Name: Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de transgenes a partir de fibroblastos humanos usando vírus Sendai. Este método reprograma células somáticas com eficiência aprimorada para pesquisa em medicina regenerativa.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lee pelas valiosas discussões sobre o manuscrito. Trabalho no laboratório Lee foi apoiada por doações de Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation e de Maryland Stem Cell Research Fund (Tedco).

1. Preparação de celular e Mídia (Dia 1) <ol><li> Cultura e expandir de fibroblastos humanos com meio DMEM contendo 10% de FBS. </li><li> Placa de fibroblastos humanos (Figura 1) para uma placa de 24 poços a uma densidade apropriada por poço no dia antes da transdução. NOTA: As seguintes diluições em série são recomendados (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K) porque diferentes tipos de células têm diferentes capacidade de fixação. </li><li> Incubar as células durante mais um dia em 37 ° C, 5% de CO2, garantindo as células foram totalmente colada e estendida. </li></ol> 2. Execute Transdução (dia 2) <ol><li> No dia da transdução, verificar a densidade celular e escolheu os poços de densidade mais eficientes (Figura 2). É melhor escolher três densidades diferentes: alta (80 ~ 90%), médio (50 ~ 70%) e baixa (20 ~ 40%). </li><li> Pelo menos 1 hora antes de transdução, aspirar o fibroblmeios de ast a partir das células e alterar novas 300 ul de meio de fibroblastos. </li><li> Remover um conjunto de quatro diferentes tubos de vírus Sendai da -80 ° C de armazenamento. Descongelar a cada tubo ao mesmo tempo em um banho de água a 37 C ° por alguns segundos e, em seguida, tomar os tubos fora do banho de água. Depois disso, o descongelamento à temperatura ambiente; tubos de centrifugação a 6.000 xg por 10 segundos e coloque-os em gelo até o uso. Não voltar a congelar e descongelar o vírus uma vez que os títulos não vai manter. </li><li> Adicionar os volumes indicados de cada um dos quatro tubos de vírus Sendai (Oct-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) para tubos de micro-centrífuga. Certifique-se de que a solução é bem misturada, pipetando cuidadosamente. Por exemplo, se 50K células / poço de uma placa de 24 poços para a transdução lookwell: (Titer base no Certificado de Análise da Life Technologies, pode ser diferente de um lote para outro) Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 7 OIC, 3 MOI = 5 mL Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 7 OIC, 3 MOI = 4,6 μ; L Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 7 OIC, 3 MOI = 4,8 mL Tubo hc-Myc = 7,8 x 10 7 OIC, 3 MOI = 3,8 mL Total = 18.2 ul de mistura de quatro factores de vírus / um poço (50K células) de placa de 24 poços </li><li> Dependendo densidades celulares; adicionar 2X, 1X, e volume de 0,5 X de a mistura de vírus no poço. Agitar suavemente a placa da frente para trás, esquerda e direita (2X: 36,4 mL de mistura de vírus, 1X: 18,2 ul e 0,5 X: 9,1 mL). </li><li> Colocar as células em 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora e incubar durante a noite. </li></ol> 3. Substituição de Meio de Cultura (dia 3 e dia 5) <ol><li> 24 horas após a transdução, substituir o meio com 500 mL meio de fibroblastos fresco. </li><li> No dia 5, mudar Médio com a mídia de fibroblastos fresco. </li></ol> 4. Prepare MEF Pratos para o Co-cultura (dia 8) <ol><li> Preparar células MEF em placas de cultura de 60 milímetros, com 10% de FBS continha um meio DMEM day antes passaging o fibroblasto transdução em células-alimentadoras MEF. Nota: Estamos usando 5 x 10 5 de MEF em cada 60 milímetros prato. </li></ol> 5. Comecem a co-cultura com células transduzidas células alimentadoras MEF (dia 9) <ol><li> Antes de cultivo de células transduzidas, aspirado 10% FBS contida meios DMEM de pratos alimentadoras MEF e adicione fresco 10% FBS continha meio DMEM. </li><li> Remover o meio a partir dos fibroblastos transduzidos que estão na placa de 24 poços e lavam as células uma vez com STP-D. Adicionar 200 mL de 0,25% tripsina / EDTA para as células de fibroblasto inthe placa de 24 poços. Depois de menos de 5 minutos de incubação com tripsina / EDTA, quando as células começam a separar a partir da placa, recolher as células com meio de crescimento no tubo de 15 ml. Em seguida, centrifugar-los em 6000 xg por 4 min. NOTA: O agrupamento 2X, 1X, 0.5X e vírus fibroblastos transduzidas é recomendado. </li><li> Remova o meio sobrenadante e lavar a re-suspensãoo aglomerado de células com 4-5 ml de meio fresco para a neutralização de fibroblastos a partir de tripsina. Em seguida, centrifugar-los em 135 g durante 4 min. </li><li> Células da placa como série de diluição de densidade e começam a co-cultura com os meios de fibroblastos para MEF: tal como 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 por 60 mm prato. Dependendo da taxa de morte celular durante a primeira semana de transdução, não ser necessário diluir a 1/2 ou 1/128 densidade. Pôr de lado as restantes células para extrair o RNA total como um controlo positivo para o transgene de RT-PCR. </li><li> Colocar placas de 60 mm em 37 ° C, 5% de CO2 durante a noite. </li></ol> 6. Alimente embrionárias humanas Médio Stem Cell e monitorar o Cells (dia 10) <ol><li> No dia seguinte, mudar de mídia para mídia ES fibroblastos humanos com 10 mM Y-27632. Depois disso, alterar médio diário com meio ES humano: 800 ml + 200 ml de DMEM/F12 KO substituição Serum + 10 ml de L-glutamina + 10 ml de MEM 10 mM de ácidos aminados mínimos não essenciais+ 1 ml de 2-mercaptoetanol + 10 ng / mL de Factor de Crescimento de Fibroblastos básico. </li><li> Fazer uma mudança de mídia diária com a mídia ES humanos frescos. Depois de uma semana, verifique os pratos uma vez por 2 a 3 dias sob um microscópio para a formação de aglomerados de células ES de colônia-like. Dependendo do tipo de célula, a cultura irá demorar mais ou menos tempo, antes colónias são encontrados. </li></ol> 7. Escolher o-tronco pluripotentes induzidas colônias de células e expandir as células (dia 20 ~) <ol><li> Três semanas após a transdução, as colônias devem aparecer crescido adequadamente para a colheita. </li><li> Um dia antes de escolher as colônias, preparar alimentador MEF em placa de 24 poços. NOTA: Nós estamos usando 12,5 x 10 5 de MEF em uma placa de 24 poços. </li><li> No dia seguinte, mudar médio de pratos MEF de mídia para mídia ES fibroblastos humanos com 10 mM Y-27632. Escolher manualmente uma colônia de cada vez sob o microscópio no picking-capa e fazer pedaços menores por pipetagem e transferi-lospara recém-preparado MEF dishes.Try escolher vários clones. </li><li> Passagem e expandir-se a cada poço de uma placa de 24 poços para uma placa de 6 bem inicialmente. Então, a partir de 6 bem-placa a um 60 milímetros pratos antes ainda de propagação. </li></ol> 8. Caracterização de iPSCs Humana (após 10 passagens) <ol><li> Imunofluorescência <ol><li> Placa iPSCs humanos em placa de 24 poços e cultura durante 4-5 dias com mudança de mídia diária. </li><li> Para iniciar ensaio de imunofluorescência, lavar a placa com D-PBS uma vez. Em seguida, fixar as células imediatamente em 0,4% de paraformaldeído durante 30 min. Depois disso lavar três vezes em D-PBS durante 5 min. </li><li> Tratar as células fixas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a solução permeablization (0,1% de triton X-100 a solução), em seguida, adicionar uma solução de bloqueio de BSA a 0,5% durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Executar uma detecção de Nanog, Oct-4, SSEA (específico do estágio embrionário antigbr) e TRA-1-81 (antigénio de rejeição de tumor) através de um anticorpo anti-humano em solução de BSA a 0,5% (veja a tabela de materiais para a taxa de diluição do anticorpo). Incubar Anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lavar três vezes em D-PBS durante 5 min cada. </li><li> Verifique usando microscopia de fluorescência após 1 hora de incubação com 488 anticorpos IgG de cabra anti-rato Alexa Fluor como 2 nd anticorpo, que são diluídos 1:2000 em solução de BSA a 0,5% à temperatura ambiente. Mancha todos os núcleos de cada células alimentadoras MEF e hiPSCs com DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR de Confirmação Transgene <ol><li> Extrair ARNm total de sedimento celular utilizando reagentes de extracção do ARN. </li><li> Fazer uma transcrição reversa em alíquotas (1 jig) do ARN total e o cDNA resultante para a amplificação por PCR de transcriptase reversa. </li><li> Preparar as misturas de PCR para conter 2 ul de molde de ADNc, 10 ul de 2X PCR master mix, 2 ul de 2 pmol de iniciadores(Para frente: 1 ml e inverter: 1 ml) e 6 mL de DW. Para detectar a expressão do gene, fazer a RT-PCR com os iniciadores listados na Tabela 1. </li><li> Realizar a RT-PCR com o gene GAPDH como um controlo para a eficiência das reacções de amplificação. Visualizar e analisar o produto de PCR por electroforese em gel de agarose 1%. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Reprogramação de células somáticas humanas para hiPSCs detém promessas sem precedentes na biologia básica, medicina pessoal, e transplante 12. Anteriormente, as gerações iPSC humanos necessários vírus de DNA que tem risco de integração no genoma do hospedeiro, que pode criar mutações genéticas indesejáveis ​​que limitam outras aplicações clínicas, tais como desenvolvimento de medicamentos e terapias de transplante 13. Com esta razão, muitos estudos foram relatados para gerar sistema iPSCs humanos l...

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm a capacidade de se auto-renovar pluripotência in vitro e têm, o que poderia ser potencialmente útil para a modelagem de doenças, para a triagem de drogas e para desenvolver terapias baseadas em células para tratar lesões e doenças do tecido. No entanto, hESCs tem uma limitação para a terapia de reposição celular por causa de barreiras imunológicas, oncológicas e éticos, e estudar genes de doenças relacionadas, hESCs específicos da doença poderia ser isolado por meio de diagnóstico genético pré-implantação (PGD) se aproxima, mas ainda é tecnicamente desafiador e as doações de embriões são muito raros. Estes problemas estão relacionados com o progresso na biologia das células estaminais, o que levou ao desenvolvimento de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs). IPSCs humanos são geneticamente reprogramadas a partir de células somáticas adultas humanas e abrigam células-tronco pluripotentes como características semelhantes a hESCs, o que os torna uma fonte útil para a medicina regenerativa, como ddescoberta tapete, modelagem de doença e terapia celular em pacientes específicos 1,2 maneira. Até agora, existem vários métodos para gerar iPSCs humanos, incluindo mediada por vírus (retrovírus e adenovírus) 3, non-vírus mediada (sistema BAC e vetores de transfecção) 4 transduções genes e proteínas do sistema de entrega 5-7. Embora a entrega de genes mediada por vírus pode garantir um certo nível de eficiência, vectores virais pode deixar pegada genética, porque eles se integram nos cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação de uma maneira descontrolada. Mesmo quando a integração viral de fatores de transcrição podem ativar ou desativar genes do hospedeiro 8, ele pode causar uma aberração genética inesperado eo risco de desenvolvimento de neoplasias 5,9. Por outro lado, a introdução directa de proteínas ou RNA em células somáticas foram relatados, mas tem algumas desvantagens, tais como, transf repetido trabalho intensivoexão e baixo nível de reprogramação 7,10. Mesmo epissómico e não integrante de adenovírus, de vírus adeno-associados, vectores de plasmídeo e ainda são relativamente menos eficiente 11. Por estas razões, é plausível para escolher métodos de reprogramação não-integração com alta eficácia de geração iPSC e menos anormalidades genéticas. Neste estudo, utilizamos uma reprogramação baseado Sendai-vírus. Este método é conhecido como sendo não integrado no genoma do hospedeiro e produz consistentemente iPSCs humanos sem integração do transgene.

<table><tbody><tr><td>Kit de Reprogramação CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEFs, resistente à neomicina, tratado com mitomicina C&nbsp;</td><td>Haste global</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm ou 12,5 x 105/24 poços</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% Tripsina com EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 médio</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços, fundo plano com tampa</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Estoque: 10 mM)</td></tr><tr><td>fator básico de crescimento de fibroblastos</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Estoque: 100 ug)</td></tr><tr><td>Knock-out substituição de soro</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Meio de Águia Modificado (D-MEM, DMEM) (1X), líquido (glicose alta)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina-200 mM (100X), líquido</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Hausser Hemacitômetros de contraste de fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Solução de gelatina</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Sinalização celular</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anticorpo Oct4 monoclonal de camundongo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R& D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 cabra anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>948492 1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s solução salina tamponada com fosfato), 1X sem cálcio e magnésio</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Kit de Transcrição Reversa</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>capuz de dissecação</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com sendai-vírus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Há alguns anos, a criação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) marcou o início de uma nova era na área da biomedicina. Os usos potenciais de iPSCs humanos incluem modelagem patogênese de doenças genéticas humanas, a terapia celular autóloga após a correção do gene, e triagem de drogas personalizado, fornecendo uma fonte de células relevantes e sintomas específicos para cada paciente. No entanto, existem vários obstáculos a ultrapassar, tais como a eliminação da expressão do transgene factor de reprogramação remanescente após a produção iPSCs humanos. Mais importante ainda, a expressão do transgene residual em iPSCs humanos indiferenciadas poderia dificultar diferenciações adequadas e desencaminhar a interpretação em fenótipos vitro relevante doença. Com isso, iPSCs humanos sem transgene livre de integração e / ou que tenham sido desenvolvidos usando vários métodos, tais como adenovírus, o sistema piggyBac, minicírculo vetor, vetores epissomais, entrega direta e proteína sintetizada mRNA. No entanto, a eficiência de reprogramming usando métodos livre de integração é bastante baixo na maioria dos casos. Aqui, apresentamos um método para isolar iPSCs humanos usando Sendai-vírus (vírus RNA) sistema de reprogramação base. Este método de reprogramação mostra resultados consistentes e de alta eficiência em termos de rentabilidade.

Normalmente fibroblastos infectados não apresentam quaisquer alterações morfológicas nos vários dias após a transdução de vírus Sendai, mas cinco dias depois, eles começam a ter formas diferentes (Figura 1). Conforme descrito em um painel direito da Figura 1, as células não têm morfologia de fibroblastos típico mais. Eles têm uma forma redonda e núcleo maior do que o citoplasma. Mesmo quando a transdução é realizada em 80% de confluência celular, parece que eles são menos confluentes no...

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos com o vírus Sendai. Isso é feito primeiro preparando e plaqueando as células de fibroblastos a serem transduzidas. O próximo passo do procedimento é infectar as células com o vírus Sendai.Em seguida, as células de fibroblastos infectadas são transferidas para células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongos frescos. A etapa final é escolher manualmente o reprogramado. Agora, as células-tronco pluripotentes, em última análise, a reprogramação de células de fibroblastos em I PSCs, sem o uso de genes trans, pode ser mostrada por meio de imunomarcação e RTPCR.A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que ela aumenta a eficiência da reprogramação sem permanecer transing e de maneira econômica Para este protocolo, tenha fibroblastos humanos prontos cultivados em DMEM. Com o FBS, transfira essas células para placas de 24 poços para o experimento, coloque as células em seis diluições seriais para determinar a melhor densidade para a fixação celular. Cada fileira da placa de 24 poços pode acomodar uma série de células de diluição.Assim, quatro tipos de células podem ser testados em uma placa, incubar a diluição por 24 horas. No dia seguinte, selecione poços em três níveis de confluência para transdução. Um em um nível alto de 80 a 90% de confluência, um em cerca de 60% de confluência e o terceiro em cerca de 30% de confluência uma hora ou mais antes da transdução.Substitua o meio por 300 microlitros de meio de fibroblastos fresco para o descongelamento da transdução. Um conjunto de tubos de vírus Sendai a 37 graus Celsius por alguns segundos e depois termina. Descongelando-os em temperatura ambiente.Centrifugue os vírus descongelados a 6.000 G por 10 segundos e armazene-os no gelo em um tubo de microcentrífuga. Faça uma mistura dos vírus calculada de acordo com o número de células a serem transduzidas. Os detalhes do cálculo podem ser encontrados no protocolo de texto.Misture bem os vírus com pipetagem suave. Agora, às células mais densas, adicione dois volumes de vírus. Adicione um volume de vírus às células de densidade média e adicione meio volume de vírus à seleção menos densa.Gire a placa e deixe-a incubar durante a noite para que a reação ocorra no dia seguinte. Substitua o meio por 500 microlitros de meio de fibroblastos fresco. Faça isso novamente dois dias depois, três dias após a segunda alteração de mídia feita nas células transduzidas.Prepare células de metanfetamina em placas de 60 milímetros com DMEM contendo 10% de placa FBS 500.000 células por placa e incube-as durante a noite. No dia seguinte, substitua a mídia nas células de metanfetamina por mídia nova e, em seguida, prossiga com a configuração da co-cultura. Primeiro, remova a mídia dos fibroblastos transduzidos e lave-os uma vez com a PPBD.Em seguida, adicione 200 microlitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada poço transduzido de células em cinco minutos. Agrupe todas as células de desprendimento em um único tubo cônico de 15 mililitros. Gire as células a 1.350 G por quatro minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células peletizadas com cerca de cinco mililitros de meio fresco para neutralizar o trippino. Agora colete as células com outro giro de quatro minutos a 1.350 G.Próxima placa. A maioria das células tem seis diluições seriais em metanfetamina.A primeira e a última diluições podem não ser necessárias, dependendo da taxa de mortalidade das células. Guarde algumas das células para uma extração de RNA e incube as placas durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio por meio ES humano suplementado com 10 micromolares de inibidor de RO quinase Y 2 7 6 3 2.Para melhorar a sobrevivência celular durante os dias seguintes, mude o meio para um meio ES humano normal não suplementado. Após uma semana de cultivo, comece a verificar os pratos a cada poucos dias para a formação de aglomerados de células semelhantes a colônias ES. Assim que aparecerem, monitore o crescimento.Três semanas após a transdução, as colônias de aglomerados de células ES devem estar prontas para expansão. Preparei células alimentadoras de metanfetamina em placas de 24 poços, assim como foram preparadas para placas de 60 milímetros. Antes de escolher qualquer colônia, troque o meio nas células de metanfetamina por meio ES com 10 microlitros de Y 2 7, 6, 3, 2.Escolha uma colônia de cada vez nos pratos. Transfira a colônia para um tubo de 15 mililitros com a solução. Quebre a colônia usando o pipetador.Em seguida, cubra um eu. Bem, com a colônia quebrada. Por fim, carregue cada poço com uma colônia quebrada e carregue o máximo de poços possível.Mantenha as células com mudanças diárias de mídia e expanda-as para placas de seis poços e, em seguida, placas de 60 milímetros. Normalmente, os fibroblastos infectados pelo vírus Sendai não apresentam alterações morfológicas até depois de cinco dias. Em seguida, as células assumem uma forma redonda com um núcleo maior e um citoplasma menor.Este protocolo de pequena escala inclui vários parâmetros que podem ser otimizados, como densidade de fibroblastos, título de vírus e densidade de plaqueamento para o mes. A transdução de células em diferentes cofluências mostradas em cores diferentes também pode ser otimizada. Após uma semana de co-cultura com células alimentadoras de metanfetamina, os fibroblastos parcialmente reprogramados têm uma forma solta e são facilmente colhidos em vez de serem coletados usando tripsina.Totalmente reprogramadas, as I PSCs são claramente identificáveis a partir de células parcialmente reprogramadas. As células totalmente reprogramadas são compactadas e as colônias podem ter limites claros. Células parcialmente reprogramadas formam aglomerados soltos que são facilmente desconectados.Depois de expandir os clones IPSC por várias semanas, a coloração para marcadores de células-tronco é necessária em comparação com as células H nove. Os IPCs são positivos para vários anticorpos esperados, incluindo SSEA quatro, OCT quatro, TRA 81 e nano G, apoiando sua qualidade pluripotente. O uso da expressão do transgene R-T-P-C-R não foi observado em clones de IPSC humanos.Após 10 primers para OCT exógena quatro, SOX dois, klf quatro e Cmic foram usados com amostras de controle positivo que apresentaram fortes níveis de expressão transgênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar células somáticas para induzir as células-tronco polipotentes e como selecioná-las, reprogramar completamente as células das outras células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

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