Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

O objetivo geral do experimento a seguir é o monitoramento in vitro de aglomerados cardíacos derivados de células-tronco embrionárias humanas em tempo real tridimensional e com alta resolução espacial. Isso é alcançado primeiramente cultivando e expandindo as células-tronco embrionárias até que formem corpos embrionários. Em seguida, os aglomerados contráteis são dissecados e semeados em filtros porosos de politetrafluoroetileno ou PTFE, o que permite mantê-los em longo prazo como cultura aérea.

Culturas líquidas, em seguida, batendo agregados são marcadas com nanopartículas harmônicas para realizar microscopia multiphoton em tempo real. Os resultados obtidos permitem a análise da elongação espacial e da frequência das contrações cardíacas em escala microscópica. Assim, a principal vantagem dessas nanopartículas é que você pode usar qualquer comprimento de onda, especialmente o infravermelho, permitindo penetrar mais profundamente no tecido, além de serem também muito estáveis ao longo do tempo.

Assim, podemos monitorar nossos processos prolongados ao longo de longos períodos. Este método de cultura de células-tronco pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da contração funcional de cardiomiócitos em três dimensões. Em particular, na maturação cardíaca e na engenharia de tecidos.

Indivíduos novos no método da doença devem estar cientes de que o procedimento de marcação com nanopartículas harmônicas pode ser usado apenas para microscopia multiphoton e não pode ser transferido para outros tipos de sistemas de imagem. Tivemos pela primeira vez a ideia de usar nanopartículas harmônicas em 2005. Essas nanopartículas apresentam vantagens em relação aos corantes fluorescentes e pontos quânticos.

Na verdade, seu sinal não desaparece ao longo do tempo e eles podem ser usados para monitorar amostras em desenvolvimento por longos períodos. A demonstração visual do preparo da amostra é essencial para a eficiência e a reprodutibilidade das diferentes etapas, em particular ao realizar testes de fármacos, e também poderia ser aplicada a diferentes tecidos ou doenças. Modelagem de tecidos.

Após o cultivo e expansão de células-tronco embrionárias humanas ou CTEs de acordo com o protocolo descrito no texto e incubação com colagenase aquecida por 10 minutos, colete os fragmentos de colônia em dois mililitros de meio de diferenciação fresco ou DM e centrifugue a 115 vezes a gravidade por três minutos. Cultive os fragmentos de colônia em suspensão em placas de seis poços com aderência ultrabaixa por quatro dias para permitir que formem corpos embrionários ou EBs.

Em seguida, plaque os EBS recém-formados em placas de 24 poços revestidas com 0,1% de gelatina por 15 a 30 dias, até o aparecimento de aglomerados pulsantes. Remova o PBS e, com auxílio de uma agulha, dissocie as colônias em células individuais após centrifugação e ressuspenda as células em meio DM, plante dois mililitros por poço. Incube na câmara de poço a 37 graus Celsius por um dia.

Colete os EBS recém-formados e plaque três por poço em placas de 24 poços revestidas com gelatina a 0,1% após duas a quatro semanas em cultura. Identifique aglomerados de cardiomiócitos contráteis e, utilizando uma pipeta de vidro longa com a ponta cortada finamente, dissecione-os manualmente. Deposite quatro filtros de PTFE por inserto e coloque cada um em um poço de uma placa de seis poços.

Após adicionar um mililitro de DM em cada poço, adicione um agregado pulsante dissecado em cada filtro de PTFE. Para rotular os agregados, transfira os filtros de PTFE com os agregados pulsantes para uma placa de vidro de fundo plano de 3,5 centímetros. Adicione um mililitro de nanopartículas de geração de segundo harmônico a 50 microgramas por mililitro e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius para realizar a imagem óptica não linear.

Após transferir HEBs marcados ou agregados cardíacos pulsantes para uma câmara de imagem, utilize a microscopia de campo amplo sob iluminação de luz branca para identificar estruturas de interesse dentro dos EBS diferenciados ou agregados pulsantes ativos. Realize uma varredura tridimensional rápida de baixa resolução para reconstruir a morfologia geral do agregado cardíaco e selecione um plano de imagem dentro do volume do agregado contendo várias nanopartículas visíveis de geração de segundo harmônico para monitoramento em tempo real. As contrações do agregado cardíaco ajustam o scanner óptico do microscópio ao modo mais rápido, permitindo a aquisição em múltiplos hertz de imagens bidimensionais.

Analise as imagens utilizando o software MATLAB de acordo com o protocolo descrito no texto, conforme demonstrado aqui, antes de avaliar a atividade de contração. A caracterização da resposta óptica não linear dos filtros de PTFE é realizada para garantir que a fluorescência do substrato nu frente a fótons seja muito fraca e não interfira na medição das amostras biológicas relevantes e da emissão de partículas isoladas. Nanopartículas de geração de segundo harmônico podem ser facilmente obtidas por meio de imageamento através do substrato no modo de detecção epi.

Nesta figura, nanopartículas de geração de segundo harmônico marcadas em estruturas cardíacas e EBS são exibidas em lâmina. As cores vermelha, amarela e verde correspondem à autofluorescência de NADH, enquanto os intensos pontos azuis de segundo harmônico provêm de nanopartículas isoladas de geração de segundo harmônico. Observe o bom contraste óptico e a marcação relativamente esparsa em comparação com pontos quânticos ou nanopartículas de conversão ascendente.

Esta figura ilustra uma vista em corte de um agrupamento cardíaco pulsante marcado com nanopartículas de geração de segundo harmônico. Como mostrado neste vídeo, as estruturas 3D são registradas em alta velocidade para monitorar o padrão de contração na segunda célula. As nanopartículas de geração harmônica agregam-se para manter uma alta taxa de aquisição, permitindo resolver o movimento das nanopartículas.

A sensibilidade geral de aquisição não foi suficiente para registrar a autofluorescência celular com emissão de harmônica secundária proveniente da geração de harmônica secundária. A análise de imagem de nanopartículas realizada em quadros de vídeos indica que, dentro do mesmo agrupamento cardíaco, os deslocamentos estão na ordem de poucos micrômetros, e a frequência é constante para o movimento de nanopartículas de geração de harmônica secundária dentro e fora do plano. Quando se domina a técnica de preparo celular, a dissecação do melhor agrupamento, a cultura ar-líquido e o parto podem ser realizados em 24 a 36 horas, se executados corretamente.

Principalmente com esta técnica, os contatos com o ar livre devem ser evitados para prevenir contaminações. Após este procedimento, pode-se aplicar outros métodos, como gravações eletrofisiológicas utilizando matrizes de múltiplos eletrodos, a fim de responder a questões adicionais, como correlacionar perfis de potenciais de ação com a frequência de contração em três dimensões. Nossa técnica inovadora, baseada na detecção do sinal não linear por nanopartículas harmônicas, pode ser ainda aprimorada para estudos in vivo, pois os comprimentos de onda utilizados para imagem permitem maior penetração nos tecidos.

Um possível desenvolvimento poderia ser acompanhar a integração de estruturas derivadas de células-tronco para aplicações em medicina regenerativa.