Engenharia de Tecidos de tumor estromal Microenvironment com Aplicação a invasão Cancer Cell

O objetivo geral do procedimento a seguir é gerar uma matriz nativa de fibroblastos para avaliar a invasão de células tumorais. Isso é feito primeiro pelo cultivo de fibroblastos em plástico em um meio enriquecido com ácido sórbico para gerar a matriz nativa. Na segunda etapa, a matriz nativa é destacada e liberada da superfície plástica de crescimento e, em seguida, essa matriz é semeada com células tumorais e levantada para a interface ar-líquido após um período fixo.

Essas culturas 3D são colhidas para análise histológica da invasão de células tumorais. Em última análise, os efeitos da matriz nativa de fibroblastos na invasão de células tumorais podem ser avaliados por análise imunohistológica. Portanto, a vantagem dessa técnica para gerar culturas típicas 3D é que podemos avaliar a matriz nativa produzida pelos próprios fibroblastos na ausência de substratos sintéticos ou estranhos, como colágeno tipo um de espécies cruzadas Comece semeando 200.000 fibroblastos por poço em seis placas de poço em meio de fibroblasto, suplementado com ácido IC recém-preparado.

Dois fosfatos refeçam as células a cada dois a três dias com dois a cinco mililitros de meio fresco. Uma espessa camada de células embutidas na matriz extracelular visível a olho nu se formará ao final de seis semanas. Dependendo das células usadas, a matriz visível pode se formar mais cedo ou mais tarde e pode começar a se desprender do prato, como visto aqui.

Para liberar essa camada da placa de cultura de tecidos, raspe suavemente a circunferência da matriz com uma ponta de micropipeta de um mililitro e, em seguida, empurre as bordas da matriz em direção ao centro do poço. As células e a matriz nativa devem se desprender facilmente da superfície da placa e agora flutuar no meio. Espalhe a matriz nativa na mídia para evitar que ela se dobre.

Deixe a matriz nativa flutuar e remodelar por cinco dias, continuando a trocar a mídia a cada dois ou três dias devido à resistência à tração e remodelação intrínseca. A matriz se contrairá drasticamente e será reduzida a uma matriz nativa menor, mas mais espessa, momento em que estará pronta para ser utilizada. Para o ensaio de invasão.

Para o ensaio de invasão. Primeiro, use uma pinça romba para transferir a matriz nativa suavemente para uma rede de náilon. Uma vez na rede, use uma ponta de micropipeta de um mililitro e uma pinça romba para espalhar suavemente a matriz para ficar o mais plana possível.

Em seguida, espalhe uma pequena quantidade de vaselina em uma extremidade de um cilindro clonal estéril por matriz. Em seguida, coloque os cilindros nas matrizes nativas com o lado da vaselina voltado para baixo para garantir uma vedação firme entre a matriz nativa e os anéis clonais. Agora adicione 250.000 células cutâneas de carcinoma espinocelular ou células SCC em meios de crescimento no local do quilate aos cilindros.

Depois que as células cutâneas do SCC se estabelecerem na matriz nativa, remova os cilindros e, em seguida, levante a matriz nativa da rede de náilon e as células SEC cutâneas para a interface ar-líquido e em um suporte de malha de arame de aço inoxidável dobrado. Por fim, adicione meio de crescimento de queratinócitos, suplementado com ácido sórbico até que o nível do meio toque o fundo da matriz nativa, trocando o meio a cada dois a três dias e colhendo sete e 14 dias após a semeadura das células cutâneas do CCS. Esta técnica abre a possibilidade de examinar e comparar o comportamento invasivo das células tumorais sob diferentes ambientes estromais 3D.

Como visto nessas imagens, a invasão dos queratinócitos cutâneos do CEC do EBDR foi significativamente retardada em C sete, superexpressando matrizes nativas nos painéis à direita em comparação com os controles com EBDR deficientes em C sete nos painéis à esquerda. O desenvolvimento desta técnica permitiu aos pesquisadores avaliar diretamente a influência da Matriz Nativa produzida pelos fibroblastos em processos de células tumorais como a invasão.