Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

O objetivo geral do vídeo a seguir é apresentar uma abordagem de registro de imagens para histologia tridimensional, com reconstrução de volume para estudar alterações na macroestrutura celular da glândula mamária. Para isso, glândulas mamárias são removidas de camundongos três dias após o início da lactação em camundongos selvagens e camundongos nulos para a proteína ligadora do fator de crescimento semelhante à insulina sete, IGF BP sete. As glândulas são então processadas e emblocadas em parafina para seccionamento.

Em seguida, são capturadas imagens do bloco óptico da face do tecido e o bloco de tecido é seccionado. São obtidas imagens das seções e, com o auxílio de um software personalizado, cada seção é alinhada à sua imagem correspondente da face do bloco para reconstruir o volume histológico da glândula mamária. Os dados resultantes destacam as diferenças de tamanho entre glândulas mutantes e do tipo selvagem.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal tridimensional de dupla varredura, é que ela fornece informações em uma extensão espacial muito maior. Este método também pode ser utilizado para investigar e validar novas técnicas e algoritmos em imagens médicas volumétricas e terapias, bem como para criar análises tridimensionais de alta resolução de diferentes órgãos. Este volume de histologia reconstruído retrata uma representação confiável do espécime analisado, sem erros de registro propagados.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que camundongos nulos para IGF P sete apresentam ninhadas menores e são incapazes de sustentar múltiplas ninhadas de grande porte, o que nos levou a investigar a estrutura de suas glândulas mamárias. Uma vez que o tecido esteja embutido em parafina, utilize um micrótomo rotativo para aparar o bloco até que a parafina em excesso seja removida. Em seguida, utilizando uma fresadora vertical, faça furos de um milímetro em pelo menos dois cantos do bloco de parafina, perpendicularmente à cassete, e monte o bloco de tecido no micrótomo rotativo.

Em seguida, para montar o sistema de imagem da superfície do bloco em frente ao micrótomo, posicione uma câmera com lente teleobjetiva em um ângulo ligeiramente inclinado em relação à superfície do bloco de tecido. A câmera deve estar conectada a um computador posicionado em frente ao micrótomo. Em seguida, posicione uma fonte de luz em frente ao bloco, de modo que a câmera capture o reflexo da luz proveniente do bloco.

Ajuste o ângulo da câmera até que o tecido na superfície do bloco seja facilmente distinguido da parafina ao redor. Capture uma imagem óptica da face do bloco. Em seguida, utilizando o micrótomo, corte fitas de quatro seções, com cinco micrômetros de espessura.

Transfira as fitas para um banho de água fria, separe as seções da fita e, em seguida, retire com uma colher as segunda e quarta seções da água fria para um lâmina. Transfira-as para um banho de água morna para desamassá-las. A escolha das segunda e quarta seções fornece uma lacuna de cinco mícrons entre as seções.

Uma vez desamassadas, remonte as seções nos lâminas do microscópio por escavação. Como antes, observe que o corte, o montagem e o desamassamento das seções podem causar algumas distorções, como rasgos, dobras, retração e expansão. Esses artefatos complicam o registro das seções histológicas.

Cubra os cortes com hematoxilina e eosina utilizando um colorador automático. Em seguida, monte as lâminas com lamínulas utilizando um cubrissector automático e, com um escâner digital de lâminas de histologia, digitalize as lâminas na resolução desejada. Para este protocolo, a ampliação é de 20 x e a resolução é de 0,47 mícrons.

Esta seção do vídeo apresenta uma visão geral do processo de registro de imagens, que é realizado utilizando um software personalizado desenvolvido em nosso laboratório combinado com MATLAB c plus plus. Utilizando o ITK, comece por subamostrar as imagens de histologia até a resolução das imagens de superfície do bloco. Isso reduzirá as imagens de histologia por um fator de 0,026.

Em seguida, para a segmentação de imagem e seleção de pontos, abra algumas imagens de superfície de bloco no MATLAB e utilize a ferramenta de cursor de dados para medir os valores dos pixels dos orifícios de registro. Utilize o valor médio dos pixels como um limiar fixo para segmentar os orifícios de registro. Para remover os segmentos extras, utilize a circularidade e a área dos objetos segmentados para manter os orifícios e eliminar os segmentos adicionais.

Em seguida, para cada glândula mamária, selecione uma imagem da face do bloco como referência. Alinhe os centros dos orifícios de registro das demais imagens das faces dos blocos aos centros dos orifícios de registro da imagem de referência. Em seguida, utilizando as transformações obtidas para os orifícios de registro, alinhe manualmente as imagens das faces dos blocos e, para as imagens alinhadas, delimite ou extraia o tecido do fundo para as seções h e d.

Utilize a técnica de limiarização OSU para segmentar as imagens do fundo e criar máscaras binárias das imagens de histologia. Em seguida, usando o histograma dos objetos rotulados, identifique e selecione o objeto de maior tamanho em cada máscara. Extraia os pontos de contorno com largura de um pixel das máscaras de histologia e da superfície do bloco.

Em seguida, utilize um algoritmo de descritores de Fourier para encontrar a transformação rígida inicial entre os pontos de contorno da histologia e suas imagens correspondentes da superfície do bloco. Essa transformação inicial inclui os fatores de translação, rotação e escala. Transforme cada imagem de histologia com a transformação inicial obtida no passo anterior.

Para aperfeiçoar o registro rígido, remova as seções das bordas de alta curvatura do contorno histológico utilizando um filtro de bola rolante. Em seguida, selecione aleatoriamente 500 pontos da distribuição uniforme dos pontos restantes do limite histológico. Transforme os pontos do limite histológico com a transformação inicial obtida a partir dos descritores de Fourier.

Utilize os pontos de contorno do bloco e use o algoritmo de pontos mais próximos iterativos para encontrar a transformação rígida entre os pontos de contorno do bloco, face e a histologia. Pontos de contorno aleatórios. Em seguida, transforme as imagens de histologia obtidas na etapa anterior para criar uma imagem visual do volume de histologia no software de visualização 3D.

Na Me vis lab, escolha os módulos, arquivos diversos e adicione o módulo compor 3D a partir de arquivos 2D. Em seguida, selecione imagem no menu e adicione o módulo converter propriedade da imagem. Por fim, adicione um módulo visualizar 3D a partir dos módulos de visualização 3D.

Clique duas vezes em compor 3D a partir de arquivos 2D para carregar as imagens e clique em criar 3D. Ajuste o tamanho do vóxel clicando duas vezes em converter propriedade da imagem e defina o tamanho do vóxel como 0,018 0,018 0,01. Visualize o volume clicando duas vezes em visualizar 3D.

Por fim, visualize a pilha de imagens em cinco vezes de ampliação seguindo as etapas descritas no documento em anexo. Para caracterizar melhor o défice, foi realizada a reconstrução tridimensional das glândulas mamárias do camundongo nulo para I-G-F-B-P sete conforme descrito aqui. Essas figuras mostram os volumes histológicos reconstruídos das glândulas mamárias do tipo selvagem e nulas.

Observe que a glândula mutante à direita é mais curta e mais estreita do que a selvagem à esquerda, mas possui aproximadamente a mesma profundidade, sendo a glândula selvagem de 1,06 milímetros e a glândula nula de 1,02 milímetros de profundidade. Além disso, note que as glândulas selvagens à esquerda apresentam pouco tecido estromal, indicado pela coloração rosa do eosina, enquanto as glândulas nulas à direita parecem ser predominantemente tecido estromal. Aqui, a coloração com hematoxilina, que identifica as células nucleadas, mostra que a glândula nula mantém sua densidade, enquanto a glândula selvagem parece conter principalmente estruturas glandulares.

Para investigar mais a fundo, imagens de maior resolução da área do linfonodo foram alinhadas aqui. São observadas grandes estruturas que teriam sido preenchidas com leite. Em contraste, a glândula nula para I-G-F-B-P sete apresenta poucas estruturas bem desenvolvidas.

Além disso, essas estruturas estão repletas de células semelhantes a fibroblastos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar uma reconstrução tridimensional de um órgão por meio da reconstrução de cortes seriados escaneados. Bom. Agora, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de nomear consistentemente as lâminas e os escaneamentos, pois haverá um grande número de ambos, e a organização sequencial é a chave para o sucesso ao seguir este procedimento.

Outros métodos, como imunohistoquímica para marcadores específicos de células e doenças, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, por exemplo, como a vasculatura permeia um tumor?