Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo

As defesas inatas às infecções virais são desencadeadas por receptores de reconhecimento de padrões ou prrs. Presente nas células do sistema imunológico inato durante uma infecção. O olho de plataforma PRRS citoplasmático e o PKR se ligam aos RNAs de assinatura viral, alteram a confirmação de todos os olhos da liga e ativam a sinalização antiviral para monitorar as alterações de confirmação do olho do equipamento e PKR e todas as células de ligamentização in vitro humanas A 5 49 estão infectadas com o vírus da febre do Vale do Rift.

Clone 13 para estimular a ativação do PRR. Os lisados celulares de células de controle e infectadas são então preparados para analisar as alterações de confirmação do olho da sonda e da PKR. Uma digestão limitada é realizada.

Se ocorrerem alterações confirmacionais na estrutura da proteína, a proteína é mais resistente à digestão e as bandas serão vistas com Western blotting A análise para analisar a formação da página nativa de todos os gases é realizada seguida pela análise de western blotting. Se toda a ligamentização ocorreu mais alta, todos os complexos de olho de plataforma e PKR são vistos. A principal vantagem da digestão limitada da protease e da página nativa é que essas técnicas facilitam a medição direta da ativação de rega e PKR.

Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da imunidade inata, como qual é a natureza exata e a origem das espécies de RNA relevantes para a ativação do olho de plataforma e PKR. Esses métodos podem fornecer informações sobre os agonistas do olho da plataforma e da PKR. Eles também podem ser aplicados a outras proteínas do sensor citoplasmático, como MDA cinco, demonstrando que o procedimento será Mila Viva, uma estudante de doutorado do meu laboratório Antes de iniciar este procedimento.

Observe que o clone 13 do vírus da febre do Vale do Rift, doravante denominado CL 13, é um mutante de vírus atenuado, que na Alemanha deve ser manuseado sob BSL duas condições para pré-aquecer o meio livre de soro PBS e o meio de cultura de células contendo 5% FCS. Coloque-os em banho-maria em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Prepare 1,25 vezes 10 elevado ao sétimo PFU por mililitro de CL 13 em meio livre de soro para infectar 2,5 vezes 10 elevado ao sexto.

Um 5 49 células com uma multiplicidade de infecção ou MOI de cinco preparam cerca de 10% a mais do que o necessário para compensar os erros de pipetagem. Remova as células A 5 49 da incubadora, aspire o meio e adicione 10 mililitros de redemoinho PBS ou incline o frasco de cultura para lavar as células e, em seguida, remova o PBS. Em seguida, adicione um mililitro do CL 13 diluído ou para o controle não infectado ou infecção simulada.

Adicione um mililitro de meio livre de soro e incube por uma hora a cada 15 minutos. Inclinar cuidadosamente o balão para assegurar uma distribuição equitativa do meio. Após uma hora de infecção, remova o inocular.

Adicione cinco mililitros de meio de cultura de células pré-aquecido com 5% FCS e incube por cinco horas. Prepare PBS com 0,5% de tritton X 100 e coloque-o a quatro graus Celsius. Não adicione inibidores da protease síria.

Em seguida, lave as células com PBS frio e adicione 10 mililitros de PBS fresco. Em seguida, usando um raspador de células, retire as células do prato. Transferir a suspensão da célula para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 800 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 30 microlitros de PBS com 0,5% Triton X 100. Transfira o lisado para um novo tubo de 1,5 mililitro e incube por pelo menos 10 minutos no gelo. Centrifugar o lisado a 10 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, transferir o lisado de células clarificadas para um novo tubo. Realizar um ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteínas no lisado de células clarificadas Armazenar a menos 20 graus Celsius ou proceder imediatamente para tentar a digestão ou página nativa para testar as alterações de confirmação dos receptores de reconhecimento de padrões primeiro diluir L um tosto cloro, metil cetona tratada ou TPCK tripsina em PBS para uma concentração final de trabalho de dois microgramas por mililitro em dois novos tubos para cada condição, ajustar a concentração final de proteína do CL 13 e lisados de proteína de controle não infectados para 25 microgramas em um volume final de nove microlitros com PBS, um conjunto de lisados será usado como controle de entrada e o outro será tratado com tripsina TPCK para os tubos de controle não tratados. Adicione um microlitro de PBS aos dois tubos restantes.

Adicione um microlitro de dois microgramas por microlitro de tripsina TPCK para elevar a concentração final para 0,2 microgramas por microlitro. Misture as reações pipetando. Incube os lisados a 37 graus Celsius por 25 minutos.

Pare a reação adicionando cinco x tampão de amostra desnaturante e depois fervendo por cinco minutos a 95 graus Celsius. É importante não estender o tempo de incubação da tripsina. Observe que o tempo preciso da digestão da tripsina é crítico para a detecção de fragmentos resistentes sem qualquer fundo se proteínas resistentes não forem detectadas ou se muitas forem detectadas, ajustou a duração da digestão. Conformemente.

Após a fervura, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius ou carregue as amostras em dois sulfatos docal de sódio. Géis de poliacrilamida que consistem em um gel de empilhamento de 5% sobre um gel de resolução de 12%. Separe as proteínas a 25 miliamperes por gel até que o azul de bromo fenol acabe.

Depois de executar os géis, transfira as proteínas de um gel para uma membrana de fluoreto de polivideira e analise por western blotting com anticorpos direcionados contra o olho de plataforma e PKR core o outro gel com azul brilhante kumasi G dois 50. Em seguida, armazene o gel em etanol a 25%, ácido acético a 8% e glicerol a 4% a quatro graus Celsius ou prossiga para realizar imagens e análises. Para analisar os estados oligoméricos dos receptores de reconhecimento de padrões, prepare 50 microgramas de lisado celular em um volume final de 10 microlitros com PBS e adicione cinco x tampão de amostra a uma concentração final de um x.

Carregue imediatamente as amostras em um gel de poliacrilamida nativo com um gel de 5% de empilhamento e um gel de resolução de 8%. Qualquer atraso resultará na perda de complexos nativos. Execute o gel a 20 miliamperes por gel a quatro graus Celsius.

Pare a eletroforese 45 minutos após a banda azul de fenol Bromo ter deixado o gel após um total de aproximadamente 1,5 a duas horas por execução Western blotting usando anticorpos direcionados contra o olho da plataforma e PKR, conforme descrito no documento anexo, para ensaio para comutação confirmacional e oligo induzido pelo reconhecimento de um agonista viral por olho de plataforma ou PKR digestão limitada de protease e página nativa foram realizadas conforme descrito neste vídeo, A digestão de tripsina de lisados de células infectadas simuladas resultou em uma rápida degradação do olho de plataforma, enquanto a infecção do clone 13 levou à geração de um fragmento de olho de plataforma resistente de 30 kilodaltons. PKR também mostra resistência parcial à digestão de tripsinas em amostras infectadas, o que coincide com sua fosforilação para monitorar a eficiência e especificidade dos géis de digestão de tripsina foram corados com azul brilhante de kumasi G dois 50. Amostras não tratadas mostram quantidades iguais de proteínas carregadas, sujeitando lisados de células simuladas e C 13 à digestão de tripsina leva a uma diminuição comparável das quantidades globais de proteína.

Isso demonstra que o tratamento com tripsina tem a mesma eficiência para amostras simuladas e infectadas com CL 13 em células não infectadas. Apenas monômeros de R EYE e PKR foram detectados como controle adicional. O fator de transcrição IRF três foi incluído, que está presente como um monômero, mas conhecido por dimerizar após a ativação via R Eye.

A infecção pelo clone 13 leva a um forte acúmulo de complexos oligoméricos de olho de plataforma na forma de um esfregaço e de PKR e IRF três dímeros ou oligômeros como uma banda de proteína definida. Esses resultados demonstram que viagens limitadas na digestão e página nativa são ferramentas úteis para monitorar mudanças de confirmação e formação de oligo de olho de sonda e PKR após a infecção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar a comutação e a ização de confirmação WIC e PKR depois de dominado.

Esta técnica pode ser feita em dois dias após este procedimento. Como métodos, como ensaios profissionais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se há uma interação estável com o ligante estimulante após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunidade inata explorarem o status de ativação de receptores de reconhecimento de padrões em células estimuladas virais.