Name: MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprenda o método BEST para sequenciamento automatizado de tétrades em leveduras usando classificação por fluorescência. Esta técnica de alta vazão permite isolar milhares de progênies recombinantes em poucas horas.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH / NHGRI Genoma Acadêmico / Faculdade de Transição (K22 HG002908) para AMD e uma parceria estratégica entre o Instituto de Biologia de Sistemas e da Universidade de Luxemburgo. Os pedidos de estirpes ou plasmídeos devem ser dirigidas ao Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Construção Coe e Caracterização <ol><li> Construir a estirpe diplóide heterozigótica para ser usado na transversal por meio de cruzamentos estirpes haplóides e seleccionar diplóides 2 ou utilizando uma estirpe heterozigótica que ocorre naturalmente. As cepas não deve abrigar GFP. </li><li> Confirmar que a estirpe é incapaz de crescer em meio YPD 2 + 200 ug / ml de G418. </li><li> Confirme se a tensão é capaz de esporular. MELHOR é compatível com a baixa eficiência cruzes esporulação, mas aumenta a freqüência baixa esporulação FACS tempo classificando necessário. <ol><li> Defina-se uma cultura D / N da estirpe em 5 mL de YPD e crescer com agitação a 30 ° C. </li><li> Lavar 0,5 ml da cultura O / N, três vezes com PBS (pH 7,4). </li><li> Agregar as células lavadas, remover o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio de esporulação 7. </li><li> Agitar as células à temperatura ambiente e verifique diariamente para formação de tétrades usando um microscópio de luz de contraste de fase com uma objetiva de 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimar a viabilidade dos esporos da cruz por dissecção convencional 2,3 de um pequeno número (~ 20) de tétrades. Viabilidade Spore em cruzamentos entre diferentes contextos de tensão varia muito e de forma imprevisível. No entanto, uma expectativa a priori da viabilidade dos esporos pode ser utilizado para avaliar a eficiência de uma melhor experiência antes dos trabalho-e onerosas medidas de poupança e genotipagem das cepas. Portanto, esta etapa é altamente recomendável. </li></ol> 2. Transformação de diplóides com Biblioteca de códigos de barra dos Plasmids <ol><li> Inserir o plasmídeo com código de barras pCL2_BC na estirpe diplóide heterozigótica utilizando o protocolo de transformação descrito no Gietz e Woods 8 com as seguintes modificações. <ol><li> Depois as células foram incubadas com a mistura de transformação, a 30 ° C durante 20 min, adiciona-se DMSO a 8% do volume da mistura de transformação. A adição de DMSO foi encontrada para melhorar a eficiência de transformação in alguma tensão fundos 9. </li><li> Após o passo de choque térmico, sedimentar as células com uma breve centrifugação, decanta-se a mistura de transformação, e lavar suavemente as células em meio YPD. Em seguida, voltar a suspender as células em 1 ml de YPD e lhes permitir recuperar a RT durante 3 horas, sem agitação. </li></ol></li><li> Seleccionar transformantes por plaqueamento em YPD + G418 (200 ug / ml) em placas de agar. Para assegurar uma associação complexa de códigos de barras de plasmídeo, colher um grande número de colónias, por exemplo, placas com 5 ~ 2500 colónias por placa. </li><li> Uma vez que as colónias são visíveis (2-3 dias de crescimento a 30 ° C), juntar os transformantes por cuidadosamente raspando-os da placa em líquido YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% de glicerol. Vortex esta suspensão celular, transferir para um frasco de criopreservação, e congelar a -80 ° C. Faça um estoque congelado separado para cada placa. Estes stocks congelados servir como as estirpes de partida para o Passo 3.1 e pode também ser usado para gerar mais tétradas numa data posterior, se desejado. </li&gt; </ol> 3. Esporulação da Biblioteca de células transformadas obter Barcoded Tetrads <ol><li> Reviver as células dos lotes congelados criados em 2,3 por crescimento S / N em 5 ml de YPD + G418 (200 ug / ml) a 30 ° C com agitação. </li><li> Lave as células a partir de O / N culturas 3x em PBS (pH 7,4) e, em seguida, voltar a suspender as células em meio de esporulação 7, com 200 ug / ml de G418. </li><li> Agitar culturas esporulação em RT e monitorar o progresso esporulação diariamente até novas tétrades pararam formando. </li><li> Uma vez que a cultura contém tétradas bem formadas e relativamente poucas duplas, remover culturas de agitação e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 7 dias. Enquanto alguns cruzamentos podem ser passíveis de digestão em placa e perturbações logo tétradas ter formado (avaliada como descrito em 7.3), a incubação adicional (7-10 dias nas nossas experiências) é essencial para outros cruzamentos. Portanto, esta etapa é altamente recomendável. </li></ol> 4. Estabelecero FACS Portões para Tetrad Sorting O meioticamente expressa fusão SPS2-GFP no plasmídeo pCL2_BC permite tétradas na cultura esporulação ser detectadas e isoladas a partir da cultura por meio de fluorescência. O protocolo seguinte foi desenvolvido para uma FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS portões. Uma série de quatro portas sequenciais é utilizada para isolar as tétradas. As portas mostrado em (A) e (B) permite reduzir o número de aglomerados. Eventos fluorescentes são selecionados com o portão em (C). O histograma (D) tem dois picos. Eventos no pico esquerda são principalmente tétrades (imagem inserido à esquerda), e eventos no pico direita são geralmente tétrades com uma gema ligada (imagem ampliada direita). Um portão final éaplicada a este histograma para selecionar os eventos que são principalmente tétrades (barras vermelhas). Este valor foi modificado de Ludlow, et al 1. <ol><li> Carregue a cultura esporulado em um classificador de FACS e configurar dois de dispersão e de dispersão lateral portas para a frente para excluir detritos, as células agregadas, e várias células por gotículas (Figuras 2A e 2B). </li><li> Deve haver uma população de células fluorescentes, que quando se utiliza a construção repórter SPS2-GFP incluem duplas e 10 tétradas. Portão da GFP vs FSC para incluir esses eventos fluorescentes (Figura 2C). </li><li> Dependendo da estirpe de fundo que pode ser necessário incluir um portão adicional para remover aglomerados que incluem tétradas e outras células. Se isso for necessário, inspecionar um histograma FSC dos eventos fluorescentes e especificar um portão que inclui eventos de menor FSC (Figura 2D, os eventos fechados estão em vermelho). </li><li> Verificar a eficiência de t<html> ele gating regime classificando ~ 1.500 tétrades sobre uma lâmina de microscópio e contando a proporção de tétrades a não-tétrades usando um microscópio de contraste de fase em aumento de 400X. A percentagem de tétradas pode ser estimada com precisão pela contagem de apenas ~ 200 eventos classificados, mas triagem ~ 1500 reduz a quantidade de tempo gasto na procura de células sobre a lâmina de microscópio. Em alternativa, a razão de tétradas a não tétradas pode ser avaliada durante a etapa 4.5. </li><li> Verifique periodicamente se o classificador está relatando com exatidão o número de eventos, classificando 25 tétrades sobre uma lâmina de microscópio e examinar as células contidas na gota usando um microscópio de contraste de fase em aumento de 400X. Deve haver 25 tétradas na gotícula. Repetir 3-4x para avaliar a variação do instrumento FACS. </li></ol> 5. Seleção Tetrads para um placa de ágar &quot;width =&quot; 500 p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Colocação da placa de ágar sobre o classificador de SCAF. Para classificar tétradas em uma pequena gota de solução de Zymolyase colocado no meio de uma norma (circular) da placa de ágar, um padrão de 100 mm (rectangular) placa de 96 poços é primeiro colocado na etapa da separação de células e o classificador é programado para depositar tétradas num poço específico (neste caso, D5). Em seguida, a placa de ágar circular está colocado em cima da placa de 96 poços e alinhado de modo que a queda de Zymolyase está centrada sobre o bem especificadas. <ol><li> Aquece-se a quantidade desejada de YPD + G418 (200 ug / ml) para placas de pelo menos 1,5 horas, numa incubadora a 37 ° C posicionado perto do separador FACS. </li><li> Uma característica fundamental do protocolo de classificação é a capacidade de direcionar com precisão FACS classificadas tétrades para um local específico em uma placa de ágar que contém um conjunto de solução Zymolyase. Para fazer isso, coloque um &quot;marco&quot; placa de 96 poços em tele automatizado unidade de deposição de células (ACDU) do classificador. Prepara-se uma disposição tipo que irá separar 25 tétradas para um poço de um formato de 96 poços. Escolher bem perto do meio da placa, por exemplo, bem D5. Figura 3 mostra uma placa de Petri, e placa de 96 poços carregados num seleccionador de células. Classificando 25 tétrades por placa produz colônias bem separados. </li><li> Trazer uma pilha de 10 placas de agar do incubador a 37 ° C para o classificador. </li><li> Tomar uma placa de agar e de pipeta 25 ul de uma solução de Zymolyase (1 mg / ml em 0,7 M de sorbitol) para o ágar, perto do centro da placa. Em seguida, coloque a placa no marco placa de 96 poços, alinhando a gota Zymolyase sobre o alvo bem a partir do Passo 5.2, por exemplo, bem D5. </li><li> Inicie o tipo e depositar 25 tétradas para o meio da gotícula de Zymolyase na placa de agar. Em seguida, remover e cobrir a placa. </li><li> Repita os passos 5.4 e 5.5 até 25 de tétrades foram classificadas em gotas Zymolyase em cada prato na pilha. </li&gt; <li> E volta a pilha de placas contendo tétrade à incubadora a 37 ° C. </li><li> Repita os passos 5.3 a 5.7 até que todas as placas têm tétrades. </li></ol> 6. Separando Esporos <ol><li> Incubar cada pilha de placas de agar contendo tétrade a 37 ° C durante 1,5 horas. </li><li> Remover placas da incubadora, adicione 15-25 contas estéril 3 milímetros de vidro por placa, e agitar as placas como uma pilha (ou em duas pilhas de 5 placas) por 3-5 min. A melhor separação dos esporos é conseguido movendo as placas rigidamente de lado a lado ou de frente para trás. Não mova as placas de tal forma que os grânulos de &quot;redemoinho&quot; em torno da borda externa da placa. Deixar as contas sobre as placas quando terminar. </li><li> Coloque a pilha de placas com contas de enfrentar em uma incubadora de 30 ° C. Recuperar os próximos placas de pilha da incubadora 37 ° C, e repita o Passo 6.2. </li><li> Incubar as placas de O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Colheita Colônias <ol><li> Depoisuma incubação O / N a 30 ° C, colónias pequenas deverão ter formado sobre as placas. Retire cuidadosamente as placas da incubadora, sem perturbar as contas de vidro. </li><li> Remover as esferas de vidro com cuidado e rapidamente invertendo as placas ao longo de um recipiente de fundo. O recipiente deve ser profundo o suficiente para pegar as contas, sem que lhes permite saltar para cima e bater a placa de ágar. Tocar no fundo da placa, enquanto que é invertido pode ajudar a desalojar os grânulos que estão presas à placa. Estes grânulos pode ser reutilizado por lavagem com sabão, lavando bem com água desionizada e esterilização em autoclave. </li><li> Contar o número de colónias em cada placa e usar o número de colónias para estimar a eficiência da separação de esporos e de recuperação. Por exemplo, 25 tétrades por placa para uma cruz com perto de 100% de viabilidade poderia render um total de 100 colônias por placa. </li><li> De placas com número suficiente de colônias (&gt; 65 para uma alta viabilidade cruzes), células de transferência de cada colony em um poço separado de uma placa de 96 poços contendo meio YPD líquido + G418. Além disso, tome nota do que poços conter colônias de uma mesma placa de ágar; esta informação será utilizada para auxiliar o software atribuição tétrade. </li><li> Use o-bem placas de 96 líquidos para semear culturas para genotipagem e para salvar cepas como ações de glicerol congelados. Detalhes sobre sequenciação RAD-tag e análise da sequência pode ser encontrada em Ludlow et ai 1. </li></ol>

<ol><li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+tetrad+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li>
<li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRose%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+A+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).</li>
<li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+two+types+of+spore+germination%2C+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Trav.+Lab.+Carlsberg+Ser.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li>
<li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspore+bridges%3A+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li>
<li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li>
<li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li>
<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Muitas áreas de investigação genética, que variam a partir de complexo de mapeamento traço 11 para o estudo dos mecanismos subjacentes da recombinação de ADN 12, exigem um número extremamente grande de descendência e grandes volumes de sequenciação de ADN. As técnicas que se casam com o poder de abordagens convencionais com a capacidade de alto rendimento de sequenciação do ADN têm o potencial para permitir estudos que foram anteriormente intratável. Apesar de vários de alto rendimento de genética de leveduras métodos têm sido aplicados de forma eficaz para problemas específicos, cada um tem limitações que ficam aquém da ampla aplicabilidade da análise tétrade convencional. MELHORES endereços estes desafios, empregando uma abordagem de alto rendimento, combinando tétrade dissecção e genotipagem da descendência de cruzamentos de leveduras. Em conjunto com multiplexado seqüenciamento RAD-tag, o BEST oferece uma maneira barata de recolher informações genótipo para cada estirpe descendência, preservando as relações tétrade por meio de códigos de barras tétrade únicas.0; De todos os métodos actualmente utilizados rendimento elevado, melhor recapitula mais de perto as informações fornecidas por uma cruz levedura dissecados manualmente. MELHOR tem duas características principais. A primeira é o uso de FACS para isolar rapidamente tétradas distância a partir de células em cultura esporulados (Protocolo Passos 5-6). A capacidade de isolar milhares de eventos fluorescentes (tetrads) dá melhor o seu maior ganho no rendimento. Esta automação proporciona uma vantagem ainda maior sobre dissecção manual para cruzamentos com baixa eficiência esporulação, devido ao aumento do tempo necessário para identificar visualmente eventos raros. A segunda característica fundamental é o uso de um código de barras molecular altamente complexa (Protocolo Etapa 2) que é transmitida para cada esporo irmã de uma tétrade. Porque estes códigos de barras pode ser usado para reconstruir as relações computacionalmente tétrade entre os esporos que foram distribuídos aleatoriamente através de uma placa de ágar, a necessidade de se manualmente as células da matriz em uma grade ordenada é aliviada. Finalmente,porque o código de barras molecular e o gene repórter da GFP específica do esporulação são fisicamente ligados (no mesmo plasmídeo), apenas tétradas que retiveram o código de barras molecular são seleccionados por separação FACS. Há duas considerações que determinam a quantidade de tempo que as culturas devem ser incubados no meio de esporulação. Primeiro, porque o repórter específico esporulação (SPS2-GFP) é expressa no início da meiose, sozinho GFP não distingue completos tétrades 4 de esporos a partir de células que não tenham concluído a meiose (ou seja, díades). Enquanto gating FACS adicional pode diminuir o número de fluorescentes, tétrades incompletos, a maneira mais fácil de diminuir esses eventos indesejados é simplesmente monitorar a cultura esporulação (Passo 3.3) e prosseguir uma vez novos tétrades pararam formando. Em nossos experimentos, a freqüência de duplas classificadas é inferior a 1%. Em segundo lugar, para alguns cruzamentos tempo adicional gasto em meio de esporulação na RT sem agitação (Passo 3.4) sigcativamente melhora a separação de tétradas por as pérolas de vidro durante o plaqueamento ((Protocolo Passo 6). Na verdade, este passo é absolutamente necessário para a ruptura de alguns cruzamentos. Como todos os métodos de rendimento elevado, melhor é &quot;mais ruidoso&quot; do que a abordagem convencional correspondente. A modesta redução na eficiência de melhor em relação a dissecção tétrade convencional pode resultar da combinação de vários fatores. Um fator é o aumento da perda de esporos viáveis ​​de outra forma, o que poderia resultar da adesão às contas de vidro durante a propagação ou aumento da morte de esporos, devido às tensões mecânicas do processo. Um segundo fator pode ser a perda de plasmídeo simples durante a meiose. Um terceiro fator pode ser uma efetiva diminuição nas colônias utilizáveis ​​resultantes de colônias com genótipos mistos, uma estimativa de ~ 5% de colônias em nosso piloto atravessa 1. É provável que essas colônias representam falhas de separação de esporos irmã. Devido à rápida fluorescence triagem e separação de esporos permitir a recolha de um número enorme de tétrades, o BEST está bem equipado para superar diminuição na eficiência nessa escala. Enquanto futuras iterações de melhor poderia aumentar a eficiência que se aproxima de dissecção manual, talvez seja mais provável que a trajetória atual exponencial da capacidade de sequenciamento de DNA irá compensar rapidamente para este nível de perda de tensão utilizável. Independentemente disso, a capacidade de realizar análises tétrade na escala para que melhor pode ser aplicado permitirá estudos que estão atualmente inviável por métodos manuais.

Mapeamento genético meiótica, vulgarmente conhecida como análise tetra, é central para a genética do fermento. Resumidamente, duas cepas haplóides, cada um contendo uma única cópia de cada cromossomo, são acoplados para formar uma linhagem diplóide heterozigoto com duas cópias de cada cromossomo, um de cada pai. Starving células diplóides de nitrogênio induz a meiose (esporulação), em que os cromossomos duplicados, sofrer rearranjo, e dividem-se em quatro células haplóides (esporos ou segregantes) com novas combinações de alelos de cada um dos pais. Os quatro esporos resultantes de uma única meiose pode ser isolado por um processo manual chamado dissecção quaternário. Convencional tétrade 2,3 dissecção que mudou relativamente pouco desde a publicação original em 1937 4, tem três objetivos. Em primeiro lugar, as células que tenham sido submetidos a meiose (tétradas) deve ser isolada a partir de uma distância de fundo das células vegetativas. Na análise convencional, isto é conseguido por um investigador que, usandoum microscópio, identifica visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e emprega um aparelho micromanipulador identificar visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e usando um micromanipulador para mover o tetra para uma área livre de células da placa. Em seguida, os quatro esporos no quaternário deve ser fisicamente separados para evitar interspore acasalamento. Os esporos dentro de uma tétrade são mantidos juntos por tanto um asco, o remanescente da parede celular da célula diplóide original e um conjunto de pontes interspore 5. Na análise tétrade convencional o asco é removida por digestão enzimática, e pesquisador usa o micromanipulador para quebrar as pontes interspore e separar os esporos. Finalmente, os esporos individuais são dispostos num padrão de grelha que mantém a relação entre os esporos, isto é, toda a progénie de uma linha de quatro esporos são gémeos do mesmo tétrade originais. Uma levedura pesquisador experiente pode concluir o processo de dissecar 10 tétrades (um número mínimo geralmente aceitopor transversal) em cerca de 15 min. Nós desenvolvemos um novo método tétrade genotipagem de alto rendimento, que chamamos de B ARCODE E nabled equencing S de etrads T (BEST) 1. MELHOR expande os métodos atuais em genética de alto rendimento, permitindo a geração e genotipagem de um grande número de descendentes que são isolados, genotipados, e mantidos como indivíduos de uma forma que permite que as relações de esporos irmã de todos os quatro produtos meióticos de ser recuperado. Isto é realizado utilizando-se três estratégias principais (Figura 1). Primeiro, é a introdução de uma construção repórter que rotula as células que sofreram meiose com GFP e permite que sejam isolados por células activadas por fluorescência (FACS). O segundo é a incorporação de um código de barras de DNA altamente complexa (uma seqüência de 15 nucleotídeos aleatórios) de uma forma que é transmitida para todos os quatro esporos de uma tétrade e pode ser lido por sequenciamento de DNA da Progen recombinantey e, portanto, identifica esporos irmãs da mesma quaternário. Em terceiro lugar está o passo a genotipagem, e MELHOR é compatível com várias plataformas de genotipagem que capturam tanto um conjunto de marcadores genômicos, bem como o código de barras específico do tetra. Empregamos uma restrição associada do local de ADN etiqueta de sequenciação (RAD-SEQ) 6 método que dirige a sequenciação do genoma de sítios de restrição específicos 1, capturando assim uma consistente 2-3% do genoma das estirpes da progenitura, bem como o código de barras à base de plasmídeo . A recuperação das relações tétrade, juntamente com os dados de genotipagem empiricamente derivada do cruzamento permite a inferência de informações precisas em falta, incluindo o status de marcadores com baixa cobertura sequência e o genótipo completo de indivíduos inviáveis ​​(e, portanto, não recuperáveis). Aqui, descrevemos a aplicação do método de o microrganismo mais vulgarmente utilizado para o mapeamento da meiose, a levedura S. cerevisiae. No entanto, com as substituições menores de rea-organismo específicogents, por exemplo, proteínas específicas de esporulação diferentes fundidos a GFP, o método deve ser facilmente transferíveis para outros microrganismos, incluindo os organismos em que o mapeamento meiótica é significativamente mais trabalho intensivo ou actualmente intratável. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Melhor método. (A) O plasmídeo pCL2_BC é um plasmídeo de 2 micra, com uma fusão específica esporulação-GFP, a resistência a G418, e um código de barras 15-mer aleatório. Construção da biblioteca de plasmídeo é descrito em Ludlow et ai 1. (B) Um conjunto de plasmídeos de código de barras é transformado na estirpe diplóide de uma cruz. (C) Os transformantes são então crescidas na selecção e ~ 10.000 colónias transformadas são reunidas e esporuladas. Durante a meiose cada esporo de uma tétrade herda uma copy do plasmídeo com código de barras. (D) Tetrads são separados das células por FACS esporulados e recolhidas em placas de ágar, onde eles são digeridos e rompidas para permitir que cada esporo para formar uma colónia. (E) As colónias são então repicadas para placas de 96 poços, fenotipados, e genotipados. Durante a genotipagem do código de barras é lido plasmídeo e utilizados para identificar os quatro membros de cada tétrada. Este valor foi modificado de Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (unidade de pedido especial)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Outros classificadores de células devem funcionar para este procedimento. Os principais fatores são: (1) um sistema de laser/detecção para o repórter fluorescente que está sendo usado (laser de 488 nm para excitar EGFP em nosso caso), (2) a capacidade de classificar eventos únicos, (3) a capacidade de classificar em lâminas de microscópio para avaliar a qualidade da classificação e (4) a capacidade de classificar em placas de Petri</td></tr><tr><td>Unidade de Deposição Celular Automatizada (para FACSAria II)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155 (se adquirido separadamente do instrumento FACSAria)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Biobusiness</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html Científica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

melhor: barcode ativado seqüenciamento de tetrads

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Análise Tetrad é uma ferramenta valiosa para a genética de leveduras, mas a natureza manual do laborioso do processo tem dificultado a sua aplicação em grandes escalas. Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) 1 substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas em virtude de uma proteína de fusão GFP-specific esporulação que permite activado por fluorescência das células de tétradas directamente em placas de agar, em que o asco é enzimaticamente digeridas e os esporos são interrompidos aleatoriamente e dispostas por conta de vidro chapeamento. As colônias haplóides são atribuídos relações esporos irmã, ou seja, informações sobre quais os esporos originados da mesma tétrade, usando códigos de barras moleculares lidos durante genotipagem. Ao remover o gargalo de dissecção manual, centenas ou mesmo milhares de tétradas pode ser isolado em minutos. Aqui apresenta-se uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais necessários para realizar melhor na leveduraSaccharomyces cerevisiae, a começar com uma estirpe diplóide heterozigótico através do isolamento de colónias derivadas da progenitura meiótica haplóide.

MELHOR pode melhorar significativamente a velocidade com que os esporos de tétrades pode ser isolado. Como um exemplo do caudal este método pode proporcionar, um investigador realizou os FACS triagem e separação de esporos (Passos 5.1 a 6.3) com 149 placas de agar em 3 horas 1. Um rendimento equivalente (aproximadamente 3.725 tétrades) exigiria mais de 90 horas de dissecção manual. No entanto, tal como com muitos métodos de alto rendimento, a iteração corrente do método tem alguma perda de eficiência em comparação com a dissecção manual. Este manifesta-se como a perda de um número reduzido de colónias recuperadas comparado com a expectativa calculada com base na viabilidade dos esporos da cruz, determinada por meio de dissecção manual (Passo 1.4). Assumindo que as causas de perda de esporos (Discussão) afectar esporos ao acaso, as estimativas podem ser feitas de quantos colónias recuperadas ser membros de tétradas em que um, dois, três, ou quatro esporos foram recuperados (Figura 4). Figura 4. Simulação da eficácia do método no nível quaternário. Falha de recuperar com sucesso os esporos (como colónias) pode ser devido à inviabilidade de esporos, de esporos de aderência para as pérolas de vidro, a falta de esporos de separar um do outro, etc A distribuição binomial foi usado para calcular a fracção de tétradas esperado (com, pelo menos, um de esporos recuperados com sucesso) produzindo 4, 3, 2 ou 1 colónias com base na proporção de todos os esporos recuperados com sucesso. Este gráfico pode servir como um guia para o número de estirpes que serão finalmente reunidos em 3 - ou 4 - tetrads esporos. Como o número de colônias por placa aumenta, o mesmo acontece com o número de tétrades completos recuperados. Na experiência descrita acima, 25 tétradas de uma cruz com esporos viabilidade perto de 100% (como determined por dissecção manual) 1 foram semeados em 149 placas de agar. Nesta experiência, o número máximo de colónias observadas por placa foi de 80, o que indica que 20 esporos, não formaram colónias discretas. O número médio de colónias por placa foi de 62. Colônias das 61 placas contendo 65 colônias ou mais foram colhidas e seqüenciados. Das 3.700 amostras que passaram seqüenciamento de controle de qualidade, 72% poderiam ser computacionalmente atribuído em 3 - ou 4 - tétrades esporos.

Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares.

MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um grande número de descendentes recombinantes a partir de um cruzamento de levedura de forma que se mantenha a informação sobre quais descendentes foram derivados do mesmo tetrad original. Isso é alcançado primeiramente transformando a linhagem diplóide heterozigótica a ser usada no cruzamento com uma biblioteca de plasmídeos que contém um código de barras específico para tetrad e um repórter fluorescente específico para esporulação. O segundo passo é transferir as células com código de barras para o meio de esporulação.Isso permite que os tetras se formem e induz a expressão do repórter fluorescente GFP em tetras, mas não em células que não conseguem esporular. Em seguida, um classificador de fluxo separa os tetras marcados fluorescentemente das demais células e os deposita diretamente em uma placa de ágar, onde o revestimento externo dos tetras é digerido enzimaticamente. O passo final consiste em usar esferas de vidro para separar e espalhar os esporos dos tetras digeridos pela superfície da placa de ágar, permitindo que cada esporo forme uma colônia individual.Por fim, as linhagens obtidas por este método serão genotipadas usando um protocolo de sequenciamento de DNA multiplexado de alto rendimento que irá ler o código de barras tetraespecífico de cada linhagem. Os códigos de barras são então usados para identificar cada uma das quatro linhagens resultantes de um único evento meiótico. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a dissecação manual de ascos secos utilizando um micromanipulador, é que um único pesquisador pode isolar várias milhares de progênies recombinantes em apenas algumas horas.As células diploides de levedura utilizadas neste estudo foram previamente transformadas com uma biblioteca de plasmídeos com códigos de barras conforme descrito no manuscrito complementar e armazenadas a menos 80 graus Celsius para reviver as células a partir dos talos congelados. Incube-as durante a noite em cinco mililitros de YPD acrescidos de 200 microgramas por mililitro de G418 a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte. Lave as células dos cultivos noturnos três vezes em PBS e, em seguida, re-suspenda-as em um volume final de dois mililitros em meio de esporulação, acrescido de 200 microgramas por mililitro.G 4 18 Agite as culturas de esporulação à temperatura ambiente. Monitore diariamente o progresso da esporulação até que a formação de novos tétrades tenha cessado. Normalmente, isso leva entre dois a quatro dias após as culturas conterem tétrades bem formados e relativamente poucos diádios.Retire os cultivos da agitação e deixe-os à temperatura ambiente por pelo menos sete dias antes da separação de tétrades. O aspecto mais difícil deste procedimento é obter uma boa separação dos esporos. Descobrimos empiricamente que deixar os cultivos em esporulação repousando à temperatura ambiente, sem agitação, por pelo menos uma semana antes da separação de tétrades, melhora significativamente a separação dos esporos.As tétrades provenientes do cultivo de esporulação podem ser detectadas e isoladas por meio de triagem de células ativada por fluorescência ou fax, porque os plasmídeos com códigos de barras nas células diploides também carregam uma proteína de fusão GFP específica para esporulação. O protocolo descrito aqui foi desenvolvido para um fax ária dois. Para iniciar este procedimento, carregue o cultivo esporulado no classificador de fax e configure dois parâmetros de dispersão anterior e dispersão lateral para excluir detritos, células agregadas e múltiplas células por gotícula.Deve haver uma população de células fluorescentes, que, ao utilizar o construto repórter GFP do PS dois, inclui eventos de diades e tétrades, com o GFP versus FSC para incluir esses eventos fluorescentes. Dependendo do background da linhagem, pode ser necessário incluir uma porta adicional para remover agregados que contenham tétrades e outras células. Inspecione um histograma de FSC dos eventos fluorescentes.Neste exemplo, os eventos no pico esquerdo são principalmente tétrades, e os eventos no pico direito são geralmente tétrades com um broto ligado; aplique uma porta final que inclua eventos com menor FSC, que são majoritariamente tétrades, indicados pelas barras vermelhas. Verifique a eficiência do regime de seleção ordenando aproximadamente 1.500 tétrades em uma lâmina de microscópio e contando a proporção de tétrades em relação a não tétrades. Utilizando um microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes, a porcentagem de tétrades pode ser estimada com precisão contando apenas cerca de 200 eventos ordenados, mas ordenar aproximadamente 1.500 reduz o tempo gasto procurando células na lâmina de microscópio.Essas imagens de campo claro apresentam ampliação de 600 vezes. Mostre exemplos de tétrades à esquerda e não tétrades à direita após a separação por FACS. Verifique periodicamente se o separador está relatando com precisão o número de eventos separando 25 tétrades em uma lâmina de microscópio e examinando as células contidas na gota usando microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes.Deve haver 25 tétrades na gota. Repita três ou quatro vezes para avaliar a variância do instrumento de fax nessa execução. Prepare as placas de ágar para este procedimento aquecendo o número desejado de placas YPD mais G quatro 18 por pelo menos 1,5 hora em uma incubadora a 37 graus Celsius posicionada próximo ao classificador de fax.Uma característica fundamental do protocolo de classificação é a capacidade de direcionar com precisão os tetras classificados por fax a um local específico em uma placa de ágar que contém um meio da solução X. Para isso, coloque primeiro uma placa de referência de 96 poços na unidade automatizada de deposição celular do classificador. Em seguida, prepare um esquema de classificação que distribua 25 tetras em um único poço de uma placa de 96.O ordenamento em formato de placa com 25 tetras por placa produz colônias bem separadas. Escolha um poço próximo ao centro da placa. Por exemplo, poço D cinco.Traga uma pilha de 10 placas de ágar do incubador a 37 graus Celsius para o classificador. Pegue uma placa de ágar e pipete 25 microlitros de solução zy sobre o ágar próximo ao centro da placa. Em seguida, coloque a placa sobre a placa de referência de 96 poços, alinhando a gota X sobre o alvo.Bem, isso foi escolhido anteriormente. Bem D cinco. Inicie a seleção e deposite 25 tetras no centro da gota de zy na placa de ágar.Remova e cubra a placa. Repita a separação para cada placa até que 25 tétrades tenham sido separadas em gotas de zamo em cada placa da pilha. Devolva a pilha de placas contendo tétrades ao incubador de 37 graus Celsius.Leve a próxima pilha de 10 placas para o classificador e repita o procedimento de separação. Os esporos podem ser separados após as placas de ágar contendo tétrades terem sido incubadas a 37 graus Celsius por 1,5 hora. Para iniciar este procedimento, adicione 15 a 25 esferas de vidro estéreis de três milímetros a cada placa e agite as placas em duas pilhas de cinco placas por três a cinco minutos.A melhor separação de esporos é obtida movendo rigidamente as placas de um lado para o outro ou de frente para trás. Não mova as placas de forma que as esferas girem em torno da borda externa da placa. Deixe as esferas nas placas ao finalizar. Coloque a pilha de placas com as contas voltadas para cima em uma estufa a 30 graus Celsius. Retire a próxima pilha de placas da estufa a 37 graus Celsius e repita o procedimento de separação de esporos utilizando as contas. Incube todas as placas durante a noite a 30 graus Celsius no dia seguinte à separação dos esporos.Remova cuidadosamente as placas do incubador a 30 graus Celsius sem perturbar as esferas de vidro. Pequenas colônias devem ter se formado nas placas. Remova as esferas de vidro invertendo cuidadosa e rapidamente as placas sobre um recipiente profundo.Bater na parte inferior da placa enquanto ela está invertida pode ajudar a soltar as esferas aderidas à placa. Os recipientes devem ser suficientemente profundos para capturar as esferas sem permitir que saltem para cima e atinjam a placa de ágar. Conte o número de colônias em cada placa e utilize esse valor para estimar a eficiência da separação e recuperação de esporos.Por exemplo, 25 tétrades por placa para um cruzamento com viabilidade próxima a 100% podem gerar um total de 100 colônias por placa a partir de placas com número suficiente de colônias, como mais de 65 para alta viabilidade. Transfira células de cada colônia para um poço separado de uma placa de 96 poços contendo meio líquido YPD mais G four 18. Anote também quais poços contêm colônias provenientes da mesma placa de ágar.Essas informações serão usadas posteriormente para auxiliar na atribuição da tétrade. O uso de software pode melhorar significativamente a velocidade com que os esporos das tétrades podem ser isolados. Embora a versão atual do método apresente alguma perda de eficiência em comparação com a dissecação manual, a distribuição binomial foi utilizada para calcular a fração esperada de tétrades com pelo menos um esporo recuperado com sucesso produzindo 1, 2, 3 ou quatro colônias, com base na proporção de todos os esporos recuperados com sucesso.Este gráfico pode servir como uma orientação aproximada para o número de cepas que acabarão sendo montadas em três ou quatro tetras de esporos, conforme observado aqui. O número de tetras completos recuperados aumenta à medida que o número de colônias por placa aumenta neste estudo. 25 rads provenientes de cruzamentos com viabilidade de esporos próxima a 100%, conforme determinado por dissecação manual, foram semeados em 149 placas de ágar.O número máximo de colônias observado por placa foi de 80, indicando que 20 esporos não formaram colônias discretas. O número médio de colônias por placa foi de 62,4; 354 colônias de 61 placas contendo 65 colônias ou mais foram colhidas e sequenciadas. Das 3.700 cepas que passaram pelo controle de qualidade do sequenciamento, 2.665, ou 72%, puderam ser atribuídas computacionalmente a três ou quatro tétrades de esporos. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser usada para processar mais de mil tétrades por hora. No entanto, para períodos superiores a três horas, será necessária assistência.

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