Name: Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a realizar gravações juxtacelulares em ratos alertos com restrição de cabeça para monitorar neurônios únicos em estruturas subcorticais. Este método permite isolar unidades de forma inequívoca e localizar anatomicamente os sítios de registro.

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Somos gratos aos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (concessão MT-5877), aos Institutos Nacionais de Saúde (concessões NS058668 e NS066664) e à Fundação Binacional EUA-Israel (concessão 2003222) por financiar esses estudos.

Protocolos experimentais foram realizados em ratos fêmeas Long Evans (250-350 g), em conformidade com as orientações de cuidados de animais e utilização federal prescritos e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Califórnia em San Diego. 1. Acclimating do Rato para o Corpo Restraint NOTA: Coloque o rato em uma dieta restrita. Alimente o rato uma vez por dia, imediatamente após cada sessão de manejo diário para aclimatar o rato para o sistema de retenção (descrito abaixo). Fornecer alimentação suficiente para manter o animal em 80% do seu peso inicial. Este montante é de aproximadamente 6 gramas de ração por dia para um 250 g feminino longo Evans rato. <ol><li> Aclimatar o rato a ser manuseados por humanos. Gentilmente conter o rato com a mão por períodos de cerca de 5 segundos a cada 30 seg. Faça isso por 15 min por dia em dois dias consecutivos. Monitorar os ratos diariamente para sinais de estresse durante o período de treinamento. Os sinais incluem lutando in resposta à contenção, vocalização e dente-vibração. </li><li> No dia 3 rd, colocar o rato em uma peúga pano de restrição do corpo (Figura 1), durante 15 minutos por dia em dois dias consecutivos. </li><li> No 5º dia, colocar o rato dentro da meia, e colocar a meia no interior de um tubo rígido no jig experimental (Figura 4). Deixe o rato no tubo durante 15 min por dia em dois dias consecutivos. </li><li> Alimente o rato imediatamente após cada sessão de treino. No final da última sessão (6 ° dia) dar acesso restrito ao alimento. Selecione para implantação apenas os ratos que não mostram sinais de estresse excessivo no último dia de treinamento. NOTA: Embora selecção de ratos para implantação é subjectiva, nas nossas mãos, mais de 90% dos ratos foram encontrados para ser responsivo a habituação e capaz de se submeter a implantação. </li></ol> 2. Implantação do Mecanismo de gravação Câmara e dos apoios de cabeça <ol><li> Adicione uma refio Conferência soldando fios de aço inoxidável nua para um conector de pino. Corte o fio de modo que 3-5 mm restos descobertos pelo pino. Autoclave o fio de referência, juntamente com todos os instrumentos cirúrgicos. </li><li> Administrar cetamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de cetamina misturados com 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente. A dose inicial dura 1½ a 2 horas. Suplemento da anestesia cada 30-45 min depois disso, quando necessário. Lubrificar os olhos do animal com uma pomada oftálmica. </li><li> Verifique o reflexo de retirada do dedo do pé para determinar o plano de anestesia, e manter a anestesia, se necessário. </li><li> Coloque o rato em uma armação de retenção estereotáxica com barras de ouvido (Figura 3A). Raspar o cabelo na cabeça e desinfectar o local do ferimento com iodopovidona (solução a 10%). Tome cuidado para inserir as barras de ouvido de forma apropriada para que eles não danificar o tímpano. Barras de ouvido com pontas contundentes são preferíveis. </li><li> Faça uma incisão com um bisturi aproximadamente ao longo da linha média do crânio a partir do nível rostro-caudal dos olhos para a parte de trás das orelhas. Utilize uma tesoura para cortar e remover uma tira de 2-3 mm de pele em ambos os lados da incisão. </li><li> Raspe o periósteo para expor a superfície do crânio até as nervuras laterais. Cubra o crânio exposto com fina camada de supercola. </li><li> Faça um furo pequeno, com um diâmetro ligeiramente menor do que 0-80 parafusos, usando uma broca burr ½ mm de diâmetro (ver secção de Materiais). Perfurar o furo imediatamente posterior ao bregma, onde a sutura se encontra com o cume lateral, e a um ângulo de 30-45 ° na cavidade craniana, de modo que o parafuso pode entrar com o topo mais lateral do que o fundo. </li><li> Parafuso em um parafuso 0-80 máquina de fundo plano para o buraco (aproximadamente 3 voltas), a 30-45 ° ângulo. Tenha cuidado para não enroscar muito profundamente para evitar danificar o tecido cerebral subjacente. </li><li> Repetir este procedimento para 6 parafusos adicionais na configuração mostrada <strong&gt; (Figura 3B). Aplicar supercola para a base de todos os parafusos. </li><li> Coloque uma agulha da seringa no manipulador stereotax. Medida a partir da sutura bregma, e fazer um dente no crânio com a agulha perto, mas fora do local de craniotomia desejado, como uma marca de referência. NOTA: Nesta demonstração, as coordenadas estereotáxica da marca são de 3 mm posterior e 1 mm de laterais à sutura bregma. </li><li> Marque o dente com um marcador permanente. Observe as coordenadas estereotáxica da marca, uma vez que irá servir como um ponto de referência estereotáxico (Figura 3B). </li><li> Adicione uma craniotomia centrada nas coordenadas desejadas (de 3 mm posterior e 3 mm lateral ao bregma, neste exemplo). Deixar a dura-máter intacta. Cobrir a craniotomia com fluido cerebrospinal artificial modificado (NaCl 125 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Corte um tubo de 0,2 ml de centrífuga de 4-5 mm de comprimento, e cortou a tampa. Colocar o tubo no crânio e centralizá-lo sobre a craniotomia. </li><li> Aplicar cimento dentário em torno da parte inferior do tubo, para vedar a base do tubo para o crânio. Tenha cuidado para não vazar cimento na craniotomia exposta (Figura 3D). </li><li> Perfurar um outro furo pequeno (cerca de ½ mm de diâmetro) na placa cranial contralateral e insira cuidadosamente o fio de referência. Construir o fio de soldar de referência por um pino que serve de interface com o amplificador de gravação para a extremidade do fio (ver secção Equipamento). Não mova o fio de referência, uma vez que está no cérebro, pois isso pode causar danos. </li><li> Aplicar supercola para o orifício em que o fio foi inserido. Isto irá selar o pino e fio no lugar temporariamente. </li><li> Misturar as duas partes do kit de gel de silicone (ver secção de Materiais) em porções aproximadamente iguais. Aguarde dois minutos para misturar e fill do tubo de centrifugação aproximadamente ⅓ completa com gel. </li><li> Anexar um direito braçadeira pós ângulo (ver secção de materiais) para a barra de apoio de cabeça. Fixar a placa de cabeça (Figura 2A) para a barra de retenção (Figura 2B) a um ângulo de 45 ° passo de modo que o fundo da placa está voltada para o nariz do animal. É útil utilizar um ângulo de inclinação para o ângulo de inclinação definido para coincidir com o dispositivo de montagem experimental (Figura 4). </li><li> Fixe o bar exploração para o braço stereotax manipulador para que a barra é paralela às barras de ouvido. Abaixe a barra e placa para que o prato é posterior da sutura lambda e anterior ao caudal-mais parafuso. </li><li> Segure a cabeça do parafuso da frente (8-32 um perno ou parafuso, consulte a secção de Materiais) a cerca de 45 ° de ângulo com um braço e mãos braçadeira de ajudar, de modo que a cabeça do parafuso está voltado para baixo e para a cauda do animal. Abaixe o parafuso para que ele toque a formigaerior 0-80 parafusos (Figura 3F, G). </li><li> Fixe o parafuso e placa no local com acrílico dental. Aplicar acrílico dental em torno das cabeças dos parafusos de osso, pinos de referência, e em torno dos lados do tubo de centrifugação. Espera aproximadamente 10 min para o acrílico dental para secar (Figura 3H). </li><li> Aplicar uma camada de cimento dentário em torno das bordas do acrílico dental, solidificando a pele para o implante. Aguarde até que o cimento secar. </li><li> Pique vários furos na tampa do tubo de centrifugação, e coloque a tampa sobre o tubo. </li><li> Retire a ajudar as mãos grampo. Em seguida, retire cuidadosamente o bar-segurando a cabeça do stereotax, e, em seguida, retire a placa de cabeça a partir da barra (Figura 3I). </li><li> Retirar o animal da stereotax e administrar cuidados pós-operatórios e controlo, em conformidade com todas as regras, regulamentos e leis aplicáveis ​​(por exemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, a cada 8-12 horas para um mínimo de 24h). Se a inflamação se desenvolve em torno das bordas do implante, aplica uma camada fina de pomada antibiótica ao local afectado diariamente até resolvido. </li></ol> 3. Monitoramento Juxtacellular de Unidades Neuronal <ol><li> Puxar quartzo tubo capilar sobre uma micropipeta laser de dióxido de carbono puxador (ver secção Equipment) com diâmetros de ponta inferior a 1 mm (Figura 5A). NOTA: os parâmetros de aquecimento irá variar de acordo com o instrumento em particular, e que o diâmetro do pescoço requerida irá variar dependendo da estrutura do cérebro de interesse. Para gravações em tálamo rato, micropipetas têm pescoços vão 5-7 mm. </li><li> Fixe a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), equipado com objetivos longa distância de trabalho. Use massa de modelar para segurar a pipeta no lugar no palco do microscópio. </li><li> Mover-se lentamente um bloco de vidro (0,5-1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para making facas ultra micrótomo é conveniente) para dentro do campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador fase, tocar suavemente a ponta da pipeta para o vidro, quebrá-la. Repita quantas vezes for necessário até que o diâmetro externo da ponteira é entre 1-3 mm (Figura 5B, C). Certifique-se de que estes micropipettes têm impedâncias entre aproximadamente 5-15 mohms. </li><li> Preparar solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 com NaOH) e adicionar 2 8% (w / v) de Chicago céu azul. Usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menor, preencher a extremidade traseira da pipeta com a solução. Alternativamente, para rotulagem juxtacellular célula única adicionar 2% (w / v) Neurobiotin ou amina dextrano biotinilado (BDA-3000 ou BDA-10000) para a solução salina em vez de Chicago céu azul. </li><li> Coloque o rato dentro da meia pano dentro do tubo rígido em um jig experimental adequado ( <strong&gt; Figura 4) .Wait um mínimo de 72 horas após a cirurgia, antes de colocar o animal no gabarito dos apoios de cabeça. Apertar o cordão em torno do esterno superior, ao invés do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parece ser trabalhado ou obstruída, solte o cordão ou movê-lo posteriormente. Realizar este procedimento enquanto o rato está alerta. </li><li> Fixar a placa de cabeça-de restrição sobre o rato para a peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro pino da placa dos apoios de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-o com um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal é calma, a fim de evitar a aplicação de força excessiva na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que é implantado no rato. Então parafuso em uma haste de aço inoxidável com rosca para a cabeça do parafuso. Apor a haste para o dispositivo de montagem experimental, de tal forma que ele pode ser apertado no lugar (Figura 4). NOTA: Protegendo o animal com a cabeça do parafuso, bem como o dos apoios de cabeça placa minimizes flexão do aparelho de gravação e melhora a estabilidade. Na maioria dos casos a gravação poderá ser iniciada no primeiro dia o animal está contido-cabeça. No entanto, se o animal fidgets excessivamente ou vocaliza, proporcionar um dia de treinamento de habituação dos apoios de cabeça antes de começar qualquer gravação. Neste caso, deixe o animal no gabarito durante 15 minutos e, em seguida, colocá-lo de volta em sua gaiola. Repita este passo o dia seguinte e continuar com o protocolo. </li><li> Abra a câmara de gravação e retire o gel de silicone. Limpe a craniotomia usando uma pinça fina se o tecido tem re-cultivadas na craniotomia. </li><li> Fixe a pipeta para o micromanipulator motorizado, e conecte o headstage pré-amplificador. NOTA: No presente demonstração, um pequeno circuito de relé da headstage é usado para alternar entre os fios amplificador de chumbo e uma fonte de corrente externa com alta conformidade (Figura 6A-C). Note que alguns amplificadores têm um adequado built-in fonte cumprimento alta(Ver secções de discussão e de Materiais). </li><li> Usar o micromanipulador motorizado para deslocar a ponta da pipeta para a marca estereotáxicamente identificado na câmara de gravação. Observe as coordenadas desse local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio. </li><li> Mova a pipeta para o local de gravação desejado nos eixos ântero-posterior e médio-lateral. Em seguida, avançar o ventralmente pipeta através da dura até que ele é de aproximadamente 500 mm dorsal para o local de gravação pretendida. </li><li> Avance lentamente a pipeta enquanto escuta para spiking eventos em um monitor de áudio da tensão amplificada gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez que eventos spiking são identificados, continuam a mover-se a pipeta de 0-100 mm até desvios positivos de tensão vai superiores a cerca de 500 mV são observados. NOTA: A resistência do eletrodo vai aumentar em um fator de aproximadamente 1,5-10 when esta ocorre. </li><li> Começar a gravar uma vez por unidade foi isolado como segundo passo 3.11, junto com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. No presente demonstração, movimentos Vibrissa auto-geradas são monitorados com videografia de alta velocidade (ver secção de Materiais). </li><li> Para marcar o local de gravação, mude o eletrodo leva para se conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relê (Figura 6A - C), um built-in fonte de corrente no amplificador, ou manualmente (Figura 6D, veja o passo 3.8 e Discussão). Passe -4 mA com 2 pulsos seg a 50% ciclo de trabalho para 4 min para injetar iontoforéticamente Chicago céu azul através da pipeta. </li><li> Matar e aspergir o animal depois de vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática habitual. Seção do cérebro e counterstain como necessários para identificar a localização anatômica da gravação sentare. Contracorante o tecido para o citocromo-oxidase reatividade como por 14. Alternativamente, identificar os depósitos Chicago Sky azuis usando microscopia de fluorescência. NOTA: Para diferenciar com precisão entre as diferentes unidades etiquetadas, é importante que todos os rótulos são feitos com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desclampeamento a pipeta entre as etiquetas. Neste caso, locais de gravação podem ser diferenciados por suas localizações relativas em histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador notáveis ​​de cada local (veja o passo 3.9). Para a identificação inequívoca, marcar os rótulos, pelo menos, 200 mm separados um do outro, e não mais de 3-5 etiquetas por região do cérebro. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A construção do gabarito experimental A descrição dos componentes mecânicos utilizados para construir o dispositivo de montagem experimental (Figura 4) é omitida a partir do protocolo, uma vez que pode ser construído numa variedade de maneiras. Neste padrão demonstração opto-mecânico peças e braçadeiras de apoio são usados ​​para montar o bar apoio de cabeça e do tubo de retenção corporal (ver secção de Materiais). Partes opto-...

Monitorando a atividade neuronal em um animal alerta ativamente engajados em uma tarefa comportamental é fundamental para a compreensão da função e organização do sistema nervoso. Gravação extracelular da atividade elétrica das unidades neuronais individuais tem sido um instrumento básico da neurociência sistemas e ainda é amplamente em uso no momento. Uma variedade de tipos de eletrodos e configurações estão disponíveis, dependendo das exigências científicas e técnicas de uma experiência particular. Cronicamente implantado microdrives ou conjuntos de eléctrodos são frequentemente utilizados em animais que se deslocam livremente, incluindo aves, roedores e primatas não-humanos 1-4. Alternativamente, penetrações agudos com metal ou vidro microeletrodos através de um micromanipulator externa são frequentemente usados ​​para gravar a partir de animais anestesiados ou restringido-cabeça. Eléctrodos de micropipeta de vidro tem a vantagem de que eles podem ser usados ​​na juxtacellular ou &quot;célula ligada&quot; configuração de isolar de forma inequívoca oatividade de neurônios individuais sem as complicações de pico post-hoc de classificação 5. Estes eléctrodos permitem gravar mais a partir de células ou locais identificados-anatomicamente, como elas podem ser usadas para injectar pequenos depósitos de corantes ou marcadores neuroanatómicos, ou ainda para preencher o indivíduo gravado célula. Esta configuração tem sido aplicado com sucesso em ratos, murganhos e aves 6-10. A técnica descrita atualmente se concentra em monitoramento juxtacellular e depósitos do corante extracelulares em alerta, ratos conteve-cabeça. Note-se que ao contrário única célula juxtacellular enche, esses depósitos de corante não fornecem informações sobre a morfologia celular ou projeções axonais 11, mas permitir a localização anatômica exata para cerca de 50 mm e, criticamente, têm um rendimento significativamente maior nos animais de alerta. Informações sobre unicelular juxtacellular enche não deixa de ser fornecido como uma estratégia alternativa para a rotulagem anatômica. Em breve, oprotocolo consiste em três grandes fases. Na primeira fase, o rato é aclimatados ao corpo de retenção de uma peúga pano (Figura 1) ao longo de um período de 6 dias. Na segunda fase, um aparelho de apoio de cabeça (Figura 2) e câmara de gravação são cirurgicamente implantado de modo a que o rato pode ser mantido no plano estereotáxica durante várias sessões de gravação subseqüentes (Figura 3); este procedimento permite que o experimentador para segmentar regiões sub-corticais específicas do cérebro para o estudo eletrofisiológico com base no padrão de referência de coordenadas 12. A terceira fase consiste em colocar o rato num gabarito adequado para a realização de experiências comportamentais e electrofisiológicos (Figura 4), ​​a construção do eléctrodo a partir de um tubo capilar de quartzo (Figura 5), fazer gravações neuronais juxtacellular inequivocamente que isolam as unidades individuais de 6-9, e marcando os locati anatômicasno do local de gravação com Chicago Sky azul corante (figuras 6 e 7). As gravações são realizadas com acompanhamento comportamental simultânea; no entanto, os detalhes técnicos do comportamento dependerá dos objetivos científicos de cada experiência e são, portanto, fora do âmbito de um protocolo único. Após a conclusão do procedimento experimental, o que pode ser repetido em vários dias, o animal é sacrificado. O cérebro é extraído e processado de acordo com as técnicas neuroanatomical padrão usando qualquer campo claro ou microscopia de fluorescência.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Cetamina HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (solução de xilazina)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidona-Iodo)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cianoacrilato</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Cimento de aderência pó</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Para a base da câmara de registro</td></tr><tr><td>Grip cimento líquido</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>Para a base da câmara de registro</td></tr><tr><td>Gel de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet dentture repair acrylic powder</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Para fixar o aparelho de encosto de cabeça ao crânio</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Líquido de resina acrílica ortodôntica de cura rápida</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Para fixar o aparelho de encosto de cabeça ao crânio</td></tr><tr><td>Chicago azul celeste</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Para perfusão e fixação tecidual</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Para perfusão e fixação tecidual</td></tr><tr><td>Citocromo C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Para coloração de citocromo-oxidase, <forte>Figura 7< / forte ></td></tr> <tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Para coloração de citocromo-oxidase, <forte > Figura 7< / forte ></td></tr> <tr><td>meia de rato</td><td>Costurar elegante (San Diego, CA)</td> <td>N / A</td><td>Feito sob medida, <forte > Figuras 1, 4 < / forte ></td></tr> <tr><td>tubo de PVC 2 e frac12; "</td><td>Fornecedor:U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>Figura 4</td></tr><tr><td>Subminiatura D pinos e soquetes</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Fio de música de aço inoxidável 0,010" de diâmetro</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Quadro de fixação estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Barras auriculares estereotáxicas</td><td>Kopf</td><td>Instruments Modelo 957</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Manipulador estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 960</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>&frac12; broca de broca Henry</td><td>Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Broca dental Quiet-Air</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Aço inoxidável 0-80 &frac18; &rdquo; parafuso</td><td>Fixador superstore</td><td>247438</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>0,2 ml tubo de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Barra de fixação de cabeça personalizada</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Feito-à-medida, Figuras 2 - 4</td></tr><tr><td>Custom head-holding plate</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, <forte>Figuras 2 - 4</forte></td></tr><tr><td>Ângulo reto pós-grampo</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>Figuras 3, 4; peças optomecânicas padrão para o gabarito experimental (Figure 4) também são da Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &frac34; &rdquo; parafuso</td><td>Fixador Superstore</td><td>240181</td><td>Para encosto de cabeça, Figura 3</td></tr><tr><td>4-40 &frac14; &rdquo; parafuso</td><td>Fixador Superstore</td><td>239958</td><td>Para encosto de cabeça, <forte>Figuras 3, 4</forte></td></tr><tr><td>Tubo capilar de quartzo</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>Figura 5</td></tr><tr><td>Extrator a laser de dióxido de carbono</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de microeletrodo</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Cabeça do amplificador de microeletrodo estágio</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 com Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso isolado</td><td>A-M Systems</td><td>Modelo 2100</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 com Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Monitor de áudio</td>Suporte de pipeta <td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Peças alternativas: veja Discussão, Figura 6A</td></tr><tr><td>Fio de chumbo de eletrodo</td><td>Fio Cooner</td><td>NEF34-1646</td><td>(opcional), Figura 6D</td></tr><tr><td>Relé para amplificador head-stage</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(opcional) Usado com uma placa de circuito impresso feita sob medida (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td></tr><tr><td>Câmera de vídeo digital</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(opcional) Para monitoramento comportamental, Figure 7</td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento juxtacellular e localização de solteiro neurônios dentro estruturas cerebrais sub-corticais de alerta, conteve-cabeça rats

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Há uma variedade de técnicas para monitorar a atividade extracelular de unidades neuronais únicas. No entanto, monitorar essa atividade de estruturas cerebrais profundas em animais que se comportam continua sendo um desafio técnico, especialmente se as estruturas devem ser direcionadas estereotaxicamente. Este protocolo descreve técnicas cirúrgicas e eletrofisiológicas convenientes que mantêm a cabeça do animal no plano estereotáxico e isolam inequivocamente a atividade de pico de neurônios individuais. O protocolo combina contenção de cabeça de roedores alertas, monitoramento justacelular com eletrodos de micropipeta e injeção de corante iontoforético para identificar a localização do neurônio na histologia post-hoc. Embora cada uma dessas técnicas esteja bem estabelecida, o protocolo se concentra nas especificidades de seu uso combinado em um único experimento. Essas técnicas neurofisiológicas e neuroanatômicas são combinadas com monitoramento comportamental. No presente exemplo, as técnicas combinadas são usadas para determinar como os movimentos da vibrissa autogerados são codificados na atividade dos neurônios dentro do tálamo somatossensorial. De forma mais geral, é simples adaptar este protocolo para monitorar a atividade neuronal em conjunto com uma variedade de tarefas comportamentais em ratos, camundongos e outros animais. Criticamente, a combinação desses métodos permite que o experimentador relacione diretamente os sinais neurofisiológicos anatomicamente identificados ao comportamento.

<html> Unidades neuronais em ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar a fase de circulação vibrissa durante o auto-gerado mexendo 15,16. Figura 7A mostra a atividade spiking amostra de uma unidade thalamic VPM como um rato está mexendo ativamente. Figura 7B mostra um histograma de spike vezes alinhado à fase instantânea de vibrissa movimento 17. Há mais pontos durante a fase de retração de bater. Depois da gravação, o local da unidade foi marcado através de i...

Este protocolo descreve o projeto e a implantação cirúrgica de um mecanismo de restrição da cabeça para monitorar a atividade neuronal em estruturas cerebrais subcorticais em ratos alertas. Ele delineia procedimentos para isolar neurônios individuais na configuração justacelular e identificar com eficiência suas localizações anatômicas.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar e localizar a atividade de neurônios individuais dentro das estruturas cerebrais subcorticais de ratos acordados com a cabeça imobilizada. Isso é realizado primeiramente habituando o rato à restrição corporal em uma meia de tecido. O segundo passo consiste em implantar cirurgicamente um dispositivo de fixação da cabeça e uma câmara de registro, de modo que o animal possa ser mantido no plano estereotáxico durante múltiplas sessões subsequentes de gravação.Em seguida, o rato é colocado em um suporte apropriado para a realização dos experimentos comportamentais e eletrofisiológicos, e são realizadas gravações neuronais justacelulares. Esse processo permite o isolamento inequívoco de unidades individuais. O passo final consiste em marcar a localização anatômica do local de gravação com o corante Chicago Sky Blue, para que possa ser visualizado na histologia pós-hoc.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos comumente utilizados, como o registro extracelular com microeletrodos metálicos, é que os potenciais de ação de unidades individuais podem ser isolados de forma inequívoca e o local de registro pode ser revelado por meio de histologia pós-hoc. Para iniciar este procedimento, anestesie o animal com uma injeção de cetamina e xilazina. Verifique o reflexo de retirada do dedo do pé para determinar o nível de anestesia e mantenha a anestesia mediante administração adicional de anestésico.Se necessário, rape a cabeça e desinfete o local cirúrgico com iodopovidona. Em seguida, posicione a rata em um estereotáxico e fixe sua cabeça com barras auriculares. Faça uma incisão com um bisturi ao longo da linha média do crânio, do ponto médio entre os olhos até a parte posterior das orelhas.Em seguida, remova uma faixa de pele de dois a três milímetros em ambos os lados da incisão. Remova o periósteo para expor o crânio até as cristas laterais. Posteriormente, cubra o crânio exposto com uma fina camada de cola instantânea.A seguir, faça um pequeno orifício imediatamente posterior ao ponto onde a sutura bgma encontra a crista lateral, num ângulo de 30 a 45 graus em direção ao crânio. Em seguida, parafuse uma máquina com base plana zero 80 no orifício, num ângulo de 30 a 45 graus, tomando cuidado para não parafusar muito profundamente, a fim de evitar danos ao tecido cerebral subjacente.Repita este procedimento para mais seis parafusos nesta configuração. Em seguida, aplique cola instantânea na base de todos os parafusos. Agora, coloque a agulha da seringa no manipulador estereotáxico.Faça uma pequena reentrância no crânio com a agulha para marcar uma localização de referência apropriada. Em seguida, marque a reentrância com uma caneta permanente. Posteriormente, realize uma craniotomia centrada na coordenada desejada e mantenha a dura-máter intacta.Cubra a craniotomia com fluido espinhal cerebral artificial modificado. Em seguida, corte um tubo de centrífuga de 0,2 mililitros em um comprimento de quatro a cinco milímetros e remova a tampa. Coloque o tubo sobre o crânio e posicione-o centralizado sobre a craniotomia.Em seguida, aplique cimento dental ao redor da base do tubo para selar a sua base ao crânio. Tenha cuidado para não derramar cimento na craniotomia exposta. Agora, faça outro pequeno orifício na placa craniana contralateral.Insira cuidadosamente o fio de referência que foi soldado a um conector de pino. Em seguida, aplique cola super resistente no orifício onde o fio foi inserido para manter o pino e o fio no lugar. Depois, misture as duas partes do kit de gel de silicone em proporções iguais.Aguarde dois minutos e preencha o tubo de centrífuga com o gel. Quando estiver aproximadamente um terço cheio, fixe a placa da cabeça à barra de contenção da cabeça. Neste caso, a barra foi fixada a um suporte de poste em ângulo reto com um ângulo de inclinação de 45 graus.Posteriormente, fixe a barra de sustentação ao braço do manipulador estereotáxico utilizando o grampo de suporte, de modo que a barra fique paralela às barras auriculares; abaixe a barra e a placa para que a placa fique posterior à sutura lambda e anterior ao parafuso coddle mos. Em seguida, segure o parafuso frontal da cabeça em um ângulo aproximado de 45 graus com um grampo, de forma que a cabeça do parafuso fique voltada para baixo e em direção à cauda do animal. Depois disso, abaixe o parafuso até que toque o crânio.Em seguida, fixe o parafuso e a placa no lugar com acrílico dentário. Aplique uma camada de cimento dentário ao redor das bordas do acrílico dentário para cimentar a pele ao implante. Após a secagem do cimento, faça vários furos na tampa do tubo de centrífuga e coloque a tampa no tubo.Agora remova o grampo. Remova cuidadosamente a barra de fixação da cabeça do estereotáxico. Em seguida, remova a placa craniana da barra.No final, remova o animal dos ataques estéreo e administre cuidados e monitoramento pós-operatórios. Neste procedimento, use uma pipeta polo com tubo capilar de quartzo em um microscópio de pipeta a laser de dióxido de carbono. Em seguida, fixe a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial equipado com uma objetiva de longa distância de trabalho.Mova lentamente um bloco de vidro para o campo de visão com a ponta de uma pipeta. Usando o micromanipulador da platina, quebre a ponta da pipeta tocando-a suavemente no vidro. Repita o procedimento até a ponta da pipeta.O diâmetro externo está entre um e três micrômetros. Em seguida, prepare o salino extracelular e adicione 2% de Chicago sky blue. Usando uma seringa com agulha de 30 graus, encha a extremidade traseira da pipeta com uma solução.Em seguida, coloque a rata na meia de tecido e transfira a meia de tecido para um tubo rígido em um suporte experimental apropriado. Fixe a placa de contenção da cabeça da rata à peça correspondente no suporte. Em seguida, coloque uma porca 8 32 no parafuso de contenção da cabeça que está implantado na rata.Posteriormente, parafuse uma haste roscada de aço inoxidável no parafuso da cabeça. Em seguida, abra a câmara de gravação e remova o gel de silicone. Limpe a craniotomia utilizando pinça fina.Se o tecido tiver regenerado na craniotomia, utilize anestesia com isoflurano durante este processo, se necessário. Em seguida, fixe a pipeta ao micromanipulador motorizado. Mova a pipeta para o local desejado de gravação nos eixos anterior, posterior e medial lateral.Em seguida, avance o pipeta ventralmente através da dura até que esteja aproximadamente 500 micrômetros a dorsal do local pretendido para gravação. Avance lentamente a pipeta enquanto escuta eventos de disparo em um monitor de áudio da tensão amplificada registrada. Uma vez identificados os eventos de disparo, continue movendo a pipeta cerca de zero a 100 micrômetros até que as deflexões de tensão positivas sejam maiores que aproximadamente 500 microvolts.Para marcar o local da gravação, ajuste a fonte de corrente para menos quatro microampères com pulsos de dois segundos a 50% do ciclo de trabalho e aplique a corrente por quatro minutos para iontoforese, injetando Chicago sky blue através da pipeta. Após o experimento, realize a perfusão do animal conforme a prática padrão. Em seguida, seccione o cérebro e contra-estaine conforme necessário para identificar a localização anatômica do local de gravação mostrado.Aqui está a atividade de disparo de uma unidade talâmica VPM enquanto um rato está movimentando ativamente os vibrissas. Aqui está um histograma dos tempos de disparo alinhados à fase instantânea do movimento de vibração. Há mais disparos durante a fase de retração do movimento dos vibrissas.Após a gravação, a localização desta unidade foi marcada por afórese do corante Chicago sky blue. Como mostrado aqui, o tecido foi contra-colorido para atividade de citocromo oxidase, a fim de revelar os limites neuroanatômicos do tálamo VPM. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar técnicas cirúrgicas e eletrofisiológicas que mantêm a cabeça do animal no plano estereotáxico e que isolam de maneira inequívoca a atividade de disparo de neurônios individuais.

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

Gravações extracelular da atividade neuronal utilizando sondas de silício no rato anestesiado serão descritas. Esta técnica permite obter informação através de múltiplas áreas do cérebro de mais de 100 neurônios simultaneamente. Ele fornece informações com resolução única célula neuronal sobre a dinâmica conjuntos em vários circuitos locais.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Este vídeo demonstra o procedimento detalhado para preparar um rato anestesiado para registros eletrofisiológicos da atividade cerebral de vários locais. O couro cabeludo é dissecado para acessar o crânio e os orifícios são feitos em locais precisos para instalar e prender os eletrodos. Os eletrodos de microfios de tungstênio são então inseridos no local de destino para registrar os dados.

Registros eletrofisiológicos in vivo de atividades cerebrais de vários locais em ratos

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoramento justacelular e localização de neurônios únicos dentro de estruturas cerebrais subcorticais de ratos alertas e com a cabeça restrita. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o método de gravação e coloração justacelular em um rato contido e acordado. O procedimento envolve o registro de sinais de neurônios e a injeção de corante para localizar com precisão o local de gravação. Essa técnica permite o mapeamento preciso da atividade neural para a estrutura...

Gravação e coloração justacelular para mapeamento preciso da atividade neural em um rato acordado 

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais...

Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.

Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Aprenda a realizar gravações juxtacelulares em ratos alertos com restrição de cabeça para monitorar neurônios únicos em estruturas subcorticais. Este método permite isolar unidades de forma inequívoca e localizar anatomicamente os sítios de registro.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats (Vídeo) | JoVE Journal

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

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