Name: Papel colorimétrico à base de Detecção de Escherichia coli, Salmonella Spp. E Listeria monocytogenes A partir de grandes volumes de água Agrícola (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprenda a detectar patógenos em grandes volumes de água agrícola usando dispositivos colorimétricos em papel e Escherichia coli como alvo. Este método permite monitoramento rápido da segurança hídica.

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Agradecemos o financiamento para este projeto das doações do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA 2009-01208 e 2009-01984.

1. Concentração de bactérias a partir de grandes volumes de água agrícolas que utilizam MMS <ol><li> Preparação MMS <ol><li> Corte uma seção retangular de 4-ply gaze medindo 40 x 12 cm. </li><li> Dobre o pano ao longo de ambos os eixos para obter um retângulo de 20 x 6 cm. </li><li> Enrole a gaze firmemente ao longo do seu eixo longitudinal de modo a formar uma haste cilíndrica de cerca de 6 cm de altura e 3 cm de diâmetro. </li><li> Autoclave o cotonete gaze em papel alumínio, não autoclave cassete. Descontaminar a cassete por imersão durante 30 minutos em 10% de água sanitária, e desactivar o cloro residual por imersão a cassete durante 15 minutos em um pentahidrato de tiossulfato de sódio (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) de solução (50 mg / L preparadas em água estéril). </li><li> Insira o cotonete na cassete MMS. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, comece com uma folha de 4-ply de gaze menta 80 x 22 cm, dobre-o para 40 x 11 cm e enrole para formar um cilindro de aproximadamente 11 cm de altura e 6 cm de diâmetro. </li><li> Monte o MMS. </li><li> Anexar tubo de vinil de espigões em ambos os lados do MMS, garantindo a tubagem adere completamente aos espigões, e corrigir tubo na bomba peristáltica. Certifique-se de que a tubagem a montante da bomba peristáltica é de comprimento suficiente para amostragem. </li></ol></li><li> A concentração de bactérias <ol><li> Amostra de pelo menos 10 litros de água agrícola, executando a bomba peristáltica em alta velocidade. </li><li> Após a amostragem for concluída, retirar a entrada da bomba peristáltica a partir da amostra de água e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS. </li><li> Se um colector é usado para executar várias amostras ao mesmo tempo, recolher o efluente de cada MMS, e quando é 10 L é filtrada através de um único MMS fechar a válvula para que o MMS particulares e continuar a funcionar a bomba. <ol><li> Quando a amostragem is concluído, retire a entrada da bomba peristáltica da água na agricultura, abrir todas as válvulas do colector, e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS. </li></ol></li></ol></li><li> Quando a concentração tenha sido concluída para todas as mensagens MMS, remova cuidadosamente o tubo de vinil a partir das torneiras MMS e tampar as torneiras em ambos os lados do MMS. MMS bem fechados pode ser armazenado por até 12 horas antes de adicionar mídia de enriquecimento. </li></ol> 2. MMS Enriquecimento e Preparação de Amostras <ol><li> Enriquecimento <ol><li> Soltar a tampa do MMS, e adicionar assepticamente 20 ml de caldo de enriquecimento estéril apropriado. Use um MMS para cada enriquecimento seletivo. Alternativamente, realizar um enriquecimento não selectivo para propagar as três bactérias alvo na mesma amostra. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, de forma asséptica remover filtro de pano da cassete e coloque em um saco estéril antes de anúncioding 225 ml da mídia enriquecimento adequado. <ol><li> Para o enriquecimento de E. coli, adicionar 20 ml de água de peptona tamponada (BPW) suplementado com 8 mg / L de cloridrato de vancomicina. </li><li> Para o enriquecimento de Salmonella spp., Adicionar 20 ml de BPW suplementado com o suplemento de Salmonella (4 ml / l). </li><li> Para o enriquecimento de L. monocytogenes, adicione 20 ml de VIDAS UP Listeria (LPT) caldo. </li><li> Para enriquecimento não seletivo simultânea para todos os três microrganismos utilizando um único MMS, use caldo preenrichment universal (UPB). </li></ol></li><li> Feche a tampa do MMS para trás com força. Certifique-se de que as torneiras estão bem tampada, para evitar derrames e possível contaminação durante o enriquecimento. </li><li> Incubar as MMS para até 18-24 horas numa incubadora com agitação a 200 rpm. Utilizar 42 ° C durante E. coli e Salmonella spp. enriquecimentos seletivos. Use 30 ° C para L. monocytogenes enriquecimento seletivo, e usar 37 &amp; #176; C para o enriquecimento não-seletivo. </li></ol></li><li> Preparação de Amostras <ol><li> Quando incubação estiver concluída, remova as MMS da incubadora, destampar uma das torneiras, e gentilmente dispensar cerca de 0,5 ml em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, desapertar os MMS e pipeta fora 0,5 ml de enriquecimento durante a noite. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, pipetar 0,5 ml de enriquecimento do saco. </li><li> Para a análise colorimétrica de E. coli de enriquecimento selectivo, ou para a análise dos enriquecimentos não selectivos, sonicar 0,5 ml de enriquecimento a 5 W, 22 kHz, durante 20 segundos usando um sonicador de sonda. </li></ol></li></ol> 3. Preparação e incorporação de substratos colorimétricos em μPADs <ol><li> Prepare μPADs suficientes para cada amostra e alvo testado. Para detectar E. coli preparar CPRG e X-Glic μPADs, por Salmonella spp. detecção preparar μPADs MC, e por L. monocytdetecção ogenes preparar μPADs X-InP. <ol><li> Preparar tampão HEPES [0,1 M de HEPES com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)] para os substratos colorimétricos e ajustar o pH do tampão de acordo com o substrato que vai ser usado: pH 7,5 para a preparação de CPRG ou X-Gluc, pH 9 para MC, e pH 7 para X-InP. </li><li> Preparar soluções stock dos substratos em que o pH ajustado a concentrações de tampão de HEPES de 3 mM (CPRG), 62,5 mM de (X-Gluc), 15 mM de (MC), 100 mM de (X-InP). Proteger as soluções estoque da luz. </li><li> Coloque os μPADs dentro de uma placa de Petri estéril, em seguida, encaixar o microspot μPAD com 24 mL de cada solução de substrato. </li></ol></li></ol> 4. Detecção e Análise de Dados <ol><li> Detecção <ol><li> Adicionar 6 ml da amostra enriquecida para cada microspot μPAD apropriado contido em uma placa de Petri. </li><li> Coloque a tampa de volta na placa de Petri e selá-lo com Parafilm. </li><li> Incubar a amostracom a μPAD a 37 ° C durante até 3 horas para permitir o desenvolvimento da cor e secagem dos microspots. </li></ol></li><li> Exame visual dos resultados <ol><li> Realizar a detecção por simples inspeção visual das mudanças de cor das μPADs. NOTA: Normalmente, fortes reações que produzem mudanças de cor definitivos são esperados com a 18-24 horas de enriquecimento, o que deve evitar a necessidade de mais esclarecimentos e deve ser considerado positivo. </li><li> Determinar a presença de uma E. coli amostra positiva, observando microspots encaixados com a mudança CPRG do amarelo ao vermelho-violeta e microspots encaixados com X-Gluc mudança de incolor a azul-esverdeada. </li><li> Determinar a presença de um L. monocytogenes amostra positiva, observando microspots encaixados com X-InP mudança de incolor a índigo. </li><li> Determinar a presença de uma Salmonella spp. amostra positiva por microspots observando encaixados com MC mudança de colorless ao roxo-lilás. </li></ol></li><li> Software Aided Análise de Dados NOTA: Conduzido para determinar claramente se reacções fracas são positivos ou negativos e permitir uma análise semi-quantitativa dos resultados. <ol><li> Permitir que as μPADs para secar completamente. </li><li> Digitalizar o μPAD usando um scanner plano. </li><li> Use o software ImageJ para processar a imagem. <ol><li> &quot;Abrir&quot; imagem digitalizada para ser analisado em ImageJ localizado na guia &quot;Arquivo&quot; no menu principal (ou pressione &quot;Clt + O&quot;). </li><li> Inverta a imagem selecionando &quot;Inverter&quot;, localizada na aba &quot;Editar&quot; no menu principal (ou pressione &quot;Clt + Shift + I&quot;). </li><li> Use a guia &quot;Analisar&quot; no menu principal e selecione &quot;Definir Medidas ...&quot; para selecionar as medições relatados analisados. </li><li> Certifique-se de que a &quot;intensidade de cinza média&quot;, &quot;Limite de limiar&quot;, e &quot;caixas rótulo de exibição&quot; sãomarcada, e pressione &quot;OK&quot;. Isso define a forma como o software analisa cada área selecionada e como ela relata ele. </li><li> Use a ferramenta &quot;Oval&quot; para desenhar um círculo que define a área que você deseja medir dentro. </li><li> Sob a guia &quot;Analisar&quot;, selecione &quot;Measure&quot;, (ou pressione &quot;Clt + M&quot;). O software irá medir a intensidade cinza médio dentro da área definida e relatá-lo em uma tela pop-up que pode ser copiado e colado para se destacar para análise posterior. NOTA: Para uma análise mais precisa, pelo menos, duas repetições técnicos de cada amostra deve ser realizada. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
<li>Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+from+large+volumes+of+water%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li>
<li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li>
<li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Solicitation+Number%3A+FDA-SS-1116253%22">Solicitation Number: FDA-SS-1116253</a>. , Administration USFaD. (2013).</li>
<li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li>
<li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li>
<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
<li>Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).</li>
<li>T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve um método para a detecção de E. integrado coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes em água agrícola. Aqui, a concentração de MMS de bactérias a partir de grandes volumes (10 L) de água na agricultura, é acoplado com o enriquecimento bacteriana, e detecção colorimétrica de bactérias indicativo usando μPADs. O procedimento MMS pode lidar com elevado teor de partículas nas amostras de água enquanto se concentra a bactérias de 10 vezes, é robusta e simples o suficiente par...

É importante que os agentes de doenças de origem alimentar são detectados rapidamente e de preferência em ambientes baseados em campo, a fim de reduzir a carga de doenças transmitidas por alimentos. As estratégias comuns para detectar bactérias patogênicas transmitidas por alimentos incluem perfis bioquímicos, cultura seletivo e diferencial, isolamento e detecção imunológica e detecção molecular. No entanto, estes métodos são prejudicados pela contaminação esporádica, pequenas amostras testadas, as baixas concentrações muitas vezes das bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, requerem longos tempos de processamento e / ou não são aplicáveis ​​para as definições de campo. Além disso, os compostos em diversas matrizes alimentares são inibitórios para aplicações de diagnóstico e detecção. A fim de melhorar a probabilidade de detecção microbiana, os Estados Unidos Food and Drug Administration tem sugerido que o teste da água na agricultura (como água de lavagem e água de irrigação), que quer entrar em contato com uma grande superfície de produtos frescos ou serve como um veículo para pcontaminação roduce é uma alternativa viável para o teste direto de alimentos 1. Mesmo assim, a freqüência baixa patógeno-peso natural, juntamente com o efeito de diluição da amostra de água agrícola representante torna os métodos de preparação de amostras para a concentração do patógeno essencial. Tal método poderia exigir a amostragem de grandes volumes de água (≥ 10 L), adequada patógeno-concentração, e compatibilidade com estratégias de detecção a jusante. Cotonetes Moore Modificados (MMS) são dispositivos de baixo custo, simples e robustos utilizados para concentrar bactérias de grandes volumes (≥ 10 L) de água 2-4. O MMS é composta de uma cassete de plástico cheio com gaze, que serve como um filtro grosseiro para grandes volumes de água bombeados através da caixa, utilizando uma bomba peristáltica. O MMS é um método não-discriminatório de concentração bacteriana (≥ concentração 10 vezes) que captura material particulado orgânico e inorgânico, incluindo microrganismos em li processadoamostras quid. É provável que a excelente eficiência de concentração de microrganismos alvo por o MMS pode ser explicado pelo fato de que os microorganismos devem ser ligados à fracção-argilo ou micro-agregados orgânicos dos sólidos em suspensão 3. O design robusto do MMS permite superar a maioria dos defeitos associados a outros métodos de filtragem para a captura e concentração de bactérias da água, como o entupimento dos filtros, a incapacidade de processar grandes volumes, as amostras de filtro com alta turbidez, e custos elevados. Por estas razões, o FDA está recomendando que da MMS ser incorporados procedimentos oficiais para procedimentos de coleta de amostras ambientais e relacionadas com a produzir 5. Aqui, é descrito um método para a concentração, o enriquecimento, e a detecção de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes de águas agrícolas. A MMS é usado para concentração de bactériaeria, e também serve como um recipiente para o enriquecimento selectivo de bactérias ou não selectiva. Detecção bacteriana é conseguido bioquimicamente usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPADs) 6. μPADs pode ser fabricado como redes fluídicas ou testes local usando uma variedade de métodos, incluindo fotolitografia, impressão a jato de tinta, estampagem, e cera de impressão 7-11. Exemplos de modelos de fluidos podem ser os padrões de canal dendríticas em que a amostra é depositada no centro e, subsequentemente, os fluxos de reservatórios distais ou padrões de canal único, no qual a amostra ou o substrato são puxados a partir dos reservatórios exteriores do canal, por acção capilar até ao centro 12. Para este protocolo, optou-se por empregar para 7 mm de diâmetro com papel de cera matrizes ponto encaixados com substratos cromogênicos que podem ser processados ​​por enzimas indicativas dos microrganismos testados aqui: Clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG) e 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronido (X-Gluc)para detecção de β-galactosidase e β-glucuronidase produzidas por E. coli; Caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (magenta caprilato) para a detecção de C8-esterase produzidas por Salmonella spp.; e-5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato de mio-inositol (X-InP) para a detecção específica de fosfatidilinositol-fosfolipase C (PLC-PI) produzida por L. monocytogenes 6. Assim, a presença de uma bactéria em particular pode ser observado visualmente, sem a necessidade de equipamento complexo ou a interpretação de dados. A especificidade e sensibilidade da detecção colorimétrica μPAD à base de enzimas destas bactérias alvo específicas tem sido explorada anteriormente 6. Além disso, a sensibilidade do método de detecção de concentração integrada para estas bactérias alvo foi avaliada por cravação de grandes volumes de água com níveis de microorganismos (dados não publicados e Bisha et al. 13) pré-determinados.

<table><tbody><tr><td>Água</td><td></td><td></td> agrícola <td>Água de irrigação, produzir água de lavagem, água de poço, etc.</td></tr><tr><td>Tubo de vinil</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&nbsp; 1/4" de diâmetro interno,&nbsp; Diâmetro externo de 3/8", disponível em:&nbsp; http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>Cartucho de cotonete Moore modificado</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>11 &frac12; cm de comprimento e 4 &frac12; cm de largura, disponível em:&nbsp; http://www.lumierediagnostics.com.&nbsp; Alternativamente, uma versão não descartável do cartucho pode ser usada (consulte o texto)</td></tr> <tr><td>Gaze</td><td>Chesapeake Wiper & Fornecimento, Inc.</td><td>CC90</td><td>Grau #90, tecido 44 x 36, disponível em:&nbsp; www.raglady.com</td></tr><tr><td>Alvejante doméstico</td><td>Várias</td><td></td><td>concentrações de hipoclorito de sódio aprox. 6%</td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio 5-hidrato</td><td>Manifold Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>Construído</td><td>internamente</td><td></td><td>Opcional, o dispositivo pode ser construído a partir de tubos de PVC e conexões apropriadas</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Medidores de mícron</td><td>RPP1300</td><td>Disponível em:&nbsp; http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica</td><td>Vários</td><td></td><td>Descartáveis, 10 ml</td></tr><tr><td>Caldo de pré-enriquecimento universal</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>Água peptonada tamponada</td><td>Suplemento</td><td>Difco 218105</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>42650</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>VIDAS UP Listeria (LPT) Caldo</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>410848</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Vários</td><td></td><td>Drummond DP-110 usado aqui</td></tr><tr><td>Incubadora agitada</td><td>Vários</td><td></td><td>Excella E25, New Brunswick Scientific usado aqui</td></tr><tr><td>Micropipeta&nbsp;</td><td>Vários</td><td></td><td>10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta</td><td>Várias</td><td></td><td>barreiras, 10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>1.5 tubos de microcentrífuga</td><td>Vários</td><td></td> sonicadores de sonda <td>livres de RNase e DNase</td></tr><tr><td></td><td>Q Sonica LLC</td><td>Série</td><td></td> XL-2000</tr><tr><td>&micro; PADs</td><td>Avant&nbsp;</td><td></td><td>Círculos de 7 mm de diâmetro impressos em cera, com linha de 4 pt de espessura. Entre em contato com o Dr. Charles Henry para obter informações adicionais</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-Hidroxietil)piperazina-N&prime; -2-ácido etanossulfônico]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Clorofenol vermelho-galactopiranosídeo (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-glucuronídeo (X-Gluc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-6-cloro-3 indolilcaprilato (magenta caprilato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-mio-inositol fosfato (X-InP)&nbsp;</td><td>Placas de Petri Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>, poliestireno 100 mm por 15 mm</td><td>Vários</td><td></td> scanners <td>de mesa plana estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Vários</td><td></td><td>scanners USB</td></tr><tr><td>Xerox Software ImageJ</td> National <td>Institutes of Health</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

papel colorimétrico à base de detecção de<em&gt; escherichia coli</em&gt;,<em&gt; salmonella</em&gt; spp. e<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; a partir de grandes volumes de água agrícola

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Este protocolo descreve a detecção colorimétrica rápida de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes, a partir de grandes volumes (10 L) de águas agrícolas. Aqui, a água é filtrada através de estéril modificação Moore Cotonetes (MMS), que consistem de um filtro de gaze simples fechado em um cartucho de plástico, para concentrar as bactérias. Após a filtração, enriquecimentos não selectivos ou selectivos para as bactérias alvo são realizadas no MMS. Para a detecção colorimétrica da bactéria alvo, os enriquecimentos são então ensaiadas usando os dispositivos de análise à base de papel (μPADs) incorporados com substratos bactérias indicativos. Cada substrato reage com enzimas bacterianas alvo indicativo, gerando produtos coloridos que podem ser detectados visualmente (detecção qualitativa) na μPAD. Alternativamente, as imagens digitais das μPADs reagiram podem ser gerados com a digitalização comum ou dispositivos fotográficos e analisados ​​usando o software ImageJ, almugido para interpretação mais objetiva e padronizada de resultados. Embora os procedimentos de rastreio bioquímicos são concebidos para identificar os agentes patogénicos bacterianos acima mencionados, em alguns casos, enzimas produzidas por bactérias do fundo ou a degradação dos substratos colorimétricos podem produzir um falso positivo. Portanto, é necessária a confirmação através de um diagnóstico mais discriminatória. No entanto, esta plataforma de concentração e detecção de bactérias é barato, sensível (0,1 CFU limite de detecção / ml), de fácil execução e rápida (concentração, enriquecimento e detecção são realizados dentro de aproximadamente 24 horas), justificando o seu uso como um método de triagem inicial para a qualidade microbiológica da água na agricultura.

Tal como descrito no presente protocolo, a concentração de bactérias que usam o MMS (Figura 1) pode ser realizada dentro de aproximadamente 15-20 min. Os MMS no construídos a partir de acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) em dois componentes separados; uma tampa e um cartucho de ambos com um espigão de montagem integrado no qual uma haste de gaze cilíndrica é inserida (Figura 1A). Os dois componentes são então aparafusado em conjunto, formando o MMS (Figura 1B). Proce...

Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui. A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola. Para isso, um cotonete modificado, denominado doravante MMS, é montado colocando-se um pedaço de gaze ou pano de queijo dobrado dentro de uma cassete MMS. Em seguida, no local de amostragem, as bactérias-alvo são concentradas passando-se grandes volumes de água através do MMS utilizando uma bomba peristáltica.As extremidades dos MMS são então fechadas hermeticamente e transportadas de volta ao laboratório. Um caldo de enriquecimento seletivo ou não seletivo é adicionado aos MMS, que são incubados por 18 a 24 horas. As culturas enriquecidas são então coletadas e, para a detecção de *E. coli*, são preparados lisados.Estes são adicionados a microplacas com microspots impregnados com substratos para detecção enzimática colorimétrica e incubados por até três horas. Em seguida, as microplacas são inspecionadas e escaneadas. Por fim, a análise visual e quantitativa dos microspots revela a presença de E. coli, espécies de Salmonella e L. monocytogenes em níveis tão baixos quanto 0,1 UFC por mililitro.A principal vantagem desta técnica em relação à filtração por membrana e ao cultivo em meios sólidos é que ela permite o processamento de volumes maiores de amostra de água. Isso aumenta a sensibilidade do ensaio e também reduz o tempo de enriquecimento. O tempo de detecção também é reduzido para menos de 24 horas, em comparação com 24 a 48 horas do método de filtração por membrana.Além disso, os microplacas podem ser usados para detectar simultaneamente três patógenos transmitidos por alimentos diferentes, o que não pode ser feito em meios bacterianos sólidos tradicionais. As implicações dessa técnica estendem-se à análise de água agrícola e também após eventos extremos, como incêndios florestais ou episódios de chuvas intensas, ambos capazes de provocar um aumento na contaminação microbiana da água superficial, utilizada na irrigação de culturas. Tivemos inicialmente essa ideia para este método quando precisávamos triar rapidamente grandes volumes de água quanto à presença de patógenos após os incêndios florestais no Colorado durante os verões de 2012 e 2013; o método precisava ser adaptável ao uso em campo devido às áreas remotas de amostragem, o que dificultava a coleta e o transporte de grandes volumes de água de volta ao laboratório para análises.Inicie este protocolo preparando um cotonete modificado de gaze ou MMS cortando uma seção retangular de gaze de quatro camadas medindo 40 por 12 centímetros. Dobre a gaze ao longo de ambas as extremidades para obter um retângulo de 20 por 6 centímetros. Em seguida, enrole firmemente a gaze ao longo de seu eixo mais longo para formar um cotonete cilíndrico com aproximadamente 6 centímetros de altura e 3 centímetros de diâmetro.Insira o swab no pacote de papel-alumínio e autóclave-o por 15 minutos, a 15 PSI, utilizando um ciclo seco. Após a autoclavação, o dispositivo está pronto para ser levado ao campo. Ao chegar ao local, conecte tubos de vinil às torneiras em ambos os lados do MMS, garantindo que os tubos aderem completamente às torneiras.Em seguida, fixe o tubo na bomba peristáltica. Certifique-se de que o tubo a montante da bomba peristáltica tenha comprimento suficiente para a amostragem e concentração das bactérias. Coloque a entrada da bomba peristáltica na água agrícola a ser amostrada.Execute a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 300 mililitros por minuto e colete pelo menos 10 litros. Após a conclusão da coleta, retire a entrada da bomba peristáltica da amostra de água e continue operando a bomba até que nenhuma água efluente seja observada. Saia do MMS quando a concentração tiver sido concluída.Para todos os swabs modificados MMS, remova cuidadosamente o tubo de vinil dos bicos do MMS e tampe os bicos em ambos os lados do MMS; armazene o MMS bem fechado por até 12 horas em temperatura de refrigeração antes da adição do meio de enriquecimento. Aqui, será demonstrado o enriquecimento de E. coli, espécies de Salmonella e L. monocytogenes. Um MMS é utilizado para cada enriquecimento seletivo.Desrosqueie a tampa do MMS e, para enriquecimento de e coli, adicione 20 mililitros de água peptídica tamponada estéril ou BPW suplementada com oito miligramas por litro de cloridrato de vancomicina. Rosqueie firmemente a tampa do MMS novamente.Para o enriquecimento de espécies de Salmonella, adicione 20 mililitros de BPW estéril suplementado com quatro mililitros por litro. Suplemento para Salmonella para enriquecimento de L. monocytogenes, adicione 20 mililitros de caldo estéril up list area. Incube o MMS por 18 a 24 horas em um incubador agitador a 150 RPM quando a incubação estiver concluída.Retire o MMS do incubador. Desparafuse a tampa. Despeje suavemente o meio em um tubo Falcon e, utilizando uma pipeta, transfira cuidadosamente 0,5 mililitros para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.Em preparação para a análise colorimétrica do enriquecimento seletivo de E. coli, ou para a análise dos enriquecimentos não seletivos, sonique 0,5 mililitros do enriquecimento a cinco watts e 22 quilohertz durante 20 segundos. Utilizando um homogeneizador de imersão, prepare soluções estoque dos substratos C-P-R-G-X glue, magenta cap relate e XINP em tampão heebies com pH ajustado. Proteja as soluções estoque da luz cinco promo seis.O CHLORO três no alelo, capite ou capite magenta é sensível à luz e pode potencialmente gerar resultados falso-positivos por meio de autodegradação. Para cada amostra e alvo testado, coloque uma microplaca dentro de uma placa de Petri estéril. Para detecção de E. coli, prepare microplacas de CPRG e xgl.Para a detecção de espécies de Salmonella, prepare microplacas com tampa magenta, e para a detecção de L. monocytogenes, prepare microplacas XINP. Usando uma pipeta, adicione 24 microlitros de cada solução estoque de substrato em cada microplaca. Em preparação para a detecção, adicione seis microlitros da amostra enriquecida a cada microplaca apropriada.Coloque a tampa de volta na placa de Petri e feche-a com filme parafilm. Incube a amostra com uma microplaca a 37 graus Celsius por até três horas para permitir o desenvolvimento da cor e a secagem das microgotas. Após a incubação, realize a detecção por simples inspeção visual das alterações de cor das microplacas.Observe que reações fortes que produzem mudanças de cor definitivas geralmente são esperadas após 18 a 24 horas de enriquecimento. Essas são consideradas positivas e não requerem esclarecimento adicional. Se E. coli estiver presente, microgotas contendo CPRG mudarão de amarelo para vermelho.Manchas violetas e microscópicas. Incrustadas com xlu, mudarão de incolor para verde-azulado, conforme mostrado aqui. Se L. monocytogenes estiver presente, microscópicas manchas incorporadas com XINP mudarão de incolor para índigo.Se espécies de salmonela estiverem presentes, microgotas contendo capito magenta ficarão roxas, partindo de uma coloração incolor. Em casos onde as reações forem positivas fraca, utilize um software para facilitar uma análise semi-quantitativa dos resultados. Para isso, deixe os microdiscos secarem completamente. Digitalize o microdisco usando um scanner de mesa.Utilize o software ImageJ para processar a imagem. Em seguida, no ImageJ, abra a imagem digitalizada a ser analisada. Para inverter a imagem, clique na guia Editar no menu principal e selecione inverter.Utilize a guia analisar no menu principal e selecione definir medições para escolher as medições relatadas a serem analisadas. Certifique-se de que as opções intensidade média de cinza, limite para limiarização e exibir caixas de rótulo estejam marcadas e pressione ok. Isso define como o software analisa cada área selecionada e como ela é relatada.Em seguida, utilizando a ferramenta oval, delimite a área a ser analisada na guia analisar e selecione medir. O software medirá a intensidade média de cinza dentro da área definida e a exibirá em uma tela pop-up que pode ser copiada e colada no Excel para análise adicional. Os ensaios em microplaca baseiam-se na detecção de enzimas indicadoras de bactérias, que reagem com substratos cromogênicos.Ensaios que detectam E. coli produzem um produto azul-esverdeado e um produto vermelho-violeta. Ensaios que detectam espécies de Salmonella e L. monocytogenes produzem cores púrpura-mov e índigo, respectivamente. Alternativamente, imagens digitalizadas podem ser manipuladas usando o software ImageJ para permitir uma interpretação de dados mais objetiva e padronizada.Aqui, são apresentadas imagens digitais de cor e métricas para cada ensaio, contendo testes negativos e positivos. Os testes negativos foram realizados com espécies bacterianas que não codificam as enzimas-alvo, e os testes positivos foram realizados com as bactérias-alvo. A primeira linha mostra imagens digitalizadas sem modificações; na segunda linha, as imagens são modificadas.As imagens digitalizadas foram convertidas para escala de cinza usando o software ImageJ. E na terceira linha, a cor foi invertida, para a interpretação subsequente da intensidade de cinza.A linha quatro mostra a intensidade média de cinza medida usando o ImageJ em cada micro ponto do micro suporte. Um exemplo de micro ponto é indicado pela seta e círculo amarelos. Este gráfico mostra as intensidades médias de cinza de quatro réplicas determinadas pelo ImageJ. Para cada cor, teste positivo e negativo com micro suporte I metric.Esses dados demonstram que a detecção ambígua dos três microrganismos-alvo concentrados a partir de grandes volumes de água agrícola pode ser realizada por meio deste procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um swab de Moore modificado. Concentrar microrganismos de interesse a partir de grandes volumes de água agrícola, bem como realizar detecção e análise enzimática colorimétrica em dispositivos analíticos baseados em papel.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de incluir um passo de sonicação para a detecção de e coli. Também é fundamental proteger o substrato magenta capite da luz tanto quanto possível. O fechamento e a montagem adequados do MMS antes da incubação são essenciais para que o procedimento seja concluído com desenvolvimento adicional.Essa técnica promete tornar-se muito útil como uma abordagem simples, econômica e rápida para diagnósticos na ponta de necessidade de patógenos microbianos e microrganismos indicadores, além das aplicações na segurança de alimentos. Essa técnica pode encontrar potencial aplicação em microbiologia ambiental e clínica. Não se esqueça de que trabalhar com microrganismos patogênicos pode ser extremamente perigoso, e por isso é importante evitar derramar os enriquecimentos bacterianos e também a formação de bioaerossóis.As precauções-padrão para o manuseio de microrganismos patogênicos devem sempre ser observadas ao realizar este procedimento.

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