Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

O objetivo geral do experimento a seguir é medir qualitativa e quantitativamente o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Isso é conseguido adicionando uma solução oxidativa a embriões preparados para indução de estresse oxidativo ou criando uma margem de ferida na barbatana caudal do embrião. Os embriões são então processados para detecção de estresse oxidativo por um método de célula única ou por um método de montagem completa.

Em seguida, as preparações são incubadas com uma sonda de detecção Ross. Os resultados podem mostrar a quantidade de estresse oxidativo e o nível de Ross com base na microscopia confocal de montagens de furos ou análise métrica de citofluoração de células individuais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o imunofluor para marcadores de estresse oxi, é que ela permite a detecção bruta no contexto de um organismo vivo e a quantificação no nível de tecidos individuais.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa básica, como explorar condições de estresse oxidativo no contexto de um estado patológico. Indivíduos novos na admissão podem ter dificuldades devido a danos acidentais nos tecidos, porque as sondas moleculares sensíveis podem ser uma fonte não planejada de acidez. E como altos níveis de estresse oxidativo devem resultar em morte celular, embora muito pouco possa ser difícil de detectar com a prática e a experimentação, esses problemas só resultarão em si mesmos. Ao preparar a solução para induzir o estresse oxidativo às mitocôndrias compostas de podridão conhecida no DMSO, ela deve ser feita com podridão conhecida em uma concentração entre cinco e 50 micromolares e nunca acima de 100 micromolares podres conhecidos são tóxicos e perigosos.

Preste atenção às precauções rotuladas. A solução da sonda para detecção do furo Mount Ross não deve ser exposta a nenhuma luz ou oxigênio durante sua preparação e deve ser preparada fresca para o método de detecção de Ross de célula única. Uma solução de parada de FBS em PBS deve ser preparada e mantida a quatro graus Celsius.

Outras preparações incluem a configuração da incubadora de ar de peixe-zebra para 28 graus Celsius e, para o método de célula única, o resfriamento da centrífuga a quatro graus Celsius. Cruzamentos de peixe-zebra, coleta de embriões e anestesia são todos realizados. Usando metodologia padrão, colete embriões de interesse entre 48 e 72 horas após a fertilização.

Após anestesiar os embriões, lave o anestésico duas vezes e, em seguida, carregue os embriões em três pratos com não mais que 30 por prato para detecção bruta de célula única. Colete pelo menos 35 embriões por condição em vários pratos. Em seguida, aplique 10 mililitros de solução oxidante ou como controle negativo.

Aplique 10 mililitros de água e aguarde de 10 a 60 minutos enquanto os embriões incubam a 28 graus Celsius. Também pré-aqueça o HBSS a 28 graus Celsius para a lavagem. Após a incubação, transfira os embriões para um novo prato de HBSS quente e redemoinho.

Em seguida, prossiga com a detecção de Ross de montagem inteira ou de célula única. Uma opção mais fisiológica é gerar estresse após o dano tecidual usando a técnica de ferimento da barbatana caudal descrita por NI Tomer e companhia. Após o tratamento oxidante, transfira grupos de até 10 embriões para pequenos tubos.

Enxágue-os abundantemente com HBSS e proteja-os da luz com papel alumínio. Em seguida, adicione um mililitro de solução de detecção bruta a cada tubo e incube os tubos por 15 minutos a 28 graus Celsius enquanto eles incubam. Prepare uma lâmina de vidro para conter a condição de controle e experimental.

Cubra uma lâmina de depressão com 300 microlitros de metilcelulose. Não faça bolhas ao ejetar a metilcelulose. Após a incubação do embrião, substitua rapidamente a solução nos tubos por dois mililitros de HBSS e inverta os tubos várias vezes para lavar os embriões.

Em seguida, aspire os embriões para a ponta de uma micropipeta e ejete-os suavemente para a lâmina tratada. Oriente os embriões usando uma linha fina de náilon e prossiga com o uso de um microscópio de varredura fluorescente ou confocal para análise. Certifique-se de analisar todos os embriões nas mesmas configurações.

Transfira os embriões da lavagem HBSS para um novo prato, removendo o máximo possível da solução. Agora retire manualmente os embriões. Isso é realmente necessário para dissociar embriões em células únicas.

Em seguida, mova os embriões para uma placa de 24 poços, carregue 15 embriões em cada um. Encha de forma ideal três poços para cada condição. Em seguida, remova toda a solução e substitua-a por 300 microlitros de HBSS, 30 microlitros de colagenase p e 50 microlitros de tripsina EDTA.

Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, homogeneizar os embriões com trier. Depois que todos os poços estiverem preparados, transfira a placa para 28 graus Celsius por pelo menos 20 minutos a cada cinco minutos, tritrate as amostras para garantir uma boa homogeneização. Coloque também alguns tubos de micro fuga no gelo para coletar os tecidos quando estiverem prontos.

Aos 20 minutos, colher uma amostra e verificar se o tecido está a ser interrompido numa única suspensão celular ao microscópio. Caso contrário, continue a incubação por até 30 minutos no total. Quando o tecido estiver pronto, interrompa a reação com mais 200 microlitros de solução de parada.

Misture isso com TRI usando uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, transfira o conteúdo de cada poço para um tubo de micro fuge pré-resfriado e mantenha esses tubos no gelo longe da luz. Em seguida, centrifugue as amostras a 250 GS por cinco minutos a quatro graus Celsius.

E então remova o sobrenadante por aspiração. Ressuspenda o pellet celular em HBSS gelado com tri suave e verifique se a suspensão tem pelo menos 2 milhões de células. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro da solução de sonda sensível bruta.

Incube-os em temperatura ambiente e no escuro por cerca de três minutos. Ajuste esse tempo de incubação empiricamente. Em seguida, transfira as células para tubos de fax protegidos da luz.

Prossiga com as análises de fax para detectar o marcador transgênico. Fluorescência e fluorescência da sonda Ross Durante sua análise. Sempre calcule os níveis de perda à medida que a dobra aumenta em comparação com as amostras de controle para normalizar a fluorescência de fundo.

Todas as detecções de Mount Ross foram usadas para examinar o acúmulo de peróxido de hidrogênio no local da ferida. As caudas intactas e feridas foram comparadas após 20 minutos de tratamento oxidante. Sinal inespecífico foi detectado em ambas as condições.

O mesmo experimento com o pré-tratamento dos embriões para reduzir os níveis de peróxido de hidrogênio. O uso do inibidor de OX VAs 28 70 revelou que os sinais detectados eram de fato dependentes da podridão de acúmulo de Ross. Embriões tratados conhecidos também foram examinados por montaria inteira.

Sob alta ampliação, regiões anatômicas puderam ser identificadas. Que produziu Ross, conforme indicado pela contagem de fluorescência de células positivas de Ross por fax, foi realizado para detecção de Ross de célula única. Essa análise foi realizada sem a inclusão de células mortas. Controle.

Células sem tratamento também foram analisadas. A comparação desses resultados tornou a quantificação do acúmulo de Ross muito fácil. O ensaio prova ser excelente para testar qualquer número de manipulações experimentais.

Uma vez dominado isso, uma técnica pode ser feita em 90 minutos se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com sondas moleculares pode ser extremamente perigoso e a precursão. Esse uso de luvas deve sempre ser feito durante a execução deste procedimento.