Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

O objetivo geral deste procedimento é traçar o perfil dos níveis de expressão gênica de células-tronco embrionárias humanas individuais usando a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa de célula única, ou RTPCR. Isso é feito primeiro usando a classificação de células ativadas por fluorescência para classificar células individuais em cada poço de uma placa de 96 poços contendo tampão de lise celular. O segundo passo é transcrever RNA reverso para gerar CDNA a partir de lisados de células únicas.

Em seguida, o CDNA é amplificado pela reação em cadeia da polimerase. A etapa final é realizar RTPC quantitativo no CDNA amplificado. Em última análise, este ensaio é útil para estudar a expressão gênica em populações heterogêneas, como células-tronco embrionárias humanas.

A principal vantagem desta técnica sobre o vaso artificial quantitativo de célula única existente é que este método, EEG e mais robusto Antes da purificação por fax. As células-tronco embrionárias humanas EGFP de quatro OCT ou Hess são separadas da antena de 60 milímetros. Remova todo o meio, adicione um mililitro de Accutane e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Neutralize Accutane com um mililitro de centrífuga de meio ES humano para granular as células após descartar o sobrenadante, ressuspender as células em tampão de fax e ajustar a concentração para uma vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, passe a amostra de célula por um tubo de filtro de célula de 35 micrômetros. Armazene o tubo no gelo antes da classificação das células.

Comece este procedimento preparando uma mistura principal contendo um microlitro de célula única D, Ns, um e nove microlitros de solução de lise de célula única. Para cada um, transfira 10 microlitros da solução de mistura para cada poço de uma placa PCR de 96 poços para o programa de análise de fax, o classificador de células para classificar células EGFP positivas únicas nos poços da placa PCR de 96 poços após a classificação das células, incube as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente para lise celular. Para interromper a reação de lise, adicione um microlitro de solução de parada e incube em temperatura ambiente por dois minutos.

Para iniciar este procedimento, primeiro adicione a cada poço da placa de 96 poços um Eloqua de 0,5 microlitro de 20 primers micromolares SMAT 15 e SMAA. Aqueça as amostras a 80 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de cinco tampão x, dois microlitros de TDT, um microlitro de transcriptase reversa e um microlitro de D e tps.

Para cada poço, execute a transcrição reversa em um termociclador. Defina o programa térmico em 42 graus Celsius por 90 minutos, seguido de 85 graus Celsius por cinco minutos. Para inativar a transcriptase reversa quando a transcrição reversa estiver completa, adicione quatro microlitros de exo reagente a cada amostra de CDNA incubada a 37 graus Celsius por 15 minutos para digerir o excesso de oligonucleotídeos, seguido por 80 graus Celsius por 15 minutos.

Para inativar o exo reagente, prepare a mistura de reação de PCR com dois nano molares do primer SMAP dois. Adicione 10 microlitros da mistura de reação de PCR. Para cada amostra transcrita reversa.

Realizar a amplificação composta por 20 ciclos de desnaturação, um ajoelhar e extensão após a amplificação das amostras realizadas dois conjuntos de reações quantitativas R-T-P-C-R em placas separadas para confirmar os resultados R-T-P-C-R para cada poço das 2 placas de 96 poços adicionar 10 microlitros de dois x cyber green. A PCR master mixa um microlitro de CDNA amplificado, dois primers e sete microlitros de água. Defina o programa para 95 graus Celsius por três segundos, seguido de 60 graus Celsius por 30 segundos.

Por 40 ciclos, o passo de ajoelhar é removido para reduzir o erro do primer. Ajoelhado neste estudo, quantidades de microgramas de RNA total de Hess foram diluídas até níveis de nano e picograma para avaliar a variabilidade técnica e a detecção de diferença em pequenas quantidades de RNA total quantitativo R-T-P-C-R do gene G-A-P-D-H foi realizada usando RM. NA de cascas agrupadas diluídas em série de 10 nanogramas por microlitro para 0,1 picogramas por microlitro. Cada ponto mostra o valor de TC de mRNA diluído em série e mRNA de célula única classificados por fax.

Foi observada uma correlação entre cada amostra e os resultados do QR TPCR com várias células únicas mostrando valores de TC semelhantes. O fax foi usado para classificar e selecionar células positivas fortes para EEG FP de uma linha HESC repórter EGFP OCT quatro. Os resultados mostram uma população positiva para EGFP de aproximadamente 60% em comparação com a população negativa para validar a consistência entre diferentes lotes de reações de transcrição reversa e amplificação.

Os lisados de células únicas purificados por fax foram divididos ao meio e o protocolo aplicado a cada metade para comparações de lotes. Foi observada uma correlação significativa entre o valor de OCT quatro CT de cada metade dos lisados de células únicas. Uma apresentação de mapa de calor da expressão gênica de casca única mostra um nível consistente e robusto de expressão de OCT quatro, mas níveis variados de outro gene marcador de células-tronco, NAN og em conjunto, nossos resultados demonstram que este ensaio de expressão gênica de célula única é útil para estudar heterogeneidades populacionais de células-tronco pluripotentes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como executar o QITP para transcriptoma de célula única corretamente.