Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus
23 de abril de 2014
Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.
O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos com o vírus Sendai. Isso é feito primeiro preparando e plaqueando as células de fibroblastos a serem transduzidas. O próximo passo do procedimento é infectar as células com o vírus Sendai.
Em seguida, as células de fibroblastos infectadas são transferidas para células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongos frescos. A etapa final é escolher manualmente o reprogramado. Agora, as células-tronco pluripotentes, em última análise, a reprogramação de células de fibroblastos em I PSCs, sem o uso de genes trans, pode ser mostrada por meio de imunomarcação e RTPCR.
A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que ela aumenta a eficiência da reprogramação sem permanecer transing e de maneira econômica Para este protocolo, tenha fibroblastos humanos prontos cultivados em DMEM. Com o FBS, transfira essas células para placas de 24 poços para o experimento, coloque as células em seis diluições seriais para determinar a melhor densidade para a fixação celular. Cada fileira da placa de 24 poços pode acomodar uma série de células de diluição.
Assim, quatro tipos de células podem ser testados em uma placa, incubar a diluição por 24 horas. No dia seguinte, selecione poços em três níveis de confluência para transdução. Um em um nível alto de 80 a 90% de confluência, um em cerca de 60% de confluência e o terceiro em cerca de 30% de confluência uma hora ou mais antes da transdução.
Substitua o meio por 300 microlitros de meio de fibroblastos fresco para o descongelamento da transdução. Um conjunto de tubos de vírus Sendai a 37 graus Celsius por alguns segundos e depois termina. Descongelando-os em temperatura ambiente.
Centrifugue os vírus descongelados a 6.000 G por 10 segundos e armazene-os no gelo em um tubo de microcentrífuga. Faça uma mistura dos vírus calculada de acordo com o número de células a serem transduzidas. Os detalhes do cálculo podem ser encontrados no protocolo de texto.
Misture bem os vírus com pipetagem suave. Agora, às células mais densas, adicione dois volumes de vírus. Adicione um volume de vírus às células de densidade média e adicione meio volume de vírus à seleção menos densa.
Gire a placa e deixe-a incubar durante a noite para que a reação ocorra no dia seguinte. Substitua o meio por 500 microlitros de meio de fibroblastos fresco. Faça isso novamente dois dias depois, três dias após a segunda alteração de mídia feita nas células transduzidas.
Prepare células de metanfetamina em placas de 60 milímetros com DMEM contendo 10% de placa FBS 500.000 células por placa e incube-as durante a noite. No dia seguinte, substitua a mídia nas células de metanfetamina por mídia nova e, em seguida, prossiga com a configuração da co-cultura. Primeiro, remova a mídia dos fibroblastos transduzidos e lave-os uma vez com a PPBD.
Em seguida, adicione 200 microlitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada poço transduzido de células em cinco minutos. Agrupe todas as células de desprendimento em um único tubo cônico de 15 mililitros. Gire as células a 1.350 G por quatro minutos.
Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células peletizadas com cerca de cinco mililitros de meio fresco para neutralizar o trippino. Agora colete as células com outro giro de quatro minutos a 1.350 G.Próxima placa. A maioria das células tem seis diluições seriais em metanfetamina.
A primeira e a última diluições podem não ser necessárias, dependendo da taxa de mortalidade das células. Guarde algumas das células para uma extração de RNA e incube as placas durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio por meio ES humano suplementado com 10 micromolares de inibidor de RO quinase Y 2 7 6 3 2.
Para melhorar a sobrevivência celular durante os dias seguintes, mude o meio para um meio ES humano normal não suplementado. Após uma semana de cultivo, comece a verificar os pratos a cada poucos dias para a formação de aglomerados de células semelhantes a colônias ES. Assim que aparecerem, monitore o crescimento.
Três semanas após a transdução, as colônias de aglomerados de células ES devem estar prontas para expansão. Preparei células alimentadoras de metanfetamina em placas de 24 poços, assim como foram preparadas para placas de 60 milímetros. Antes de escolher qualquer colônia, troque o meio nas células de metanfetamina por meio ES com 10 microlitros de Y 2 7, 6, 3, 2.
Escolha uma colônia de cada vez nos pratos. Transfira a colônia para um tubo de 15 mililitros com a solução. Quebre a colônia usando o pipetador.
Em seguida, cubra um eu. Bem, com a colônia quebrada. Por fim, carregue cada poço com uma colônia quebrada e carregue o máximo de poços possível.
Mantenha as células com mudanças diárias de mídia e expanda-as para placas de seis poços e, em seguida, placas de 60 milímetros. Normalmente, os fibroblastos infectados pelo vírus Sendai não apresentam alterações morfológicas até depois de cinco dias. Em seguida, as células assumem uma forma redonda com um núcleo maior e um citoplasma menor.
Este protocolo de pequena escala inclui vários parâmetros que podem ser otimizados, como densidade de fibroblastos, título de vírus e densidade de plaqueamento para o mes. A transdução de células em diferentes cofluências mostradas em cores diferentes também pode ser otimizada. Após uma semana de co-cultura com células alimentadoras de metanfetamina, os fibroblastos parcialmente reprogramados têm uma forma solta e são facilmente colhidos em vez de serem coletados usando tripsina.
Totalmente reprogramadas, as I PSCs são claramente identificáveis a partir de células parcialmente reprogramadas. As células totalmente reprogramadas são compactadas e as colônias podem ter limites claros. Células parcialmente reprogramadas formam aglomerados soltos que são facilmente desconectados.
Depois de expandir os clones IPSC por várias semanas, a coloração para marcadores de células-tronco é necessária em comparação com as células H nove. Os IPCs são positivos para vários anticorpos esperados, incluindo SSEA quatro, OCT quatro, TRA 81 e nano G, apoiando sua qualidade pluripotente. O uso da expressão do transgene R-T-P-C-R não foi observado em clones de IPSC humanos.
Após 10 primers para OCT exógena quatro, SOX dois, klf quatro e Cmic foram usados com amostras de controle positivo que apresentaram fortes níveis de expressão transgênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar células somáticas para induzir as células-tronco polipotentes e como selecioná-las, reprogramar completamente as células das outras células.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) sem transgene, usando o vírus Sendai. O procedimento demonstra resultados consistentes e eficiência aprimorada na geração de iPSCs.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Reprogramação Celular
- Virologia
Fundamentos
- As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são valiosas para a medicina regenerativa.
- Os métodos tradicionais frequentemente envolvem o uso de transgenes, o que pode representar preocupações de segurança.
- O vírus Sendai é um vetor não-integrativo que permite uma reprogramação mais segura.
- Este método visa melhorar a eficiência da geração de iPSCs a partir de células somáticas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para gerar iPSCs sem transgenes.
- Aprimorar a eficiência do processo de reprogramação.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente replicado em ambientes de pesquisa.
Métodos Utilizados
- Preparação e semeadura de células de fibroblasto.
- Transdução de células de fibroblasto com vírus Sendai.
- Transferência de células infectadas para células alimentadores de fibroblastos embrionários de camundongo.
- Seleção manual de células reprogramadas confirmada por marcação imunológica e RT-PCR.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de iPSCs sem transgene a partir de células de fibroblasto.
- Demonstração de resultados consistentes de reprogramação em múltiplos ensaios.
- Eficiência aprimorada em comparação com métodos tradicionais.
- Verificação da pluripotência através de ensaios estabelecidos.
Conclusões
- O método do vírus Sendai é uma abordagem segura e eficaz para a geração de iPSCs.
- Esta técnica pode facilitar pesquisas adicionais em medicina regenerativa.
- Estudos futuros podem explorar a aplicação destas iPSCs em vários contextos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
