Name: Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a perfilar a expressão gênica em células-tronco embrionárias humanas individuais por RT-PCR quantitativo. Este método revela heterogeneidades populacionais essenciais para a biologia de células-tronco.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lee pelas valiosas discussões sobre o manuscrito. Trabalho no laboratório Lee foi apoiada por doações de Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation e de Maryland Stem Cell Research Fund (Tedco).

1. Preparação de uma placa de 96 poços <ol><li> Misture 1 ml de Single Cell DNase1 a 9 mL Single Cell Lysis Solution. </li><li> Coloque a solução mista de 10 mL em cada poço da placa de 96 poços de PCR. </li></ol> 2. Detaching hESCs para FACS Purificação <ol><li> Separar OCT4 :: linha de células ES a partir de EGFP o prato de 60 mm e 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, as quais foram neutralizadas com meio ES humano. </li><li> Prepare a população de células em 1 ml de tampão de FACS e ajustar o celular para 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Passar a amostra de células através de um coador de células de 35 mM tampão tubo. </li><li> Armazenar o tubo em gelo antes de separação de células. </li></ol> 3. Lise de FACS purificado célula única em cada poço da placa de 96 poços <ol><li> Classificar a amostra para células positivas EGFP em um classificador de células com um operador treinado. Coloque a única célula em solução Lysis/DNase1 única célula em placa de 96 poços PCR. Se necessário, a 96 poços da placa com a amostra pode ser armazenada num congelador a -80 ° C de profundidade inferior a um mês. </li><li> Incubar as amostras 5 min à temperatura ambiente para a lise celular. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de paragem para parar reação de lise. </li><li> Incubar 2 min à temperatura ambiente. </li></ol> 4. Transcrição reversa <ol><li> Adicione a cada uma alíquota de 0,5 mL de 20 mM SMA-T15, SMA-A. </li><li> Adicionar tampão 4 uL de 5X, 2 uL de DTT, 1 ul de transcriptase reversa, e 1 ul de dNTP em cada poço. </li><li> Realizar a transcrição reversa num termociclador. <ol><li> Definir o programa térmico a 42 ° C x 90 min e inactivar transcriptase reversa a 85 ° C x 5 min. </li></ol></li></ol> 5. Amplificação <ol><li> Adicionar 4 mL de reagente ExoSAP-IT para cada amostra transcrita reverter. <ol><li> Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min e 80 ° C durante 15 min para inactivar o reagente ExoSAP-IT. </li></ol></li><li> Preparar a mistura de reacção de PCR wom SMA-p2 (2 nM) </li><li> Adicionam-se 10 ul de mistura de reacção de PCR para cada uma das amostras de transcrição reversa. </li><li> Realizar a amplificação, consistindo em 20 ciclos de desnaturação (94 ° C durante 30 seg), emparelhamento (57 ° C durante 30 seg) e extensão (68 ° C durante 10 min). </li></ol> 6. Desempenho de qRT-PCR <ol><li> Adicionar 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul de amplificado de ADNc, os iniciadores 2 nM, e 7 mL de água a cada poço. <ol><li> Definir o programa seguido por 95 ° C durante 3 seg, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos. </li></ol></li><li> Realiza-se em duplicado por erros técnicos. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Profiling gene célula única pode ser uma ferramenta importante para prever a funcionalidade de uma única célula ou uma população inteira. Devido a uma limitação técnica, análise de perfis gene inteiro tenha sido restrita às médias populacionais. As variações nos padrões de expressão dos genes e os níveis de entre as células individuais e as subpopulações foram propostos para fazer com que a interpretação errada. Tais aspectos celulares diferentes podem ser encontrados em hESCs e sua heterogeneidade faz com que a capacid...

Populações eucariotos maioria superiores são heterogêneos, assim, com a análise da amostragem populacional, muitas vezes é difícil de interpretar as suas características celulares. As células individuais dentro de uma população pode ser sutilmente diferente, e essas diferenças podem ter consequências importantes para a propriedade ea função de toda a população 1, 2. Especialmente, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são conhecidos por ser heterogêneo, o que provoca diferentes níveis de pluripotência e diversas potencialidades para especificação das linhagens em delicadamente e distintas formas 3, 4. Por exemplo, os antigénios de superfície de células diferentes podem ser usados ​​para classificar as células estaminais pluripotentes indiferenciadas, 5 e o grupo Austin Smith propostos diferentes níveis de pluripotência em mastócitos embrionários de ratinho, com base na sua morfologia, propensão diferenciação e dependência da via de sinalização 6. Este fenômeno foi levantada a hipótese de embrião humanoAs células estaminais nic 7. Considerando que os estudos gerais foram realizadas entre as diferentes linhas de células estaminais, e não células-tronco único indivíduo, que poderia ser muito interessante para analisar diferentes níveis de pluripotência no nível da célula única, o que potencialmente afeta as suas capacidades de diferenciação em relação a todas as linhagens de células somáticas. Heterogeneidade celular e molecular pode ser ditada pela transcrição de perfil, que é chamado de &#39;transcriptoma única célula&#39; e destaca novas abordagens para quantificar os níveis de expressão do gene 8-10. Para a análise dos níveis de expressão de genes em células individuais, foi desenvolvido um protocolo simples, mas robusta de uma única célula RT-PCR quantitativo. Foi confirmada a eficácia e viabilidade do nosso protocolo, comparando cada metade de lisados ​​de células individuais, bem como RNAs totais diluídas em série de hESCs, resultando em variações técnicas mínimas e diferenças. Além disso, foi utilizada uma linha repórter genética para isolar homogênea população de hESCs utilizando sistema de metas de gene. O vector dador de segmentação OCT4 lócus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construção) e um par de plasmídeos talen foram usadas 11. O vetor doador e um par de plasmídeos Talen foram introduzidos hESCs (H9, WA09) usando nosso nucleofection e protocolo de seleção clonal e manutenção de hESCs foi realizada com base no nosso protocolo de rotina 12. Nós confirmamos esta linha repórter genética expressar EGFP para a expressão OCT4 em OCT4 :: EGFP hESCs. Nosso resultado demonstra que hESCs individuais (classificadas por OCT4 :: EGFP células fortemente positivas) manter altos níveis de expressão OCT4, mas diferentes níveis de expressão NANOG. Então, o nosso ensaio de expressão único gene de células deve ser útil para estudar as heterogeneidades da população de células-tronco pluripotentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de PCR de 96 poços</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Lise de Células Ambion</td> Life <td>Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Transcriptase Reversa</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerase Alta Fidelidade</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tampão</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu; l DNase, filtro esterilizado</td></tr><tr><td>35 &mu; tubos de filtro de células m BD</td><td>Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling individual células estaminais embrionárias humanas por rt-pcr quantitativo

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

A heterogeneidade da população de células-tronco dificulta compreensão detalhada da biologia de células-tronco, tais como a sua propensão para a diferenciação diferentes linhagens. Um ensaio de transcriptoma única célula pode ser uma nova abordagem para dissecar variação individual. Desenvolvemos o método de uma única célula de qRT-PCR, e confirmaram que o método funciona bem em vários perfis de expressão de gene. Em nível de uma única célula, cada célula-tronco embrionárias humanas, classificado por OCT4 :: células positivas EGFP, tem alta expressão no OCT4, mas um nível diferente de expressão NANOG. Nosso ensaio de expressão único gene da célula deve ser útil para interrogar heterogeneidades da população.

Amplificação de RNA única célula eficiente e robusta Para minimizar a variação transcricional entre hESCs, usamos OCT4 :: EGFP hESC clone para FACS purificação. Após a separação de células positivas Oct4 :: EGFP em uma placa de 96 poços, cada célula é lisadas em tampão de lise e convertido poli (A) + RNA para cDNA de comprimento completo utilizando o SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) e iniciador de ancoragem com o SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) usando a tecn...

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar os níveis de expressão gênica de células-tronco embrionárias humanas individuais utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa em célula única, ou R-T-P-C-R. Isso é realizado primeiramente utilizando a triagem de células ativada por fluorescência para separar células individuais em cada poço de uma placa de 96 poços contendo tampão de lise celular. O segundo passo é transcrever reversamente o RNA para gerar CDNA a partir de lisados de células únicas.Em seguida, o cDNA é amplificado por reação em cadeia da polimerase. A etapa final consiste em realizar a R-T-P-C-R quantitativa no cDNA amplificado. Em última análise, este ensaio é útil para estudar a expressão gênica em populações heterogêneas, como células-tronco embrionárias humanas.A principal vantagem desta técnica em relação aos atuais vasos artificiais quantitativos de célula única é que este método é mais eficiente e robusto antes da purificação por fax. As células-tronco embrionárias humanas OCT4-EGFP ou Hess são destacadas do prato de 60 milímetros. Remova todo o meio, adicione um mililitro de Accutase e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos.Neutralize o Accutane com um mililitro de meio ES humano, centrifugue para obter o pellet celular, descarte o sobrenadante, re-suspenda as células em tampão fax e ajuste a concentração para um vezes 10 à sexta células por mililitro. Em seguida, passe a amostra celular através de um tubo cônico com peneira celular de 35 micrômetros. Armazene o tubo no gelo antes da separação celular.Inicie este procedimento preparando uma mistura-mestre contendo um microlitro de DNs de célula única e nove microlitros de solução de lise de célula única. Para cada poço, transfira 10 microlitros da mistura para cada poço de uma placa PCR de 96 poços para o programa de análise de fax, e use o classificador de células para separar células EGFP positivas individuais nos poços da placa PCR de 96 poços. Após a classificação celular, incube as amostras por cinco minutos à temperatura ambiente para a lise celular. Para interromper a reação de lise, adicione um microlitro de solução de parada e incube à temperatura ambiente por dois minutos.Para iniciar este procedimento, adicione primeiramente a cada poço da placa de 96 poços 0,5 microlitro de Eloqua contendo primers SMAT 15 e SMAA de 20 micromolar. Aqueça as amostras a 80 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de tampão 5x, dois microlitros de DTT, um microlitro de transcriptase reversa e um microlitro de D e tps.Em cada poço, realize a transcrição reversa em um ciclador térmico. Configure o programa térmico em 42 graus Celsius por 90 minutos, seguido de 85 graus Celsius por cinco minutos. Para inativar a transcriptase reversa quando a transcrição reversa estiver concluída, adicione quatro microlitros de reagente exo a cada amostra de cDNA e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos para digerir oligonucleotídeos em excesso, seguido de 80 graus Celsius por 15 minutos.Para inativar o reagente exo, prepare a mistura de reação de PCR com dois nanomolares do iniciador SMAP dois. Adicione 10 microlitros da mistura de reação de PCR a cada amostra transcrita reversamente.Realize a amplificação consistindo em 20 ciclos de desnaturação, hibridização e extensão; após a amplificação das amostras, realize dois conjuntos de reações de R-T-P-C-R quantitativa em placas separadas para confirmar os resultados de R-T-P-C-R; em cada poço das duas placas de 96 poços, adicione 10 microlitros do mix mestre PCR a dois x cyber green, um microlitro de cDNA amplificado, dois iniciadores e sete microlitros de água. Configure o programa para 95 graus Celsius por três segundos, seguido por 60 graus Celsius por 30 segundos.Por 40 ciclos, um passo de anelamento é removido para reduzir o erro do iniciador. Neste estudo, quantidades em microgramas de RNA total de Hess foram diluídas até níveis de nanogramas e picogramas para avaliar a variabilidade técnica e a detecção de diferenças em pequenas quantidades de RNA total; a R-T-P-C-R quantitativa do gene G-A-P-D-H foi realizada utilizando MR.NA de cascas agrupadas diluídas em série de 10 nanogramas por microlitro até 0,1 picogramas por microlitro. Cada ponto mostra o valor de CT de mRNA diluído em série e mRNA de célula única classificado por fax.Uma correlação foi observada entre cada amostra e os resultados de PCR em tempo real, com várias células isoladas apresentando valores de CT semelhantes. A citometria de fluxo foi utilizada para classificar e selecionar células fortemente positivas para EEG FP a partir de uma linhagem de CÉS com repórter OCT4-EGFP. Os resultados mostram uma população positiva para EGFP de aproximadamente 60% em comparação com a população negativa, a fim de validar a consistência entre diferentes lotes de reações de transcrição reversa e amplificação.Os lisados de células individuais purificados por Fax foram divididos ao meio, e o protocolo foi aplicado a cada metade para comparações em lote. Foi observada uma correlação significativa entre os valores de CT do OCT4 em cada metade dos lisados de células individuais. Uma representação em mapa de calor da expressão gênica em células individuais mostra um nível consistente e robusto de expressão de OCT4, mas níveis variáveis de outro gene marcador de células-tronco, NANOG. Em conjunto, nossos resultados demonstram que este ensaio de expressão gênica em célula única é útil para o estudo de heterogeneidades populacionais de células-tronco pluripotentes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar adequadamente o QITP para o transcriptoma de célula única.

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