Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar a interação de duas proteínas expressas em folhas intactas de tabaco. Isso é alcançado por meio do planejamento de construtos apropriados, fusão dos dois genes de interesse a proteínas fluorescentes fragmentadas e transformação desses construtos em bactérias agrobacterianas. Como segundo passo, culturas de bactérias agrobacterianas são misturadas e injetadas nas folhas de tabaco, o que leva à expressão das proteínas e à reconstrução de um sinal fluorescente.

Se as proteínas entrarem em proximidade próxima, em seguida, folhas inteiras ou protoplastos isolados são analisados ao microscópio. São obtidos resultados que mostram interações entre proteínas com base no sinal fluorescente emitido, detectado por microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como co-imunoprecipitação ou teste de duplo-híbrido em levedura, é que a interação entre proteínas pode ser monitorada diretamente na célula vegetal viva.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da biologia vegetal, como a formação de complexos proteicos em diversos compartimentos celulares. Para iniciar este procedimento, cultive as bactérias agro a serem usadas na transformação das folhas de tabaco. Inocule 10 mililitros de meio LB contendo os antibióticos apropriados com 50 microlitros do cultivo estoque glicerinado AG L um, contendo o plasmídeo de interesse, em um tubo estéril de 50 mililitros.

Incubar a 28 graus Celsius por pelo menos 24 horas, sob agitação a 190 rpm, até que a cultura atinja uma DO 600 entre 1,0 e 2,0 no dia seguinte. Centrifugar as bactérias a 3000 × g por 15 minutos. Após descartar o sobrenadante, suspender o pellet em meio de infiltração recém-preparado e ajustar a suspensão para uma DO 600 de 1,0.

Incube as células de agrobactérias em um agitador rotativo durante duas horas no escuro, à temperatura ambiente, para infiltração das folhas de tabaco. Escolha várias folhas mais velhas de uma planta de tabaco com três semanas de idade. Misture volumes iguais.

Três mililitros de cada uma das bactérias agrobacterianas carregando as construções de interesse. Encha uma seringa de cinco mililitros sem agulha com a mistura de suspensão celular para infiltrar a suspensão nas folhas de tabaco. Pressione cuidadosamente a seringa no lado inferior das folhas em vários pontos, regue as plantas e mantenha-as cobertas e protegidas da luz por dois dias.

Para isolar protoplastos de uma folha infiltrada, primeiro, coloque a folha em uma placa de Petri e adicione uma solução enzimática recém-preparada. Usando uma lâmina de barbear nova, corte a folha em pedaços de aproximadamente 0,5 centímetro quadrado. Em seguida, transfira os pedaços de folha com a solução enzimática para um vácuo.

Frasco de infiltração. Realize a infiltração a vácuo por aproximadamente 20 segundos até que bolhas de ar emergem das folhas. Libere o vácuo com muita cautela.

Agite o frasco durante 90 minutos a 40 RPM no escuro e à temperatura ambiente após 90 minutos. Libere os protoplastos agitando durante um minuto a 90 RPM. Filtre a solução através de gaze para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros.

Cubra a solução de protoplastos com dois mililitros de tampão FPCN e centrifugue por 10 minutos a 70 vezes G com aceleração e desaceleração lentas à temperatura ambiente. Os protoplastos intactos irão se acumular na interface entre a solução enzimática e o FPCN; utilizando uma ponteira de pipeta de um mililitro com orifício largo, transfira os protoplastos intactos para um tubo cônico novo. Para o sucesso deste procedimento, utilize sempre ponteiras com orifício branco para evitar a ruptura dos protoplastos intactos.

Encha o tubo com o tampão W cinco, centrifugue por dois minutos a 100 vezes G com aceleração e desaceleração lentas. Para obter o pellet de protoplastos, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em aproximadamente 200 microlitros de tampão W cinco, dependendo da quantidade de protoplastos.

Para preparar uma amostra de protoplastos para microscopia a laser, posicione primeiro duas tiras pequenas de selante a cerca de dois centímetros de distância umas das outras em uma lâmina de microscópio. Coloque 20 microlitros da solução de protoplastos entre as tiras e posicione cuidadosamente uma lamínula no topo. As tiras de selante impedirão que os protoplastos sejam esmagados pela lamínula.

Para preparar uma amostra total de folha para microscopia a laser, corte um pedaço de um centímetro da folha e coloque-o sobre uma lâmina de microscópio com a face inferior da folha voltada para cima. Adicione aproximadamente 30 microlitros de água. Coloque um lamínula por cima e fixe-o firmemente com fita adesiva em ambos os lados.

A imagem é obtida com um microscópio confocal de varredura a laser do tipo MICCA TCS SP Five para ampliação. Utilize uma lente objetiva com magnitude de 63x e glicerol como meio de imagem; use o software Leica Application Suite Advanced Fluorescence para avaliação. Ajuste o laser de argônio para 30% e a potência do laser em 488 nanômetros para uma intensidade de 18%. Para monitorar o sinal em 515 nanômetros, configure a largura de banda de emissão do primeiro detector PMT de 495 a 550 nanômetros.

Para monitorar a autofluorescência de clorofila, defina uma faixa de emissão do segundo detector PMT entre 650 e 705 nanômetros. Para monitorar o sinal M cherry, utilize o laser HENI 5 61.

Defina a intensidade do laser em 18% e uma faixa de emissão do terceiro detector PMT de 587 a 610 nanômetros. Certifique-se de que as imagens de todos os canais do detector PMT sejam obtidas com as mesmas configurações de ganho. O ganho deve estar entre 800 e 900 para excluir sinais de fundo.

Adquira imagens neste formato, com largura e altura de 1024 por 1024 pixels e velocidade de varredura de 100 hertz. Para empilhamentos em Z, utilize uma distância máxima de 0,5 mícrons entre cada corte. Neste estudo, o método BFC foi utilizado para monitorar a interação da chaperona molecular citosólica HSP 90 com as proteínas de ancoragem à membrana TPR sete e até 64.

Como mostrado neste esquema, Venus está acoplado à parte citosólica da TPR sete, que reside no retículo endoplasmático, ou à 64, que reside na membrana externa do cloroplasto. Hs.P 90 é fundido ao extremo N-terminal com SCFP, permitindo a interação dos domínios TPR da talk 64 e da TPR sete com o extremo C-terminal da HSP 90. SCFP sozinho é expresso no citosol como controle negativo para verificar a localização do complexo proteico TPR sete e HS P 90. TPR sete e HS P 90 foram cotransformados com um marcador de RE.

A fluorescência foi monitorada em folhas intactas como controle. O SCFP sozinho foi expresso juntamente com TPR sete e o marcador do RE. Em todas as imagens apresentadas, a barra de escala representa 10 mícrons.

Os painéis à esquerda mostram a fluorescência reconstituída em verde monitorada a 515 nanômetros. O marcador de RE aparece em vermelho. Nos painéis centrais, a sobreposição de ambos os sinais é mostrada nos painéis à direita.

Um sinal reconstruído para TPR sete juntamente com HS P 90 foi monitorado, sobrepondo-se ao marcador do RE que aparece em amarelo. Em contraste, nenhum sinal para TPR sete e o controle negativo como CFP foi detectado. No próximo exemplo, a proteína do cloroplasto tox 64 foi coexpressa com HS P 90 como controle.

Tox 64 foi coexpresso com SCFP isoladamente. Como antes, a fluorescência reconstituída em verde foi monitorada a 515 nanômetros. Os painéis centrais mostram a autofluorescência da clorofila monitorada a 480 nanômetros.

A sobreposição em vermelho de ambos os sinais é mostrada nos painéis à direita. A fluorescência reconstituída foi observada em células coexpressando tox 64 e HSP 90, mas não em células coexpressando tox 64 e SCFP isoladamente.

Como a localização exata de tox 64 e HSP 90 é difícil de determinar em imagens microscópicas de folhas inteiras, protoplastos foram isolados de folhas de tabaco infiltradas para microscopia de fluorescência. Como anteriormente, a fluorescência reconstituída foi monitorada em 515 nanômetros, a autofluorescência da clorofila foi monitorada em 480 nanômetros e imagens sobrepostas foram criadas, conforme mostrado nesta imagem sobreposta, em que tox 64 e HSP 90 podem ser detectadas como estruturas em forma de anel ao redor do cloroplasto Off.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar seus construtos, transformar folhas de tabaco e como visualizar melhor o sinal fluorescente que mostra a interação entre suas duas proteínas de interesse.