Name: Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a reconstruir volumes histológicos em 3D para estudar a macroestrutura celular de glândulas mamárias em camundongos. Este método de registro de imagens compara diferenças entre tipos selvagem e mutantes.

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Os autores gostariam de agradecer ao Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) do Sunnybrook Research Institute por seus serviços de histologia. O apoio para este trabalho foi fornecido pela Fundação Terry Fox, pela Fundação Canadense do Câncer de Mama - Prairie - NWT, bem como por uma doação do CIHR, #MOP-97996.

1. Espécime <ol><li> Especial sobre o consumo das glândulas mamárias cirurgicamente de tipo selvagem CDH1, bem como camundongos IGFBP7 nulo três dias após a início da lactação. </li><li> Espalhe as glândulas em lâminas de vidro para ajudar a recuperar a morfologia natural da glândula mamária. </li></ol> 2. Fixação e processamento de tecidos <ol><li> Corrigir as glândulas mamárias em neutro tamponado 4% PFA O / N a 4 o C. </li><li> Armazenar as glândulas em etanol a 70% antes do processamento do tecido. </li><li> Transferir as glândulas para pequenas cassetes de transformação de tecidos. </li><li> Processar os tecidos utilizando um processador automático de tecido <ol><li> Desidratar os tecidos no aumento de etanol e de xileno banhos de etanol a 70% durante 45 minutos, duas vezes em etanol a 95% durante 45 minutos, três vezes em etanol a 100% durante 1 hora e duas vezes em xilol durante 45 minutos. </li><li> Permear os tecidos com parafina 3 vezes para cada 1 hora em um vácuo com pressão aplicada. </li></ol></li><li> Incorporar os tecidos em parafina para formar blocos, Para o corte. </li></ol> 3. Histologia e Blockface Imagem <ol><li> Aparar os blocos de parafina utilizando um micrótomo rotativo até que o excesso de parafinas é removido. </li><li> Use uma fresadora vertical para perfurar um milímetro furos em pelo menos dois cantos do bloco de parafina perpendicular à fita. </li><li> Monte o bloco de tecido em micrótomo rotativo. </li><li> Configure o sistema de imagem blockface 19 na frente do micrótomo. </li><li> Capturar imagem blockface óptico antes da corte. </li><li> Corte tiras de quatro seções em 5 mM espessura no micrótomo. <ol><li> Transferir as fitas para o banho de água fria. </li><li> Separe as segunda e quarta partes da fita e cole-as em lâminas de microscópio. Escolhendo a segunda ea quarta seções fornece uma lacuna 5 mm entre as seções. </li><li> Expanda cada seção em um banho de água quente (48 º C) para unwrinkle-lo, em seguida, re-montar-lo na lâmina de microscópio. NOTA: Cutting, montagem, unwrinkling as seções causar algumas distorções no seção, como lágrima, dobra, contração e expansão. Esses artefatos complicar o registro dos cortes histológicos. </li><li> Mancha as seções com H &amp; E usando um corante automática. </li><li> Lamela os slides usando um coverslipper automática. </li><li> Digitalize os slides usando um scanner de slides histologia digitais na resolução de interesse. Para este protocolo a ampliação for 20x ea resolução é de 0,47 m. </li><li> Down-provar as imagens de histologia para a resolução das imagens blockface, 18 mM. </li></ol></li></ol> 4. Registro da Imagem <ol><li> Segmentação de imagem e ponto de Seleção <ol><li> Em blockface imagens medir os valores de pixel para os furos de registo e utilizar o valor médio como um limite fixo para o segmento de furos de registo nos cantos do bloco de parafina. </li><li> Uma vez que algumas peças adicionais também pode ser segmentado porutilizando o limiar fixo, utilizar a circularidade e a zona dos objectos segmentados para encontrar os furos e descartar os objectos adicionais. Para fazer isso, escrever um pequeno código e encontrar a relação de (4π x área) / (perímetro) 2 para os objetos segmentados. Esta relação de objetos redondos é 1. </li><li> Para cada glândula mamária, seleccionar uma imagem blockface como referência e alinhar o resto das imagens blockface para a referência, utilizando o centro dos furos de registo e de técnicas de registo baseados em marco. </li><li> Para as imagens blockface alinhados, o segmento manualmente ou extrair o tecido a partir do fundo. Use o objeto mais considerável na máscara para o resto do protocolo. </li><li> Para H &amp; E seções siga os passos abaixo para a segmentação automática. <ol><li> Use Otsu técnica limiar de 20 a segmentar imagens do fundo e criar máscaras binárias das imagens histológicas. </li><li> Identificar e selecionar o objeto mais considerável em cada máscara usando o histogram dos objectos etiquetados. </li><li> Extraia os um pixel de largura pontos de fronteira de ambos histologia e máscaras blockface. </li><li> Use o algoritmo de código Cadeia 21, para representar os pontos de fronteira por uma seqüência de linear por partes se encaixa. </li></ol></li></ol></li><li> Registro rígida inicial <ol><li> Use Descritores de Fourier algoritmo 22, para encontrar o inicial rígida transformar entre os pontos de fronteira de histologia e suas imagens blockface correspondentes. Este inicial transformar inclui os fatores translação, rotação e escala. </li><li> Transformar cada imagem histologia com a inicial transformada obtida no passo anterior. </li></ol></li><li> Refinamento do Registro rígida <ol><li> Remova as seções de alta ponta curvatura do contorno histologia usando um filtro bola rolar 23. </li><li> Selecione 500 pontos a partir dos pontos de fronteira de histologia restantes utilizando aleatoriamente distribuição uniforme. </li><li> Transformar o ahistologia pontos de fronteira aleatórios com a transformação inicial obtida a partir de descritores de Fourier. </li><li> Selecione o conjunto de blockface pontos de fronteira e usar iterativos pontos mais próximos (ICP) algoritmo 24 para encontrar a transformação rígida entre os pontos de fronteira blockface, destino e histologia pontos de fronteira aleatórios. </li><li> Transforme as imagens de histologia alinhados obtidos da etapa anterior e a pilha de imagens de histologia alinhados cria o volume histologia. </li><li> Use um software de visualização 3D para criar uma imagem visual do volume histologia. </li></ol></li><li> Visualizando a pilha de imagens com ampliação de 5x <ol><li> Down-provar as imagens histológicas originais 5x ampliação. </li><li> Cortar a região de interesse em uma das imagens de histologia. </li><li> Calcula-se a localização da região em outras imagens histológicas 5x utilizando a combinação das transformações rígidas das duas etapas de registo. </li><li> Corte a regions de interesse para a mesma região tamanho em todas as outras imagens histologia. </li><li> Finalmente refinar o alinhamento entre as regiões manualmente. Escreva um programa que se sobrepõe a duas imagens e permite selecionar os valores de rotação e translação de uma das imagens mais o outro e, em seguida, salva a imagem transformada quando o alinhamento é aceito. </li><li> Ver as pilhas de regiões histologia 5x alinhadas usando um software de visualização 3D. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sunkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Atlas%3A+An+integrated+spatiotemporal+port+for+exploring+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system.</a> Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).</li>
<li>Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Allen+Human+Brain+Atlas%3A+Comprehensive+gene+expression+mapping+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain.</a> Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).</li>
<li>Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).</li>
<li>Evdokimova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+binds+to+the+IGF-1+receptor+and+blocks+its+activation+by+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors.</a> Science Signaling. 5 (255), 92(2012).</li>
<li>Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+IGFBP-3+and+IGFBP-rP1+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer.</a> European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).</li>
<li>Amemiya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+like+growth+factor+binding+protein-7+reduces+growth+of+human+breast+cancer+cells+and+xenografted+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors.</a> Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).</li>
<li>Benatar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+reduces+breast+tumor+growth+by+induction+of+senescence+and+apoptosis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways.</a> Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).</li>
<li>Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBardinet%2C+E+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted+Intervention-Part+I%22">Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I</a>. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).</li>
<li>Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+and+warping+of+magnetic+resonance+images+to+histological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections.</a> Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).</li>
<li>Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registering+histologic+and+MR+images+of+prostate+for+image-based+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+radiology%22%5BJournal%5D)">Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection.</a> Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).</li>
<li>Dauguet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+stained+histological+slices+and+3D+non-linear+registration+with+in+vivo+MRI+for+whole+baboon+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).</li>
<li>Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+registration+using+needle+paths+and+point+landmarks+for+evaluation+of+interventional+MRI+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).</li>
<li>Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+registration+of+magnetic+resonance+image+data+to+histological+sections+with+model-based+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).</li>
<li>Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).</li>
<li>Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+M+%22Computational+Methods+in+Systems+Biology%22">Computational Methods in Systems Biology</a>. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).</li>
<li>Wu, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+microscopy+of+colorectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+multiple+stained+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of multiple stained histology images.</a> Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).</li>
<li>Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+histology+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Medical+Imaging.+7962%2C+79621E%2C+doi%3A10.1117%2F12.878762%22%5BJournal%5D)">Validation of histology image registration.</a> SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+thresholding+using+an+iterative+selection+method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Picture thresholding using an iterative selection method.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Freeman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+processing+of+line-drawing+images%5BTitle%5D)+AND+%22ACM+Computing+Surveys+%28CSUR%22%5BJournal%5D)">Computer processing of line-drawing images.</a> ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).</li>
<li>Giardina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+curve+approximation+by+harmonically+related+vectors+with+elliptical+loci%29%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Graphics+and+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci).</a> Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).</li>
<li>Shojaii, R., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+edge+point+selection+method+for+registration+of+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Tissue+Image+analysis+in+Microscopy%2C+Histopathology+and+Endoscopy.+%28OPTIMHisE%29+Workshop%2C+MICCAI%22%5BJournal%5D)">A novel edge point selection method for registration of histology images.</a> Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).</li>
<li>Besl, P., McKay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+registration+of+3-D+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">A method for registration of 3-D shapes.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).</li>
<li>Chatterjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Igfbp7+causes+precocious+involution+in+lactating+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland.</a> PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).</li>
<li>Manjunath, B. S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+texture+segmentation+using+Markov+random+field+models%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Unsupervised texture segmentation using Markov random field models.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).</li>
<li>Krishnamachari, S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiresolution+Gauss-Markov+random+field+models+for+texture+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation.</a> IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de registro das imagens para reconstruir um volume 3D a partir de histologia série de imagens de histologia em 2D, que não requer marcos internos selecionados aleatoriamente ou marcadores fiduciais implantados dentro do tecido, o que pode distorcer o tecido. Pelo método descrito, as próprias imagens blockface ópticos são usados ​​como imagens de referência anteriores a corte. Usamos furos externos perfurados no bloco de parafina para auxiliar no alinhamento das imagens bl...

IGFBP7 (insulina como factor de crescimento da proteína de ligação 7) é um membro da família de proteínas de ligação a IGF, e tem sido demonstrado que se ligam ao receptor de IGF1 4. Down-regulação da IGFBP7 é conhecido por ser correlacionados com mau prognóstico no câncer de mama 5, enquanto a reintrodução de IGFBP7 em modelos de tumores Xenoenxerto inibe significativamente os tumores de crescimento de 6 a indução de apoptose e senescência celular 7. A fim de estudar os efeitos da IGFPB7, um mouse IGFBP7 nulo foi criado 5 (dados não publicados). Enquanto estes ratinhos não desenvolveram tumores, que mostram alterações na histologia do ovário, músculo e fígado, assim como defeitos na padronização do desenvolvimento da glândula mamaria (dados não publicados). O fenótipo defeituoso foi indicado pela primeira vez como os ratos nulos têm tamanho das ninhadas menores e são incapazes de sustentar várias ninhadas grandes (dados não publicados). Volumes de histologia 3D têm o potencial de fornecer informat útilíon para análises quantitativas e comparativas e avaliação de achados patológicos em imagens médicas volumétricos. Confocal tridimensional, microscopia de dois fótons podem fornecer células de alta resolução informação morfológica da glândula em extensão local 14, mas tem um campo de visão limitado e profundidade. Reconstrução volume de Histologia fornece mais informações sobre uma extensão muito maior espacial. Usando abordagens tradicionais alguma distorção é antecipado durante a preparação dos cortes histológicos, como encolhimento, expansão, lágrimas e dobras. Essas distorções dificultam a registar imagens histológicas de série em uma pilha 3D para reconstruir um volume 3D. À medida que o número de secções consecutivas com defeitos aumenta as semelhanças entre as secções intactas é reduzida e, consequentemente, faz com que o processo de registo mais complicado. Diferentes métodos têm sido propostos para registar cortes histológicos e criar um vo histologia contínualume. Algumas técnicas dependerá variações de intensidade de 8, e os outros são baseados na forma de secções 9. Para alguns espécimes as estruturas anatômicas podem ser usados ​​como pontos de referência 10,11, juntamente com métodos de registo com base em marcos 12,13. Mas estas estruturas internas pode não ser detectável durante todo o volume e para algumas amostras sem estruturas anatómicas fiáveis ​​podem ser identificados. Alguns grupos têm usado uma abordagem de registro de pares e registrou imagens de histologia consecutivos de um para outro usando contornos ou estruturas anatômicas 16-18. Registrando cortes histológicos de série para um outro sem o uso de imagens de referência podem propagar o erro de registro e alterar a forma real do volume de histologia. Abordagem de registro de pares depende da consistência da forma dos cortes histológicos e as estruturas internas em toda a pilha de imagens; portanto, requer amostragem densa da amostra, o quepode nem sempre possível, por exemplo, para amostras clínicas. Neste oleoduto usamos imagens blockface como um conjunto de imagens de referência para o volume de histologia reconstrução 19. Imagens Blockface são tomadas dos blocos de parafina do tecido após a montagem no micrótomo e antes de cada seção é cortada. Assim, os danos ao indivíduo cortes seriados corte não interfere com o registro de cortes seriados 8,11,15. Nós capturar as imagens blockface de uma maneira diferente dos outros grupos. As imagens da face do bloco óptico são obtidos por uma lente telecêntrica para eliminar ou minimizar a distorção do tambor e em perspectiva, que normalmente ocorre quando se usa lentes regulares em óptica. Esta é uma das vantagens da abordagem proposta em relação aos outros métodos publicados, que realizam imagiologia blockface usando lentes normais. As imagens são obtidas com um ligeiro ângulo oblíquo para usar a reflexão da superfície do bloco, para aumento do contraste entre a tissue e parafina superfície e para eliminar a sombra do tecido em profundidade, abaixo da superfície da parafina. Um filtro fotográfico também é usada para polarizar a luz vinda a partir da superfície do bloco e o tecido para equilibrar o contraste 19. Para corrigir o deslocamento do bloco no micrótomo rotativo, 2-3 orifícios são perfurados nos cantos do bloco, que são facilmente detectáveis ​​nas imagens blockface. Os centróides desses buracos são usados ​​juntamente com registro rígido à base de referência para alinhar as imagens blockface.

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% Solução de paraformaldeído</td></tr><tr><td>de processamento de tecidos pequenos</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 processador de tecidos automatizado</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>Parafina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast meio de incorporação de tecido</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 centro de incorporação</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de fresagem</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H& Mancha E</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coloração</td><td></td><td></td><td></td>automática</tr> de <tr><td>lamínulas&nbsp;</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 lamínula de vidro</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400 scanner de lâminas</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>Software de desenvolvimento</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>Software de visualização 3D</td></tr></tbody></table>

reconstrução de 3-dimensional volume histologia e sua aplicação para o estudo de rato glândulas mamárias

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Reconstrução de volume Histologia facilita o estudo da forma 3D e variação de volume de um órgão a nível de macroestruturas formadas por células. Ele também pode ser usado para investigar e validar novas técnicas e algoritmos em imagiologia médica volumétrico e terapias. Criação de atlas de alta resolução em 3D de diferentes órgãos 1,2,3 é outra aplicação de reconstrução do volume histologia. Isto fornece um recurso para investigar estruturas de tecidos e as relações espaciais entre várias características celulares. Nós apresentamos uma abordagem registro de imagens para a reconstrução do volume histologia, que utiliza um conjunto de imagens blockface ópticos. O volume histologia reconstruída representa uma forma confiável do espécime processados ​​com nenhum erro de registro de pós-processamento propagada. Os (H &amp; E) cortes corados hematoxilina e eosina de duas glândulas mamárias do rato foram registrados às suas imagens blockface correspondentes usando pontos de fronteira extraídos do edges do espécime em histologia e blockface imagens. A precisão do registro foi avaliada visualmente. O alinhamento das macroestruturas das glândulas mamarias também foi avaliada visualmente em alta resolução. Este estudo delineia as diferentes etapas deste gasoduto registro de imagens, que vão desde a excisão da glândula mamária por meio de reconstrução 3D volume de histologia. Enquanto as imagens de histologia 2D revelar as diferenças estruturais entre pares de seções, o volume de histologia 3D proporciona a capacidade de visualizar as diferenças de forma e volume das glândulas mamárias.

Uma armadilha de técnicas de microscopia tradicionais é que a compreensão de um órgão a nível microscópico é limitado a um campo de visão de cada vez. Mesmo &quot;totais de divulgação&quot; slides, que fornecem seções de slides inteiros, não fornecem informações tridimensional. Com o desenvolvimento de slides todo, tecnologias dinâmicas de verificação, a nossa capacidade de ver uma seção em sua totalidade aumentou, porém extrapolando estruturas 3D requer a reconstrução do volume histologia. ...

Apresentamos uma abordagem de registro de imagem para reconstrução de volume de histologia tridimensional (3D), o que facilita o estudo das alterações de um órgão ao nível de macroestruturas compostas por células . Usando essa abordagem, estudamos as mudanças 3D entre as glândulas mamárias do tipo selvagem e Igfbp7-nulo.

Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

O objetivo geral do vídeo a seguir é apresentar uma abordagem de registro de imagens para histologia tridimensional, com reconstrução de volume para estudar alterações na macroestrutura celular da glândula mamária. Para isso, glândulas mamárias são removidas de camundongos três dias após o início da lactação em camundongos selvagens e camundongos nulos para a proteína ligadora do fator de crescimento semelhante à insulina sete, IGF BP sete. As glândulas são então processadas e emblocadas em parafina para seccionamento.Em seguida, são capturadas imagens do bloco óptico da face do tecido e o bloco de tecido é seccionado. São obtidas imagens das seções e, com o auxílio de um software personalizado, cada seção é alinhada à sua imagem correspondente da face do bloco para reconstruir o volume histológico da glândula mamária. Os dados resultantes destacam as diferenças de tamanho entre glândulas mutantes e do tipo selvagem.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal tridimensional de dupla varredura, é que ela fornece informações em uma extensão espacial muito maior. Este método também pode ser utilizado para investigar e validar novas técnicas e algoritmos em imagens médicas volumétricas e terapias, bem como para criar análises tridimensionais de alta resolução de diferentes órgãos. Este volume de histologia reconstruído retrata uma representação confiável do espécime analisado, sem erros de registro propagados.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que camundongos nulos para IGF P sete apresentam ninhadas menores e são incapazes de sustentar múltiplas ninhadas de grande porte, o que nos levou a investigar a estrutura de suas glândulas mamárias. Uma vez que o tecido esteja embutido em parafina, utilize um micrótomo rotativo para aparar o bloco até que a parafina em excesso seja removida. Em seguida, utilizando uma fresadora vertical, faça furos de um milímetro em pelo menos dois cantos do bloco de parafina, perpendicularmente à cassete, e monte o bloco de tecido no micrótomo rotativo.Em seguida, para montar o sistema de imagem da superfície do bloco em frente ao micrótomo, posicione uma câmera com lente teleobjetiva em um ângulo ligeiramente inclinado em relação à superfície do bloco de tecido. A câmera deve estar conectada a um computador posicionado em frente ao micrótomo. Em seguida, posicione uma fonte de luz em frente ao bloco, de modo que a câmera capture o reflexo da luz proveniente do bloco.Ajuste o ângulo da câmera até que o tecido na superfície do bloco seja facilmente distinguido da parafina ao redor. Capture uma imagem óptica da face do bloco. Em seguida, utilizando o micrótomo, corte fitas de quatro seções, com cinco micrômetros de espessura.Transfira as fitas para um banho de água fria, separe as seções da fita e, em seguida, retire com uma colher as segunda e quarta seções da água fria para um lâmina. Transfira-as para um banho de água morna para desamassá-las. A escolha das segunda e quarta seções fornece uma lacuna de cinco mícrons entre as seções.Uma vez desamassadas, remonte as seções nos lâminas do microscópio por escavação. Como antes, observe que o corte, o montagem e o desamassamento das seções podem causar algumas distorções, como rasgos, dobras, retração e expansão. Esses artefatos complicam o registro das seções histológicas.Cubra os cortes com hematoxilina e eosina utilizando um colorador automático. Em seguida, monte as lâminas com lamínulas utilizando um cubrissector automático e, com um escâner digital de lâminas de histologia, digitalize as lâminas na resolução desejada. Para este protocolo, a ampliação é de 20 x e a resolução é de 0,47 mícrons.Esta seção do vídeo apresenta uma visão geral do processo de registro de imagens, que é realizado utilizando um software personalizado desenvolvido em nosso laboratório combinado com MATLAB c plus plus. Utilizando o ITK, comece por subamostrar as imagens de histologia até a resolução das imagens de superfície do bloco. Isso reduzirá as imagens de histologia por um fator de 0,026.Em seguida, para a segmentação de imagem e seleção de pontos, abra algumas imagens de superfície de bloco no MATLAB e utilize a ferramenta de cursor de dados para medir os valores dos pixels dos orifícios de registro. Utilize o valor médio dos pixels como um limiar fixo para segmentar os orifícios de registro. Para remover os segmentos extras, utilize a circularidade e a área dos objetos segmentados para manter os orifícios e eliminar os segmentos adicionais.Em seguida, para cada glândula mamária, selecione uma imagem da face do bloco como referência. Alinhe os centros dos orifícios de registro das demais imagens das faces dos blocos aos centros dos orifícios de registro da imagem de referência. Em seguida, utilizando as transformações obtidas para os orifícios de registro, alinhe manualmente as imagens das faces dos blocos e, para as imagens alinhadas, delimite ou extraia o tecido do fundo para as seções h e d.Utilize a técnica de limiarização OSU para segmentar as imagens do fundo e criar máscaras binárias das imagens de histologia. Em seguida, usando o histograma dos objetos rotulados, identifique e selecione o objeto de maior tamanho em cada máscara. Extraia os pontos de contorno com largura de um pixel das máscaras de histologia e da superfície do bloco.Em seguida, utilize um algoritmo de descritores de Fourier para encontrar a transformação rígida inicial entre os pontos de contorno da histologia e suas imagens correspondentes da superfície do bloco. Essa transformação inicial inclui os fatores de translação, rotação e escala. Transforme cada imagem de histologia com a transformação inicial obtida no passo anterior.Para aperfeiçoar o registro rígido, remova as seções das bordas de alta curvatura do contorno histológico utilizando um filtro de bola rolante. Em seguida, selecione aleatoriamente 500 pontos da distribuição uniforme dos pontos restantes do limite histológico. Transforme os pontos do limite histológico com a transformação inicial obtida a partir dos descritores de Fourier.Utilize os pontos de contorno do bloco e use o algoritmo de pontos mais próximos iterativos para encontrar a transformação rígida entre os pontos de contorno do bloco, face e a histologia. Pontos de contorno aleatórios. Em seguida, transforme as imagens de histologia obtidas na etapa anterior para criar uma imagem visual do volume de histologia no software de visualização 3D.Na Me vis lab, escolha os módulos, arquivos diversos e adicione o módulo compor 3D a partir de arquivos 2D. Em seguida, selecione imagem no menu e adicione o módulo converter propriedade da imagem. Por fim, adicione um módulo visualizar 3D a partir dos módulos de visualização 3D.Clique duas vezes em compor 3D a partir de arquivos 2D para carregar as imagens e clique em criar 3D. Ajuste o tamanho do vóxel clicando duas vezes em converter propriedade da imagem e defina o tamanho do vóxel como 0,018 0,018 0,01. Visualize o volume clicando duas vezes em visualizar 3D.Por fim, visualize a pilha de imagens em cinco vezes de ampliação seguindo as etapas descritas no documento em anexo. Para caracterizar melhor o défice, foi realizada a reconstrução tridimensional das glândulas mamárias do camundongo nulo para I-G-F-B-P sete conforme descrito aqui. Essas figuras mostram os volumes histológicos reconstruídos das glândulas mamárias do tipo selvagem e nulas.Observe que a glândula mutante à direita é mais curta e mais estreita do que a selvagem à esquerda, mas possui aproximadamente a mesma profundidade, sendo a glândula selvagem de 1,06 milímetros e a glândula nula de 1,02 milímetros de profundidade. Além disso, note que as glândulas selvagens à esquerda apresentam pouco tecido estromal, indicado pela coloração rosa do eosina, enquanto as glândulas nulas à direita parecem ser predominantemente tecido estromal. Aqui, a coloração com hematoxilina, que identifica as células nucleadas, mostra que a glândula nula mantém sua densidade, enquanto a glândula selvagem parece conter principalmente estruturas glandulares.Para investigar mais a fundo, imagens de maior resolução da área do linfonodo foram alinhadas aqui. São observadas grandes estruturas que teriam sido preenchidas com leite. Em contraste, a glândula nula para I-G-F-B-P sete apresenta poucas estruturas bem desenvolvidas.Além disso, essas estruturas estão repletas de células semelhantes a fibroblastos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar uma reconstrução tridimensional de um órgão por meio da reconstrução de cortes seriados escaneados. Bom. Agora, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de nomear consistentemente as lâminas e os escaneamentos, pois haverá um grande número de ambos, e a organização sequencial é a chave para o sucesso ao seguir este procedimento.Outros métodos, como imunohistoquímica para marcadores específicos de células e doenças, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, por exemplo, como a vasculatura permeia um tumor?

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

O desenvolvimento da glândula mamária no roedor tipicamente foi avaliado usando avaliações descritivas ou medindo atributos físicos básicos. A densidade de ramificação é um indicador de desenvolvimento mamário que é difícil de quantificar objetivamente. Este protocolo descreve um método confiável para a avaliação quantitativa das características de ramificação da glândula mamária.

Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Um método de injeção intradutal de reagentes para uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária do camundongo para a imagem in vivo e prevenção do câncer de mama é descrito. A injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos colaterais mínimos.

Entrega intraduto e visualização de raios-X da solução ablativa baseada em etanol para prevenção e tratamento local do câncer de mama em modelos de camundongos

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Aprenda a reconstruir volumes histológicos em 3D para estudar a macroestrutura celular de glândulas mamárias em camundongos. Este método de registro de imagens compara diferenças entre tipos selvagem e mutantes.

Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

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