imagem mostra o córtex lateral dorsal após eletroporação de plasmídeos repórteres fluorescentes expressando trevo marcado com membrana em verde e tag bfp.

Duas proteínas nucleares mostradas aqui em pseudocor vermelha. Dendritos extensos são encontrados neste interneurônio cortical cerca de dois meses após a eletroporação. As células positivas para EGFP são BRDU positivas, indicando que estavam proliferando durante o procedimento de eletroporação.

Ao tentar esta técnica, é importante se concentrar no direcionamento adequado da superfície da casca, a fim de evitar a ruptura do córtex subjacente e/ou vasculatura.