MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads

O objetivo geral deste procedimento é gerar um grande número de descendentes recombinantes a partir de um cruzamento de levedura de forma que se mantenha a informação sobre quais descendentes foram derivados do mesmo tetrad original. Isso é alcançado primeiramente transformando a linhagem diplóide heterozigótica a ser usada no cruzamento com uma biblioteca de plasmídeos que contém um código de barras específico para tetrad e um repórter fluorescente específico para esporulação. O segundo passo é transferir as células com código de barras para o meio de esporulação.

Isso permite que os tetras se formem e induz a expressão do repórter fluorescente GFP em tetras, mas não em células que não conseguem esporular. Em seguida, um classificador de fluxo separa os tetras marcados fluorescentemente das demais células e os deposita diretamente em uma placa de ágar, onde o revestimento externo dos tetras é digerido enzimaticamente. O passo final consiste em usar esferas de vidro para separar e espalhar os esporos dos tetras digeridos pela superfície da placa de ágar, permitindo que cada esporo forme uma colônia individual.

Por fim, as linhagens obtidas por este método serão genotipadas usando um protocolo de sequenciamento de DNA multiplexado de alto rendimento que irá ler o código de barras tetraespecífico de cada linhagem. Os códigos de barras são então usados para identificar cada uma das quatro linhagens resultantes de um único evento meiótico. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a dissecação manual de ascos secos utilizando um micromanipulador, é que um único pesquisador pode isolar várias milhares de progênies recombinantes em apenas algumas horas.

As células diploides de levedura utilizadas neste estudo foram previamente transformadas com uma biblioteca de plasmídeos com códigos de barras conforme descrito no manuscrito complementar e armazenadas a menos 80 graus Celsius para reviver as células a partir dos talos congelados. Incube-as durante a noite em cinco mililitros de YPD acrescidos de 200 microgramas por mililitro de G418 a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte. Lave as células dos cultivos noturnos três vezes em PBS e, em seguida, re-suspenda-as em um volume final de dois mililitros em meio de esporulação, acrescido de 200 microgramas por mililitro.

G 4 18 Agite as culturas de esporulação à temperatura ambiente. Monitore diariamente o progresso da esporulação até que a formação de novos tétrades tenha cessado. Normalmente, isso leva entre dois a quatro dias após as culturas conterem tétrades bem formados e relativamente poucos diádios.

Retire os cultivos da agitação e deixe-os à temperatura ambiente por pelo menos sete dias antes da separação de tétrades. O aspecto mais difícil deste procedimento é obter uma boa separação dos esporos. Descobrimos empiricamente que deixar os cultivos em esporulação repousando à temperatura ambiente, sem agitação, por pelo menos uma semana antes da separação de tétrades, melhora significativamente a separação dos esporos.

As tétrades provenientes do cultivo de esporulação podem ser detectadas e isoladas por meio de triagem de células ativada por fluorescência ou fax, porque os plasmídeos com códigos de barras nas células diploides também carregam uma proteína de fusão GFP específica para esporulação. O protocolo descrito aqui foi desenvolvido para um fax ária dois. Para iniciar este procedimento, carregue o cultivo esporulado no classificador de fax e configure dois parâmetros de dispersão anterior e dispersão lateral para excluir detritos, células agregadas e múltiplas células por gotícula.

Deve haver uma população de células fluorescentes, que, ao utilizar o construto repórter GFP do PS dois, inclui eventos de diades e tétrades, com o GFP versus FSC para incluir esses eventos fluorescentes. Dependendo do background da linhagem, pode ser necessário incluir uma porta adicional para remover agregados que contenham tétrades e outras células. Inspecione um histograma de FSC dos eventos fluorescentes.

Neste exemplo, os eventos no pico esquerdo são principalmente tétrades, e os eventos no pico direito são geralmente tétrades com um broto ligado; aplique uma porta final que inclua eventos com menor FSC, que são majoritariamente tétrades, indicados pelas barras vermelhas. Verifique a eficiência do regime de seleção ordenando aproximadamente 1.500 tétrades em uma lâmina de microscópio e contando a proporção de tétrades em relação a não tétrades. Utilizando um microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes, a porcentagem de tétrades pode ser estimada com precisão contando apenas cerca de 200 eventos ordenados, mas ordenar aproximadamente 1.500 reduz o tempo gasto procurando células na lâmina de microscópio.

Essas imagens de campo claro apresentam ampliação de 600 vezes. Mostre exemplos de tétrades à esquerda e não tétrades à direita após a separação por FACS. Verifique periodicamente se o separador está relatando com precisão o número de eventos separando 25 tétrades em uma lâmina de microscópio e examinando as células contidas na gota usando microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes.

Deve haver 25 tétrades na gota. Repita três ou quatro vezes para avaliar a variância do instrumento de fax nessa execução. Prepare as placas de ágar para este procedimento aquecendo o número desejado de placas YPD mais G quatro 18 por pelo menos 1,5 hora em uma incubadora a 37 graus Celsius posicionada próximo ao classificador de fax.

Uma característica fundamental do protocolo de classificação é a capacidade de direcionar com precisão os tetras classificados por fax a um local específico em uma placa de ágar que contém um meio da solução X. Para isso, coloque primeiro uma placa de referência de 96 poços na unidade automatizada de deposição celular do classificador. Em seguida, prepare um esquema de classificação que distribua 25 tetras em um único poço de uma placa de 96.

O ordenamento em formato de placa com 25 tetras por placa produz colônias bem separadas. Escolha um poço próximo ao centro da placa. Por exemplo, poço D cinco.

Traga uma pilha de 10 placas de ágar do incubador a 37 graus Celsius para o classificador. Pegue uma placa de ágar e pipete 25 microlitros de solução zy sobre o ágar próximo ao centro da placa. Em seguida, coloque a placa sobre a placa de referência de 96 poços, alinhando a gota X sobre o alvo.

Bem, isso foi escolhido anteriormente. Bem D cinco. Inicie a seleção e deposite 25 tetras no centro da gota de zy na placa de ágar.

Remova e cubra a placa. Repita a separação para cada placa até que 25 tétrades tenham sido separadas em gotas de zamo em cada placa da pilha. Devolva a pilha de placas contendo tétrades ao incubador de 37 graus Celsius.

Leve a próxima pilha de 10 placas para o classificador e repita o procedimento de separação. Os esporos podem ser separados após as placas de ágar contendo tétrades terem sido incubadas a 37 graus Celsius por 1,5 hora. Para iniciar este procedimento, adicione 15 a 25 esferas de vidro estéreis de três milímetros a cada placa e agite as placas em duas pilhas de cinco placas por três a cinco minutos.

A melhor separação de esporos é obtida movendo rigidamente as placas de um lado para o outro ou de frente para trás. Não mova as placas de forma que as esferas girem em torno da borda externa da placa. Deixe as esferas nas placas ao finalizar.

Coloque a pilha de placas com as contas voltadas para cima em uma estufa a 30 graus Celsius. Retire a próxima pilha de placas da estufa a 37 graus Celsius e repita o procedimento de separação de esporos utilizando as contas. Incube todas as placas durante a noite a 30 graus Celsius no dia seguinte à separação dos esporos.

Remova cuidadosamente as placas do incubador a 30 graus Celsius sem perturbar as esferas de vidro. Pequenas colônias devem ter se formado nas placas. Remova as esferas de vidro invertendo cuidadosa e rapidamente as placas sobre um recipiente profundo.

Bater na parte inferior da placa enquanto ela está invertida pode ajudar a soltar as esferas aderidas à placa. Os recipientes devem ser suficientemente profundos para capturar as esferas sem permitir que saltem para cima e atinjam a placa de ágar. Conte o número de colônias em cada placa e utilize esse valor para estimar a eficiência da separação e recuperação de esporos.

Por exemplo, 25 tétrades por placa para um cruzamento com viabilidade próxima a 100% podem gerar um total de 100 colônias por placa a partir de placas com número suficiente de colônias, como mais de 65 para alta viabilidade. Transfira células de cada colônia para um poço separado de uma placa de 96 poços contendo meio líquido YPD mais G four 18. Anote também quais poços contêm colônias provenientes da mesma placa de ágar.

Essas informações serão usadas posteriormente para auxiliar na atribuição da tétrade. O uso de software pode melhorar significativamente a velocidade com que os esporos das tétrades podem ser isolados. Embora a versão atual do método apresente alguma perda de eficiência em comparação com a dissecação manual, a distribuição binomial foi utilizada para calcular a fração esperada de tétrades com pelo menos um esporo recuperado com sucesso produzindo 1, 2, 3 ou quatro colônias, com base na proporção de todos os esporos recuperados com sucesso.

Este gráfico pode servir como uma orientação aproximada para o número de cepas que acabarão sendo montadas em três ou quatro tetras de esporos, conforme observado aqui. O número de tetras completos recuperados aumenta à medida que o número de colônias por placa aumenta neste estudo. 25 rads provenientes de cruzamentos com viabilidade de esporos próxima a 100%, conforme determinado por dissecação manual, foram semeados em 149 placas de ágar.

O número máximo de colônias observado por placa foi de 80, indicando que 20 esporos não formaram colônias discretas. O número médio de colônias por placa foi de 62,4; 354 colônias de 61 placas contendo 65 colônias ou mais foram colhidas e sequenciadas. Das 3.700 cepas que passaram pelo controle de qualidade do sequenciamento, 2.665, ou 72%, puderam ser atribuídas computacionalmente a três ou quatro tétrades de esporos. Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser usada para processar mais de mil tétrades por hora. No entanto, para períodos superiores a três horas, será necessária assistência.