Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

O objetivo geral deste procedimento é realizar a injeção de células mortas, ou DNA, em corações embrionários de camundongos. Para investigar a gordura celular ou manipular localmente a expressão gênica, isso é feito primeiro dissecando os embriões de um camundongo prenhe e expondo o coração embrionário. Em seguida, o corante ou as células de DNA são injetados na região alvo de interesse no coração.

Então, depois que o embrião é incubado, o coração é removido e colocado em cultura. Finalmente, o destino das células injetadas ou marcadas é determinado por microscopia. Em última análise, o destino das células injetadas, marcadas ou geneticamente modificadas é monitorado por microscopia confocal ou microscopia de luz e epifluorescência, revelando a importância funcional de genes e células específicos durante o desenvolvimento cardíaco.

A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a transgênese em camundongos, é que podemos injetar localmente e com precisão células de laboratório ou geneticamente modificadas in vivo. Isso permite a investigação dessas células no ambiente adequado. Demonstrando este procedimento estaremos eu e Emily aar, uma estudante de doutorado de um laboratório.

Após o preparo do equipamento, reagentes e soluções, de acordo com o protocolo de texto, coletar embriões E 9.5 e E 10.5 de um camundongo prenhe eutanasiado, primeiro usando etanol a 70% para esterilizar o tórax, fazer uma incisão na linha média ventral para abrir o abdômen e recuperar o corno uterino antes de transferi-lo para PBS em temperatura ambiente. Após duas lavagens adicionais em PBS, transfira-o para uma placa de Petri cheia de silicone. Com o meio M 16, use alfinetes de insetos para prender o chifre uterino à camada de silicone de modo que o lado vascularizado do útero fique por baixo.

Em seguida, use uma pinça fina para cortar a superfície do útero e tampar a folha caducifólia um milímetro abaixo da superfície. Espalhe as paredes da decídua e recupere suavemente o embrião no saco vitelino. Armazene-o em M 16, médio a 37 graus Celsius antes da injeção de células para realizar injeções.

Primeiro, use uma seringa Hamilton para encher uma pipeta de vidro da parte de trás com DNA ou células e agite a pipeta para remover as bolhas. Na ponta, coloque a pipeta no suporte de microinjeção e ajuste o injetor de acordo com as configurações a seguir. Em seguida, prenda o embrião no fundo de silicone através do saco vitelino sem tocar no embrião propriamente dito.

Em seguida, identifique a região do coração e abra o saco logo acima dessa região. Adicione quatro pinos ao redor do embrião para evitar qualquer movimento durante a injeção celular. Usando o micro manipulador definido como manual, posicione lentamente a ponta da pipeta em um ângulo de 45 graus acima do pericárdio, logo acima da região do coração a ser injetada.

Mova a pipeta para a região de interesse, acione a injeção e retire a pipeta o mais rápido possível. Certifique-se de que o coração está batendo corretamente após a injeção de DNA ou célula Usando o protocolo de injeção descrito neste vídeo para estudar a transição epitelial para mesênquima e E 9.5 Um explane VC foi injetado com um S-H-R-N-A que regula negativamente uma proteína necessária para a transição mesenquimal endotelial das células endocárdicas. O embrião controle foi injetado com um vetor de espinha dorsal vazio, da mesma forma, células pré-valvares endoteliais derivadas de células HUES expressando GFP sob o controle do promotor SOX nine foram injetadas no A VC em E 10,5, seguido por 48 horas de cultura cardíaca explantada.

Essas células adquirem marcadores de EMT, como a periostina, semelhantes às células endocárdicas endógenas. As abordagens ex vivo demonstradas aqui são relativamente fáceis, mas limitadas a um acompanhamento máximo de curto prazo de 48 a 72 horas. No entanto, o procedimento de injeção guiada por ultrassom descrito no protocolo de texto fornece uma abordagem tecnicamente mais desafiadora, mas com a opção de acompanhamento pós-parto longo e até mesmo no útero.

A injeção in utero de corante ou vetores virais para marcar células em regiões cardíacas específicas é mostrada aqui. Com este método, a marcação específica de células epicárdicas pode ser alcançada com corantes fluorescentes ou vírus, e o método pode ser expandido com células ou injetáveis alternativos. Seguindo este procedimento, um método como a cultura de bryo pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como o efeito a longo prazo de um gene, uma molécula ou leitura de lista longa, como a morfogênese do tecido após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e genética do desenvolvimento cardíaco. Isso nos permite explorar o mundo dos novos genes, bem como investigar o destino das células humanas no contexto embrionário adequado. Isso é muito útil quando uma linha de camundongos transgênicos não está disponível.