Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo

As defesas inatas contra infecções virais são acionadas por receptores de reconhecimento de padrão ou PRRs, presentes em células do sistema imunológico inato durante uma infecção. Os PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam-se a RNAs com assinatura viral, alteram sua conformação e ativam sinalização antiviral. Para monitorar as mudanças conformacionais do RIG-I e do PKR e sua ligação a ligantes in vitro, células humanas A549 são infectadas com o vírus da febre do Rift Valley.

Clone 13 para estimular a ativação de PRR. Em seguida, são preparados lisados celulares de células controle e infectadas para análise de alterações conformacionais de rig olho e PKR. É realizada uma digestão limitada por tripsina.

Se ocorrerem mudanças conformacionais na estrutura da proteína, a proteína torna-se mais resistente à digestão e bandas serão visualizadas por meio de análise por Western blot para avaliar a formação de todas as proteínas nativas. É realizada eletroforese nativa seguida por análise por Western blot. Se toda a ligamentação tiver ocorrido, complexos de todas as formas nativas e PKR serão observados. A principal vantagem da digestão limitada por protease e da eletroforese nativa é que essas técnicas facilitam a medição direta da ativação de rega e PKR.

Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunidade inata, como qual é a natureza exata e a origem das espécies de RNA relevantes para a ativação de rig olho e PKR. Esses métodos podem fornecer informações sobre agonistas de rig olho e PKR. Eles também podem ser aplicados a outras proteínas sensoras citoplasmáticas, como MDA cinco, demonstrando que o procedimento será realizado por Mila Viva, estudante de doutorado do meu laboratório, antes do início deste procedimento.

Observe que o vírus da Febre do Vale de Rift, clone 13, referido doravante como CL 13, é um mutante viral atenuado, que na Alemanha deve ser manipulado em condições BSL dois para pré-aquecer o meio PBS sem soro e o meio de cultura celular contendo 5% de FCS. Coloque-os em banho-maria em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Prepare 1,25 vezes 10 à sétima PFU por mililitro do CL 13 em meio sem soro para infectar 2,5 vezes 10 à sexta.

Células A549 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de cinco, prepare aproximadamente 10% a mais do que o necessário para compensar erros de pipetagem. Remova as células A549 do incubador, aspire o meio e adicione 10 mililitros de PBS; gire ou incline o frasco de cultura para lavar as células e, em seguida, remova o PBS. Em seguida, adicione um mililitro do CL13 diluído ou, para o controle não infectado, a infecção simulada (mock infection).

Adicione um mililitro de meio sem soro e incube por uma hora a cada 15 minutos. Incline cuidadosamente o frasco para garantir uma distribuição uniforme do meio. Após uma hora de infecção, remova o inóculo.

Adicione cinco mililitros de meio de cultura celular pré-aquecido com 5% de FCS e incube por cinco horas. Prepare PBS com 0,5% de Triton X-100 e coloque a quatro graus Celsius. Não adicione inibidores de protease de Síria.

Em seguida, lave as células com PBS frio e adicione 10 mililitros de PBS fresco. Então, utilizando um espátula celular, desprenda as células do recipiente. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 800 ×g por cinco minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova o sobrenatante e re-suspenda o pellet celular em 30 microlitros de PBS com 0,5% de Triton X-100. Transfira o lisado para um tubo novo de 1,5 mililitro e incube por pelo menos 10 minutos no gelo. Centrifugue o lisado a 10.000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, transfira o lisado celular clarificado para um tubo novo. Realize um ensaio de Bradford para determinar a concentração proteica no lisado celular clarificado. Armazene a -20 graus Celsius ou prossiga imediatamente para tentar digestão ou eletroforese nativa em gel de poliacrilamida para ensaiar alterações conformacionais de receptores de reconhecimento de padrão. Primeiro, dilua a tripsina L1 estocada em cloro, metilcetona ou TPCK em PBS para uma concentração final de trabalho de dois microgramas por mililitro em dois tubos novos para cada condição. Ajuste a concentração final de proteína dos lisados proteicos de CL13 e controle não infectado para 25 microgramas em um volume final de nove microlitros com PBS. Um conjunto de lisados será usado como controle de entrada e o outro será tratado com tripsina TPCK. Adicione um microlitro de PBS aos dois tubos restantes.

Adicione um microlitro de tripsina TPCK a dois microgramas por microlitro para atingir uma concentração final de 0,2 micrograma por microlitro. Misture as reações por pipetagem. Incube os lisados a 37 graus Celsius por 25 minutos.

Interrompa a reação adicionando tampão amostral desnaturante cinco vezes e, em seguida, fervendo por cinco minutos a 95 graus Celsius. É importante não prolongar o tempo de incubação com tripsina. Observe que o tempo preciso da digestão com tripsina é crítico para a detecção de fragmentos resistentes sem qualquer fundo; se proteínas resistentes não forem detectadas ou se forem detectadas em excesso, ajuste a duração da digestão em conformidade.

Após fervura, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius ou carregue as amostras em dois géis de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida, compostos por um gel de empilhamento de 5% sobre um gel de resolução de 12%. Separe as proteínas a 25 miliampères por gel até que o azul de bromofenol saia.

Após a eletroforese em géis, transfira as proteínas de um gel para uma membrana de polivinilideno fluoreto e analise por meio de western blot com anticorpos direcionados contra rig olho e PKR; contraia o outro gel com azul brilhante de comassie G 250. Em seguida, armazene o gel em etanol 25%, ácido acético 8% e glicerol 4% a quatro graus Celsius ou prossiga para realizar a aquisição de imagem e análise. Para analisar os estados oligoméricos dos receptores de reconhecimento de padrão, prepare 50 microgramas de lisado celular em um volume final de 10 microlitros com PBS e adicione tampão amostral 5x até uma concentração final de 1x.

Carregue imediatamente as amostras em um gel nativo de poliacrilamida com uma etapa de empilhamento de 5% e uma etapa de separação de 8%. Qualquer atraso resultará na perda de complexos nativos. Execute o gel a 20 miliampères por gel a quatro graus Celsius.

Interrompa a eletroforese 45 minutos após a banda de azul de bromofenol ter saído do gel, após um total de aproximadamente 1,5 a duas horas, antes de realizar o Western blot usando anticorpos direcionados contra rig olho e PKR conforme descrito no documento anexo para ensaiar a comutação conformacional e o oligo induzido pelo reconhecimento de um agonista viral por rig olho ou PKR. A digestão com protease limitada e a eletroforese nativa foram realizadas conforme descrito neste vídeo. A digestão com tripsina de lisados de células mock infectadas resultou em degradação rápida de rig olho, enquanto a infecção pelo clone 13 levou à geração de um fragmento resistente de rig olho de 30 kilodaltons. A PKR também mostra resistência parcial à digestão com tripsina em amostras infectadas, o que coincide com sua fosforilação. Para monitorar a eficiência e especificidade da digestão com tripsina, os géis foram corados com azul brilhante de Kumasi G 250. As amostras não tratadas mostram quantidades iguais de proteínas carregadas. Submeter lisados de células mock e C13 à digestão com tripsina leva a uma diminuição comparável das quantidades globais de proteínas.

Isso demonstra que o tratamento com tripsina possui a mesma eficiência em amostras controle e infectadas com CL 13 em células não infectadas. Apenas monômeros de R EYE e PKR foram detectados como um controle adicional. O fator de transcrição IRF três foi incluído, o qual está presente como um monômero, mas é conhecido por dimerizar após ativação via R Eye.

A infecção pelo Clone 13 leva à forte acumulação de complexos oligoméricos de RIG-I na forma de uma mancha difusa e de dímeros ou oligômeros de PKR e IRF-3 como uma banda proteica definida. Esses resultados demonstram que os ensaios limitados de digestão e eletroforese nativa são ferramentas úteis para monitorar as alterações conformacionais e a formação de oligômeros de RIG-I e PKR após a infecção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar a mudança conformacional e a oligomerização de RIG-I e PKR após o domínio da técnica.

Essa técnica pode ser realizada em dois dias seguindo este procedimento. Como um método, ensaios pro podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se há uma interação estável com o ligante estimulador após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunidade inata explorarem o estado de ativação dos receptores de reconhecimento de padrão em células estimuladas por vírus.