Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens de imunofluorescência intravital da orelha de camundongos portadores de melanoma para estudar a dinâmica dos componentes da matriz do tecido tumoral. Isso é feito inoculando primeiro uma orelha de camundongo com células de melanoma B 16 F 10 que expressam GFP. Em seguida, a cirurgia é realizada na orelha do camundongo para separar a pele ventral da orelha dorsal e expor o tecido tumoral.

Em seguida, a imunocoloração é realizada no tecido exposto da orelha dorsal. Finalmente, o animal é preparado para imagens intravitais. Em última análise, a microscopia estereoscópica fluorescente ou microscopia multifóton é usada para mostrar a localização e o comportamento dinâmico das células tumorais e seus componentes de matriz.

A principal vantagem dessa técnica em comparação com os outros métodos de imagem ao vivo é que podemos visualizar as interações dinâmicas das células tumorais com as células associadas ao estroma, como as células imunes, mas está no contexto da matriz fibrilar e da malha como a matriz extracelular. Portanto, esse método pode ajudá-lo a abordar questões-chave no campo da biologia tumoral, como como as células tumorais interagem com seu microambiente físico, o que, por sua vez, pode fornecer informações importantes sobre como os tumores progridem. Parte do procedimento será demonstrada por Vita Kki, cientista sênior do nosso laboratório. Para preparar as células tumorais para injeção, comece cultivando células de melanoma B 16 F 10 GFP.

Depois de centrifugar as células, transfira-as para um tubo einor de 1,5 mililitro e gire novamente, remova todo o sobrenadante, exceto uma fina camada de meio que fica logo acima do pellet, ressuspenda as células em uma pasta de célula espessa ao lado de carregar a pasta de célula em um volume de 10 microlitros. Seringa Hamilton. Remova a tampa da ponta de uma agulha de calibre 33 anexada e carregue 20 microlitros da pasta no topo da câmara da ponta.

Em seguida, puxe o êmbolo para trás até que cinco microlitros de pasta sejam carregados dentro da seringa. Depois de anestesiar um camundongo C 57 preto com anestesia injetável, raspe a cabeça do rato, dete os pelos da cabeça e ao redor da orelha e enxágue com água. Usando fita adesiva, fixe a borda proximal da orelha na ponta de um dedo indicador.

Insira a agulha da seringa Hamilton entre a derme dorsal e a cartilagem da orelha de um camundongo C 57 preto de seis penetrando na orelha de proximal a distal por aproximadamente dois a três milímetros. Injete a pasta celular e retraia lentamente a agulha da pele. Deixe as células tumorais formarem um tumor sólido ao longo de sete a nove dias, usando um microscópio de fluorescência para acompanhar o crescimento do tumor.

Depois de usar uma mistura de oxigênio umidificado e flúor iso para anestesiar o mouse, coloque-o em uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius e belisque suavemente o dedo do pé. Para confirmar que o animal está suficientemente anestesiado. Aplique pomada oftálmica nos olhos e mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento controlada por termistor retal durante todo o procedimento.

Em seguida, coloque suavemente a orelha com tumor em uma pilha de lâminas de vidro. Em seguida, use pequenas tiras de fita adesiva para fixar as bordas anterior e posterior da orelha à pilha usando um bisturi, corte a pele ventral da orelha ao longo da anti-hélice do pavilhão auricular do camundongo. Remova as fitas da orelha com a ajuda de uma pinça curva.

Retire suavemente a derme ventral e a cartilagem da derme dorsal. Use o tampão de campainha para lavar a orelha para realizar a coloração imunofluorescente. Aplique anticorpos primários direcionados a moléculas de matriz extracelular no tampão de bloqueio na orelha exposta e coloque uma lamínula por cima.

Incube por 15 minutos antes de usar aproximadamente cinco mililitros de tampão de campainha para lavar a orelha duas vezes. Aplique anticorpos secundários apropriados ou estreptococos Aden no tampão de bloqueio. Aplique uma lamínula e incube por 15 minutos antes de lavar duas vezes Como antes, dobre a área dérmica aberta no EM mencia conki e use lenços estéreis para secar a derme externa da orelha fechada.

Coloque a orelha em uma pilha de lâminas de vidro e aplique 0,5 microlitros de cola cirúrgica nas bordas dorsais anterior e posterior para imobilizá-la para imagens de curto prazo de duas horas ou menos. Adicione estéril recém-preparado como tampão de sorbato em cima da orelha imobilizada e aplique uma lamínula. Em seguida, use um microscópio estéreo fluorescente com duas lentes para obter imagens do ouvido.

Para imagens de longo prazo. Coloque a saída de uma agulha presa a um reservatório contendo anéis de sorbato sob a lamínula a aproximadamente 0,5 centímetros de distância da orelha. Use uma bomba peristáltica a uma velocidade de um microlitro por minuto para fornecer constantemente o tampão à câmara.

Abra o software de aquisição. Ajuste a intensidade de fluorescência de ganho, ampliação e tempo de exposição da imagem, vários campos que contêm células tumorais, bem como proteínas da matriz extracelular coradas para realizar imagens intravitais usando microscopia multifóton com graxa de silício. Começando na base da orelha.

Construa uma parede circular de cerca de dois centímetros de diâmetro e dois a três milímetros de altura ao redor da orelha. Preencha o círculo com toques de sorbatato. Coloque o mouse no palco em uma almofada de aquecimento, ajuste a 37 graus Celsius e defina as configurações do microscópio de acordo com o protocolo de texto.

Conforme mostrado nesta figura, muitas estruturas podem ser distinguidas com base em sua morfologia após a imunocoloração. Para componentes da membrana basal, como colágeno quatro ou proleano, o mais importante, proteínas estruturais que normalmente não podem ser detectadas pelo SHG. O método clássico de detecção de matriz pode ser visualizado.

Por exemplo, descobrimos que dezenas e C são depositados em diferentes locais do estroma tumoral a partir de colágenos fibrilares, forças que se desenvolvem dentro do microambiente tumoral podem levar à expansão ou contração da matriz tumoral e, como consequência, remodelação da vasculatura tumoral semelhante à cicatrização de feridas. Aqui mostramos que podemos realizar microscopia de lapso de tempo de dois fótons, ao mesmo tempo em que criamos imagens de tenas imunomarcadas e matriz C com fotobranqueamento mínimo de quatro flúor, mesmo em alta densidade de fótons para microscopia de fótons. Neste vídeo, as células tumorais que foram sobrepostas na derme exposta prestada para colágeno quatro aderiram ao tecido e em grupos começaram a migrar coletivamente ao longo da membrana basal dos vasos sanguíneos e locais adiposos.

Uma vez dominado, todo o procedimento de abertura da orelha e imunocoloração leva duas horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a coloração imunovital intravital para estudar as interações da matriz celular em tumores usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.