Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar a interação de duas proteínas expressas em folhas de tabaco intactas. Isso é conseguido projetando construções apropriadas, fundindo os dois genes de interesse para dividir proteínas fluorescentes e transformando essas construções em agrobactérias. Como segunda etapa, as culturas de agrobactérias são misturadas e injetadas nas folhas do tabaco, o que leva à expressão das proteínas e a um sinal fluorescente reconstituído.

Se as proteínas se aproximarem, em seguida, folhas inteiras ou protoplastos isolados são analisados ao microscópio. São obtidos resultados que mostram interações proteína-proteína com base no sinal fluorescente emitido detectado por microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como imunoprecipitação de cor ou levedura para híbrido, é que a interação proteína-proteína pode ser monitorada diretamente na célula vegetal viva.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vegetal, como a formação de complexos de proteínas em vários compartimentos celulares. Para iniciar este procedimento, cultive as bactérias agrícolas a serem usadas para a transformação das folhas de tabaco. Inocular 10 mililitros de meio LB contendo os antibióticos apropriados com 50 microlitros do AG L uma cultura de estoque de glicerol contendo o plasmídeo de interesse em um tubo estéril de 50 mililitros.

Incubar a 28 graus Celsius por pelo menos 24 horas, agitando a 190 RPM até que a cultura atinja um OD 600 entre 1,0 e 2,0 no dia seguinte. Centrifugue as bactérias a 3000 vezes G por 15 minutos. Depois de rejeitar o resus sobrenadante, suspender o sedimento em meio de infiltração acabado de fazer e ajustar a suspensão para um OD 600 de 1,0.

Incube as células de agrobactérias em um agitador suspenso por duas horas no escuro em temperatura ambiente para infiltração de folhas de tabaco. Escolha várias folhas mais velhas de uma planta de tabaco de três semanas. Misture volumes iguais.

Três mililitros cada uma das agrobactérias carregando as construções de interesse. Encha uma seringa de cinco mililitros sem agulha com a mistura de suspensão celular para infiltrar a suspensão celular nas folhas de tabaco. Pressione cuidadosamente a seringa na parte inferior das folhas em vários lugares, regue as plantas e deixe-as cobertas e protegidas da luz por dois dias.

Para isolar protoplastos de uma folha infiltrada, primeiro coloque a folha em uma placa de Petri e adicione um pouco de solução enzimática recém-preparada. Usando uma nova lâmina de barbear, corte a folha em pedaços de aproximadamente 0,5 centímetro quadrado. Em seguida, transfira os pedaços de folhas com a solução enzimática para o vácuo.

Balão de infiltração. Aspire por aproximadamente 20 segundos até que bolhas de ar surjam das folhas. Solte o aspirador com muito cuidado.

Agitar o balão durante 90 minutos a 40 RPM na obscuridade à temperatura ambiente após 90 minutos. Solte os protoplastos agitando por um minuto a 90 RPM. Filtrar a solução através de gaze para um tubo de centrifugação de fundo redondo de 15 ml.

Cubra a solução de protoplastos com dois mililitros de tampão FPCN e centrifugue por 10 minutos a 70 vezes G com aceleração lenta e desaceleração à temperatura ambiente. Os protoplastos intactos se acumularão na interface entre a solução enzimática e o FPCN usando uma ponta de pipeta de orifício largo de um mililitro para transferir os protoplastos intactos para um novo tubo de centrífuga. Para o sucesso deste procedimento, sempre use pontas de orifício brancas para evitar a ruptura de protoplastos intactos.

Encha o tubo com centrífuga tampão W five por dois minutos a 100 vezes G com aceleração e desaceleração lentas. Para granular os protoplastos, remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda o pellet. Em aproximadamente 200 microlitros de W cinco tampão, dependendo da quantidade de protoplastos.

Para preparar uma amostra de protoplastos para microscopia de varredura a laser primeiro passo, duas pequenas tiras de selante com cerca de dois centímetros de distância em uma lâmina de microscópio. Coloque 20 microlitros da solução de protoplastos entre as tiras e coloque cuidadosamente uma tampa de vidro por cima. As tiras de selante evitarão que os protoplastos sejam esmagados pela lamínula.

Para preparar uma amostra total da folha para microscopia de varredura a laser, corte um pedaço de um centímetro da folha e coloque-o em uma lâmina de microscópio com a parte inferior da folha voltada para cima. Adicione aproximadamente 30 microlitros de água. Coloque uma tampa de vidro por cima e fixe-a firmemente com fita adesiva em ambos os lados.

A imagem é realizada com um microscópio confocal de varredura a laser do tipo MICCA TCS SP cinco para ampliação. Use uma lente objetiva com uma magnitude de 63 x com glicerol como meio de imagem, use o software fluorescente avançado do conjunto de aplicativos Leica para avaliação. Defina o laser Argonne para 30% e a potência do laser em 488 nanômetros para uma intensidade de 18% Para monitorá-lo sinal em 515 nanômetros, defina a primeira largura de banda de emissão do detector PMT de 495 a 550 nanômetros.

Para monitorar a autofluorescência da clorofila. Defina uma segunda largura de banda de emissão do detector PMT de 650 a 705 nanômetros. Para monitorar o sinal M cherry, use o laser HENI 5 61.

Defina a intensidade do laser para 18% e uma terceira largura de banda de emissão do detector PMT de 587 a 610 nanômetros. Certifique-se de que as fotos de todos os canais do detector PMT sejam tiradas com as mesmas configurações de ganho. O ganho deve estar entre 800 e 900 para excluir sinais de fundo.

Adquira imagens neste formato, largura e altura de 1024 por 1024 pixels com uma velocidade de digitalização de 100 hertz. Para empilhamentos Z, use uma distância máxima de 0,5 mícrons entre cada pilha. Neste estudo, o método BFC foi utilizado para monitorar a interação da chaperona molecular citosólica HSP 90 com as proteínas de acoplamento da membrana TPR sete e a 64.

Como mostrado neste esquema, Vênus está acoplado à parte citosólica do TPR sete, que reside no retículo endoplasmático ou ao 64, que reside no envelope externo do cloroplasto. Hs.P 90 é N terminalmente fundido ao SCFP, permitindo a interação dos domínios TPR da conversa 64 e TPR sete Com o HSP 90 C, Terminus, o SCFP sozinho é expresso no citosol como um controle negativo para verificar a localização do complexo proteico TPR sete HS P 90. TPR sete e HS P 90 foram cotransformados com um marcador ER.

A fluorescência foi monitorada em folhas intactas como controle. O SCFP sozinho foi expresso junto com o TPR sete e o marcador ER. Em todas as imagens mostradas, a barra de escala representa 10 mícrons.

Os painéis à esquerda mostram fluorescência reconstituída em verde monitorada em 515 nanômetros. O marcador ER aparece em vermelho. Nos painéis do meio, a sobreposição de ambos os sinais é mostrada nos painéis da direita.

Um sinal reconstituído para TPR sete junto com HS P 90 foi monitorado sobrepondo-se ao marcador ER aparecendo em amarelo. Em contrapartida, não foi monitorado nenhum sinal para o TPR sete e o controle negativo como CFP. No próximo exemplo, a proteína tox 64 do cloroplasto foi co-expressa com HS P 90 como controle.

A toxicidade 64 foi co-expressa apenas com o SCFP. Como antes, a fluorescência reconstituída em verde foi monitorada em 515 nanômetros. Os painéis do meio mostram a autofluorescência da clorofila monitorada em 480 nanômetros.

Em vermelho, a sobreposição de ambos os sinais é mostrada nos painéis à direita. A fluorescência reconstituída foi observada em células coex expressando tox 64 e HSP 90, mas não em células. Coex expressando tox 64 e SCFP sozinho.

Uma vez que a localização exata de tox 64 e HSP 90 é difícil de determinar em imagens microscópicas de folhas inteiras. Os protoplastos foram isolados de folhas de tabaco infiltradas para microscopia de fluorescência. Como antes, a fluorescência reconstituída foi monitorada em 515 nanômetros, a autofluorescência da clorofila foi monitorada em 480 nanômetros e as imagens de sobreposição foram criadas como mostrado nesta imagem de sobreposição para 64 e HSP 90 pode ser detectado como estruturas em forma de anel ao redor do cloroplasto Off.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar suas construções, transformar folhas de tabaco e como visualizar melhor o sinal fluorescente mostrando a interação de suas duas proteínas de interesse.