Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

O objetivo geral deste procedimento é explorar estratégias para promover o crescimento dos vasos sanguíneos funcionais na retina e no SNC após lesão isquêmica. Isso é feito usando primeiro um modelo de camundongo de retinopatia induzida por oxigênio. Em seguida, os compostos são administrados ao olho por injeções intravítreas.

A perfusão do vaso e a função de barreira são então verificadas por angiografia com fluoresceína. A etapa final é extrair o olho e isolar a retina. A retina é então corada e montada antes da imagem.

Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para avaliar as taxas de regeneração vascular após tratamentos intravítreos ou em camundongos com modificações genéticas. A técnica que estamos apresentando fornece um sistema fácil e altamente reprodutível para avaliar a regeneração vascular no sistema nervoso central. É baseado no modelo Smith de retinopatia induzida por oxigênio e pode ser bastante útil na concepção de estratégias terapêuticas para remediar a isquemia no sistema nervoso central.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os mecanismos moleculares que impulsionam ou impedem a regeneração funcional dos vasos sanguíneos. No SNC. Pode ser usado para estudar o impacto de genes, compostos farmacológicos ou elucidar mecanismos patológicos que iniciam o crescimento vascular.

Além das doenças oculares, essa técnica pode ser extrapolada para outras áreas do SNC, como o cérebro e a medula espinhal. A prática é necessária para injetar com sucesso compostos no humor vítreo de estalos de camundongos e para lidar cuidadosamente com a prontidão fresca. Para começar, coloque os filhotes de camundongos em P sete e uma mãe adotiva CD um em uma câmara de oxigênio ajustada a 75% de oxigênio cinco dias depois, remova os animais da câmara e devolva-os às condições normais de alojamento. Em seguida, em P 12 ou P 14, injeções intravítreas são realizadas para fornecer compostos à retina interna.

Após anestesiar os camundongos, verifique a eficácia da anestesia beliscando sequencialmente a cauda, o pé traseiro e a orelha com uma pinça. Uma agulha de vidro chanfrada acoplada a uma seringa de 10 microlitros com uma gota de resina epóxi deve ser preparada com antecedência. Localize o local da injeção no limbo posterior do olho.

Insira a agulha em um ângulo de 45 graus e injete o composto de interesse. Depois de aplicar pomada no olho, retorne o camundongo de volta à gaiola com uma mãe adotiva para começar a centrifugar a solução de fluoresceína Dexter e coletar o supernat para evitar a constrição do vaso. Aqueça a solução de dextrina de fluoresceína antes de injetar.

Em seguida, confirme a profundidade da sedação no camundongo anestesiado. Quando estiver pronto, faça uma incisão na linha média sobre o abdômen com uma tesoura de dissecação. Depois de abrir a caixa torácica e remover o tecido periférico do coração, aperte a aorta descendente.

Insira uma agulha de calibre 25 cheia de dextrina de fluoresceína aquecida no ventrículo esquerdo e perfunda a solução. Dentro de dois minutos após a injeção, decapite o animal e coloque a cabeça de lado. Remova a pele e as pálpebras que cobrem o olho com uma tesoura de dissecação.

Em seguida, coloque uma pinça curva abaixo do olho e puxe-a suavemente para cima até que o nervo óptico seja cortado. Vire a cabeça do mouse para o outro lado e repita essas etapas. Para garantir uma melhor penetração do fixador, faça um orifício na câmara anterior do olho.

Usando uma agulha de calibre 30, transfira os olhos para um tubo contendo 4% de paraforme, aldeído e fixe por uma hora em temperatura ambiente. Após este tempo, remova o PFA e lave os olhos quatro vezes com PBS gelado. Coloque os olhos em uma placa de Petri contendo PBS frio e posicione-os sob um microscópio estéreo.

Uma vez no lugar, remova qualquer tecido extra ao redor do olho com uma tesoura de microdissecção e corte a córnea. Use dois pares de pinças para retirar a esclera da periferia em direção ao nervo óptico. Aperte a lente com uma pinça e extraia-a da ocular.

Use um par de pinças como suporte e o outro para segurar e levantar e remover cuidadosamente a lente. Separe os vasos alóides do lado interno da retina usando uma pequena escova e uma pinça. Em seguida, remova os feixes de vasos hialóides conectados ao disco óptico usando uma pinça.

Transfira as retinas dissecadas para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo PBS e coloque no gelo. Antes de iniciar o procedimento de coloração, as retinas dissecadas são primeiro incubadas durante a noite com agitação suave a quatro graus Celsius. Em uma solução, uma iso selectina B acoplada fluorescentemente quatro contendo cloreto de cálcio Durante todo o procedimento de coloração, os tubos devem ser cobertos com papel alumínio para protegê-los da luz no dia seguinte.

Remova a solução de coloração e lave as retinas três vezes em PBS por 10 minutos. À temperatura ambiente, transfira o lado fotorreceptor da retina para baixo para um microscópio. Deslize enquanto apoia a retina com uma escova.

Faça quatro incisões radiais equidistantes profundas. Usando um bisturi cirúrgico, alise cuidadosamente os quadrantes e mergulhe a retina em meio de montagem para fotoclareamento coloque cuidadosamente uma lamínula na superfície da retina montada sem aplicar pressão e evitando bolhas de ar. Finalmente, as lâminas são fotografadas e quantificadas.

Para a obliteração vaso, foi observado um aumento dependente da dose na regeneração vascular após a injeção de Trin one em P 14 e o recrescimento. Avaliado em P 17 vasos com fluorescência de vazamento de função de barreira comprometida após profusão com dextrina fluorescente após injeção intravítrea de lentivírus. Em P três, a inibição de IRE um alfa aumentou drasticamente a regeneração vascular na fase de crescimento vascular em P 17.

Uma vez que essas técnicas sejam dominadas, a injeção intravítrea, a perfusão cardíaca e a extração da retina devem levar cerca de 10 minutos cada uma, se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante preservar a estrutura 3D do olho, evitar uma pressão excessiva que pode danificar a retina e comprometer os resultados. Não se esqueça de que trabalhar com animais, vírus ou compostos bioativos pode ser extremamente perigoso.

Precauções de segurança e ferramentas esterilizadas devem sempre ser usadas durante a execução deste procedimento.