Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

O objetivo geral do experimento a seguir é o monitoramento in vitro de aglomerados de beading cardíaco derivados de células-tronco embrionárias humanas em tempo real 3D e alta resolução espacial. Isso é conseguido primeiro cultivando e expandindo células-tronco embrionárias até que formem corpos Embry. Em seguida, os conjuntos de batimentos são dissecados e plaqueados em filtros porosos de POLITETRAFLUORETILENO ou PTFE, o que permite que sejam mantidos como ar de longo prazo.

As culturas líquidas e os aglomerados de batimentos são marcados com nanopartículas harmônicas para realizar microscopia multifóton em tempo real. Os resultados obtidos permitem a análise do alongamento espacial e da frequência das contrações cardíacas na escala microscópica. Portanto, a principal vantagem dessas nanopartículas é que você pode usar qualquer comprimento de onda, especialmente infravermelho, para que você possa ir mais fundo no tecido e elas também são muito estáveis ao longo do tempo.

Assim, podemos monitorar nossos longos processos por longos períodos de tempo. Este método de cultura de células-tronco pode ajudar a responder a questões-chave no campo da contração funcional de cardiomiócitos em três dimensões. Em particular, maturação cardíaca e engenharia de tecidos.

O novo método de doença dos indivíduos deve estar ciente de que o procedimento de marcação com nanopartículas harmônicas só pode ser usado para microscopia multifotônica e não pode ser transferido para outros tipos de sistemas de imagem. Tivemos a ideia de usar nanopartículas harmônicas pela primeira vez em 2005. Essas nanopartículas apresentam vantagens em relação aos corantes fluorescentes e pontos quânticos.

Na verdade, seu sinal não desaparece com o tempo e eles podem ser usados para monitorar amostras em desenvolvimento por longos períodos de tempo. A demonstração visual da preparação da amostra é fundamental para a eficiência e a reprodutibilidade das diferentes etapas, em particular ao realizar testes de drogas e também pode ser aplicada a diferentes tecidos ou doenças. Modelagem de tecidos.

Depois de cultivar e expandir células-tronco embrionárias humanas ou ESCs de acordo com o protocolo de texto e incubá-las com colagenase quente, quatro por 10 minutos, coletar os fragmentos de colônia em dois mililitros de diferenciação fresca, meio ou DM e centrifugar a 115 vezes a gravidade por três minutos. Cultura, a colônia fragmenta em suspensão em anexos ultra baixos. Seis placas de poços por quatro dias para permitir que formem corpos embrionários ou ebs.

Em seguida, coloque o EBS recém-formado em placas de 24 poços revestidas com gelatina a 0,1% por 15 a 30 dias até o aparecimento de aglomerados batedores. Remova o PBS e usando acutus, dissocie as colônias em células únicas após centrifugação e resus, suspendendo as células em placa média de DM dois mililitros por agro. Poço câmara e incubar a 37 graus Celsius por um dia.

Colete o EBS recém-formado e coloque três por poço em placas de 24 poços revestidas com gelatina a 0,1% após duas a quatro semanas em cultura. Identifique aglomerados de cardiomiócitos batendo e, usando uma pipeta de pasta alongada e cortada, disseque-os manualmente. Deposite quatro filtros de PTFE por inserto e coloque cada um em um poço de uma placa de seis poços.

Depois de adicionar um mililitro de MS em cada um, adicione um aglomerado de batimento dissecado em cada filtro de PTFE. Para rotular os clusters, transfira os filtros de PTFE com os clusters de batimento para um prato de fundo de vidro de 3,5 centímetros. Adicione um mililitro de nanopartículas de segunda geração harmônica a 50 microgramas por mililitro e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius para realizar imagens ópticas não lineares.

Depois de transferir HEBs marcados ou clusters de batimentos cardíacos para uma câmara de imagem, use imagens de campo amplo sob iluminação de luz branca para identificar estruturas de interesse dentro de EBS diferenciados ou clusters de batimentos ativos. Realize uma varredura tridimensional rápida e de baixa resolução para reconstruir a morfologia geral do cluster cardíaco e selecione um plano de imagem dentro do volume do cluster com várias nanopartículas visíveis de geração de segundo harmônico para monitorar em tempo real. As contrações do cluster cardíaco colocam o scanner óptico do microscópio no modo mais rápido, permitindo a aquisição de imagens bidimensionais em vários hertz.

Analise as imagens usando o software MATLAB de acordo com o protocolo de texto conforme demonstrado aqui antes de avaliar a atividade de batimento. A caracterização da resposta óptica não linear dos filtros de PTFE é realizada para garantir que o substrato nu à fluorescência de fótons seja muito fraco e não possa impedir a medição das amostras biológicas relevantes e a emissão de isolados. As nanopartículas de segunda geração harmônica podem ser facilmente adquiridas por imagem através do substrato no modo de detecção epi.

Nesta figura, nanopartículas de segunda geração harmônica marcadas com estruturas cardíacas e EBS são exibidas em lâmina. As cores vermelha, amarela e verde correspondem à autofluorescência do NADH, enquanto as manchas azuis intensas do segundo harmônico derivam de nanopartículas isoladas de segunda geração harmônica. Observe o bom contraste óptico e a rotulagem relativamente esparsa em comparação com pontos quânticos ou nanopartículas de conversão ascendente.

Esta figura ilustra uma visão de fatia de uma segunda geração harmônica de nanopartículas rotuladas como cluster de batimentos cardíacos. Como mostrado neste filme, as estruturas 3D são gravadas em alta velocidade para monitorar o padrão de contração na segunda célula. As nanopartículas de geração harmônica se agregam para manter uma alta taxa de velocidade de aquisição para resolver o movimento NP.

A sensibilidade geral de aquisição não foi suficiente para registrar a autofluorescência celular com emissão de segundo harmônico da segunda geração harmônica. A análise de imagens de nanopartículas realizada em quadros de filme indica que dentro do mesmo deslocamento do aglomerado cardíaco são da ordem de alguns micrômetros, e a frequência é constante para dentro e fora do movimento de nanopartículas de segunda geração harmônica. Quando se domina a técnica de preparo celular, a dissecção do cluster de apostas, a cultura de líquido de ar e o parto podem ser feitos em 24 a 36 horas, se realizados corretamente.

Especialmente com esta técnica, os contatos ao ar livre devem ser evitados para evitar contaminações. Seguindo este procedimento, pode-se aplicar outros métodos, como registros eletrofisiológicos usando vários feixes de eletrodos, a fim de responder a perguntas adicionais, como correlacionar perfis de potencial de ação com frequência de batimento em três dimensões. Nossa nova técnica baseada na detecção do sinal não linear por nanopartículas harmônicas pode ser desenvolvida para estudos in vivo que infectam os comprimentos de onda usados para imagens permitem uma penetração mais profunda nos tecidos.

Um possível desenvolvimento poderia ser a integração da estrutura derivada de células-tronco para aplicações em medicina regenerativa.