Terapia Celular para insuficiência cardíaca em Rat: Double toracotomia para infarto do miocárdio e Epicárdica implante de células e Biomatrix

O objetivo deste procedimento é executar uma dupla toracotomia em ratos para realizar ligadura coronariana e aplicação epicárdica. Isso é feito realizando primeiro uma toracotomia no quarto espaço intercostal. Em seguida, a artéria coronária descendente anterior esquerda ou DA é ligada.

Em seguida, uma segunda toracotomia é realizada duas semanas depois no quinto espaço intercostal. Finalmente, as células e a matriz são aplicadas à superfície do coração infartado batendo. Em última análise, a ecocardiografia é realizada para avaliar a função cardíaca e a histologia é realizada por medições do tamanho do infarto.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a esternotomia, é que é uma abordagem minimamente invasiva, demonstrando que o procedimento será e ine Lopez enviou colaboradores de nosso laboratório. Todos os animais foram tratados de acordo com as recomendações da F-E-L-A-S-A e da Lei Suíça de Proteção Animal. Depois de exsanguinar um rato e isolar e limpar os ossos do fêmur de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura para cortar as duas pontas dos ossos.

Em seguida, para lavar a medula óssea, injete PBS estéril no núcleo do osso e colete a medula em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a medula óssea coletada por sete minutos a 300 vezes G.Remova o supinato com três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Suspender o pellet, incubar a suspensão durante um minuto à temperatura ambiente antes de voltar a centrifugar durante sete minutos a 300 vezes G após o resus.

Suspensão do pellet em meio de cultura estéril. Adicionar um meio de cultura celular suplementar num balão de cultura de 150 mililitros e semear as células no segundo dia de incubação. Troque o meio para remover as células não aderentes e continue a substituir o meio a cada dois dias por duas a três semanas até que a densidade celular desejada seja alcançada.

Para realizar a primeira toracotomia T, comece pesando o rato e configure os parâmetros do ventilador de acordo. A vazão de ventilação é definida automaticamente. Em seguida, raspe a parte esquerda do tórax, ligue uma almofada de aquecimento e ajuste-a para 37 graus Celsius.

Depois de anestesiar o rato de acordo com o protocolo de texto, faça uma pinça no dedo do pé ou na cauda antes de colocar o rato na almofada de aquecimento em decúbito dorsal usando um cateter IV de calibre 14, intubar o animal e, em seguida, conectar o cateter de intubação a um ventilador de roedores. Programado para 2,5 litros por minuto de oxigênio, 2,5% de flúor, um volume corrente de dois mililitros e uma frequência respiratória de 90 respirações por minuto. Depois de preparar uma seringa com buprenorfina 0,1 miligramas por quilograma por via subcutânea, injete um terço da solução e, em seguida, use a solução de betadina a 1% para desinfetar a área.

Em seguida, incise a pele perpendicularmente ao esterno do quarto espaço intercostal e separe as três camadas do músculo torácico. Em seguida, abra o quarto espaço intercostal entre as costelas quatro e cinco. Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e expor o coração.

Em seguida, abra cuidadosamente o pericárdio e localize a artéria coronária descendente anterior esquerda ou LAD, e use uma sutura 7.0 para ligá-la quatro milímetros abaixo do átrio. Em seguida, controlar a mudança de cor da área isquêmica com três pontos zero posicionados aproximada e distalmente do esterno. Faça dois pontos para serem usados para fechar o espaço intercostal.

Aperte a sutura distal. Prenda o tubo de exaustão do ventilador por dois segundos para inflar o tórax e evitar pneumotórax. Em seguida, aperte a segunda sutura.

Posicione as camadas musculares de volta no lugar. Em seguida, use cinco suturas zero para fechar a pele com solução de 1% Betadina Desinfete a sutura e injete a solução de buprenorfina restante.

Desligue o sistema de anestesia e remova o cateter de intubação. Mantenha o rato em uma gaiola sob uma lâmpada quente por uma a duas horas antes de devolvê-lo a uma unidade IVC. Duas semanas após a primeira toracotomia, a cicatrização está completa e uma cicatriz é quase invisível.

Seguindo o procedimento descrito anteriormente neste vídeo para preparar o rato para a cirurgia, faça uma incisão na pele perpendicular ao esterno no quinto espaço intercostal. Separe as três camadas do músculo e abra o quinto espaço intercostal entre as costelas cinco e seis. Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e expor o coração.

Se houver alguma aderência, use uma pinça fina para aliviá-la cuidadosamente. Em seguida, localize a área do infarto que aparece como uma área pálida abaixo da ligadura. Se necessário, insira um pedaço de 10 centímetros de sutura de sete zero no ápice e puxe-o suavemente para visualizar melhor o ventrículo esquerdo.

Em seguida, aplicar células e matriz na superfície da área isquêmica do coração. Após a peletização, quatro vezes 10 elevado às seis células, conforme descrito no protocolo de texto, deposite a paleta no coração antes de usar um selante de fibrina para cobri-lo. A camada de cola fixa as células na superfície do coração.

Depois de remover o pedaço de sutura da posição do ápice, as camadas musculares voltam a suturar e desinfetar o animal. Conforme demonstrado anteriormente no vídeo, conforme mostrado aqui. Após a intervenção cirúrgica, os animais perderam peso e se recuperaram rapidamente antes de ganhar peso, independentemente do tratamento aplicado Conforme demonstrado neste gráfico de Kaplan, a taxa de sobrevivência é alta após a primeira toracotomia T, os animais tratados com fibrina e/ou células demonstraram taxas de sobrevivência mais baixas do que os outros grupos, como visto neste gráfico.

No entanto, as taxas de sobrevivência geral permaneceram altas após um segundo. A toracotomia e o tratamento da função cardíaca foram avaliados por ecocardiografia. Essas imagens representativas do modo M para animais saudáveis e infartados ilustram que a contratilidade da parede do VE é abolida duas semanas após a ligadura LAD, o encurtamento fracionário foi registrado duas semanas após a ligação LAD em um total de 104 animais.

A distribuição de frequência mostra métodos razoavelmente reprodutíveis com um coeficiente de variação de 17%Esta figura mostra a representação gráfica da função cardíaca pela fração de ejeção medida duas e seis semanas após a LAD lação A função cardíaca continua a diminuir durante este período de tempo. A remodelação cardíaca também ocorre durante esse período e é representada aqui por um aumento nos volumes do VE registrados tanto na irmã quanto na diástole. Finalmente, a coloração dourada em seções cardíacas revelou que o tecido fibrótico e, eventualmente, uma cicatriz transmural se desenvolveram seis semanas após a ligadura do LAD Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 40 minutos se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma toracotomia dupla minimamente invasiva.