Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a novidade de uma plataforma de alongamento isotrópico que pode ser usada para investigar as respostas de uma única célula à deformação mecânica complexa e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos. Isso é feito primeiro fabricando a membrana flexível e montando essa membrana em um conjunto de grampos. O segundo passo é cultivar C duas células C 12 na membrana durante a noite e, no dia seguinte, montar os grampos na plataforma de alongamento.

Em seguida, em um segundo conjunto de experimentos, os tecidos da aorta torácica são rejeitados de um modelo de camundongo e limpos de quaisquer tecidos conjuntivos. Em seguida, o tecido aórtico é montado na plataforma de alongamento usando um conjunto diferente de grampos. Em última análise, a plataforma de alongamento é usada para induzir uma deformação nas células ao longo de duas direções ortogonais que podem ser quantificadas usando um microscópio invertido.

Ou, alternativamente, um transdutor de força é integrado ao dispositivo de alongamento para medir a rigidez do tecido. A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como o alongamento de células uni ou biaxiais, é que ela nos permite controlar independentemente a deformação em duas direções ortogonais em uma membrana transparente na qual as células estão presas e, portanto, permitindo imagens de células vivas. A microscopia também é um design cuidadoso de um conjunto diferente de grampos.

Com a integração de um usuário de quatro cordas na plataforma, nos permite realizar testes de 10 células em tecido biológico para a quantificação de suas propriedades mecânicas. Este vídeo apresenta a plataforma de Alongamento Biaxial, um aparelho personalizado que pode ser usado para investigar o efeito da deformação do substrato no nível celular e realizar testes de tração em tecidos biológicos. O design e as características da plataforma de alongamento biaxial são detalhados no manuscrito anexo para investigar o efeito da deformação mecânica de células individuais, um substrato flexível e transparente no qual as células podem aderir deve primeiro ser fabricado.

Para iniciar este procedimento, pipete 500 microlitros de uma solução de microesfera fluorescente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a 16.200 Gs Por 10 minutos, descarte o supernat e adicione 500 microlitros de isopropanol, seguido de cinco minutos de vórtice. Coloque o frasco de lado durante a noite no escuro para permitir que quaisquer agregados de partículas grandes sedimentem na manhã seguinte, transfira cuidadosamente o SNAT para um frasco de microcentrífuga limpo. Esta solução de esferas pode ser usada para fabricar mais de cinco substratos porque a solução de contas continuará a sedimentar pelos próximos três dias.

É importante evitar que o Resus suspenda o pellet. Despeje 0,5 gramas do agente de cura fornecido com o kit PDMS em um frasco de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 15 microlitros de esferas fluorescentes e vortex por um minuto.

Repita isso mais cinco vezes para adicionar um total de 90 microlitros de contas Reserve. Pese 10 gramas de PDMS, adicione 0,5 gramas do agente de cura, complementado com esferas fluorescentes e misture por pelo menos 12 minutos. Em seguida, use a pipeta de transferência para transferir quatro miligramas do PDMS com grânulos para um molde em forma de cruz SUH 2050 previamente fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão.

O molde tem uma altura de 320 micrômetros e uma área de 13,4 centímetros quadrados e pode conter 428 microlitros ou 440 miligramas de PDMS curar o PDMS por duas horas a 80 graus Celsius. Após a cura do substrato do molde, o substrato pode ser mantido em uma placa de Petri em temperatura ambiente por duas semanas sem apresentar alterações significativas e suas propriedades mecânicas. Despeje gotas de PDMS em uma placa de Petri com um tamanho final de aproximadamente quatro milímetros de diâmetro, cure-as de cabeça para baixo por duas horas a 80 graus Celsius, a placa deve ser mantida de cabeça para baixo para evitar que as gotas se achatem durante o processo de cura.

Esses recursos de ancoragem podem ser mantidos em uma placa de Petri por semanas. O plasma de ar trata o substrato e oito características de ancoragem, liga as características em cada extremidade do substrato a uma distância de quatro milímetros do recuo em forma de quadrado presente no substrato para montar a membrana nas braçadeiras. Enrole cada extremidade do substrato ao redor da parte cilíndrica da ranhura dos grampos e prenda-o no lugar com os dois parafusos de fixação na parte superior.

Aparafuse os quatro grampos no suporte do grampo. Em seguida, despeje o PDMS na interface entre o substrato e a parte ranhurada dos grampos. Espalhe o PDMS não curado ao redor da parte cilíndrica ranhurada usando uma chave sextavada de 1,5 milímetro.

Despeje o PDMS nas ranhuras até preencher completamente por ação capilar e catalise o conjunto a 80 graus Celsius por duas horas antes de semear as células na membrana. Plasma de ar. Trate todo o conjunto para esterilizar e funcionalizar o substrato para permitir o revestimento de colágeno.

Funcionalizar a área do substrato onde as células serão semeadas com um mililitro de ácido acético molar 0,02 suplementado com 16 microgramas por mililitro de colágeno de cauda de rato em temperatura ambiente por uma hora. A densidade final de colágeno desejada é de cinco microgramas por centímetro quadrado Após uma hora, enxágue o substrato três vezes com tampão fosfato e deixe secar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Adicione 40 microlitros de meio de cultura, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina.

Estreptomicina contendo 2000 células na porção central do substrato para cobrir uma área de um centímetro quadrado. Neste exemplo, a densidade celular é de 20 células por centímetro quadrado. No entanto, a densidade celular pode ser alterada de acordo com os requisitos experimentais.

Coloque todo o conjunto em uma incubadora de cultura de células padrão com o substrato voltado para cima com a gota de meio de cultura contendo células. O conjunto deve ser mantido com o substrato voltado para cima por pelo menos três horas para permitir que as células se prendam firmemente a ele para evitar a evaporação. 30 microlitros de meio de cultura quente são adicionados à gota no substrato.

A cada 45 minutos após três horas, vire todo o conjunto em uma placa de Petri cheia de meio de cultura fresco para submergir o substrato e incubar durante a noite para permitir que as células proliferem no dia seguinte. Monte a configuração em um microscópio de contraste de fase invertida ou fluorescente. Monte o conjunto do substrato de fixação na plataforma de alongamento biaxial e os motores enchem a placa de Petri dentro do aquecedor da placa de Petri com uma solução salina tamponada HEPs recém-preparada.

Esta solução fisiológica é usada para manter as células no estágio do microscópio, imitando o ambiente sanguíneo normal do tecido. A mesma plataforma de alongamento biaxial também pode ser usada para quantificar a rigidez de pequenas amostras de tecido. Aortas isoladas de camundongos serão usadas nesta demonstração.

Remova o diafragma, a caixa torácica e os lobos pulmonares do camundongo sacrificado para minimizar o risco de danificar o tecido. Mantenha o coração ligado à aorta e evite tocar o vaso diretamente, mas manipulado. Usando o coração.

Remova o coração, a raiz da aorta e a aorta torácica cortando suavemente entre o vaso e a coluna para manter intacta a estrutura interna do tecido. Tenha cuidado para não induzir nenhum alongamento no vaso durante a incisão. Mergulhe imediatamente e mantenha o coração e a aorta em solução de Krebs, que é preparada diariamente e mantida a 37 graus Celsius durante os experimentos.

Corte e lave cuidadosamente a aorta em solução de Krebs para remover quaisquer coágulos sanguíneos que trabalhem sob um microscópio cirúrgico de dissecação. Remova o tecido conjuntivo usando uma microtesoura e uma pinça. É importante manter todo o comprimento do vaso e usar a raiz da aorta para determinar a orientação do vaso.

As dimensões da embarcação descarregada são necessárias para determinar a rigidez da embarcação. Corte um anel aórtico de cerca de dois milímetros de comprimento e meça com precisão seu comprimento usando uma configuração de microscópio calibrada. Deixe esse segmento de lado na solução de Kreb.

Em seguida, corte dois pequenos anéis aórticos das seções da aorta deixadas após a remoção do segmento de dois milímetros. Um anel da secção da aorta antes do segmento de dois milímetros e outro anel da secção da aorta. Após o segmento de dois milímetros, coloque os dois anéis aórticos em uma lâmina de vidro do microscópio com o lúmen voltado para cima e meça a espessura da parede usando uma configuração de microscópio calibrada.

A espessura da parede aórtica é medida e calculada usando esses dois anéis. Encha a placa de Petri na plataforma de alongamento biaxial com solução de Krebs e insira o segmento do anel da aorta de dois milímetros nos pinos de tração. Neste protocolo, a plataforma de alongamento biaxial foi utilizada para investigar a resposta mecânica do núcleo em células de mioblastos de camundongo expostas a uma deformação do substrato de 25% de deformação de deslocamento.

As relações da realização de alongamento uniaxial padrão e puro são mostradas nesses resultados representativos. As esferas fluorescentes são selecionadas manualmente no primeiro quadro do vídeo e rastreadas de um quadro para o outro até que o alongamento máximo seja atingido ao longo das direções horizontal e vertical. Um script MATLAB calcula automaticamente os componentes do tensor de deformação verde para cada quadro e produz uma curva de calibração da deformação em relação ao deslocamento do motor.

Nesses gráficos, as linhas azul e vermelha correspondem ao componente do heer deformado verde ao longo das direções horizontal e vertical, respectivamente. Esses resultados ilustram as capacidades da plataforma de estiramento biaxial para induzir uma deformação no substrato ao longo de duas direções ortogonais. Além do padrão uniaxial dos campos de deformação biaxiais EQU, a plataforma de alongamento biaxial pode induzir campos de deformação complexos no substrato.

O painel G mostra que esticar o mesmo substrato em quatro milímetros ao longo do eixo x e esticar ligeiramente ao longo do eixo Y em 1,5 milímetros destacados em vermelho, produz um campo uniaxial puro sem deformação compressiva no substrato. O painel H mostra que o alongamento do substrato ao longo do eixo x em 3,5 milímetros produz uma deformação de 25% e uma deformação compressiva de 7% quando as extremidades do substrato ao longo do eixo vertical são fixas, destacadas em vermelho Com a capacidade de realizar imagens de microscopia de células vivas durante o alongamento, os núcleos foram corados com um corante fluorescente de células vivas que se liga ao DNA e, em seguida, esticado em 25% ao longo de cada eixo de alongamento ortogonal como ilustrado aqui entre cada fase do ciclo de alongamento, imagens de contraste e imagens epifluorescentes do núcleo não formado e deformado foram adquiridas. Os comprimentos dos eixos nucleares maior e menor ao longo do estado não formado e quando o núcleo foi esticado sequencialmente ao longo de seu eixo maior e menor foram determinados usando um plug-in de imagem J e usados para calcular a mudança relativa no comprimento.

Ao longo de cada eixo neste gráfico de barras, o eixo X ou maior é mostrado em azul e o eixo y ou menor é mostrado em vermelho. A capacidade de deformação do núcleo exibe uma anisotropia mecânica, pois exibe uma capacidade de deformação significativamente maior ao longo de seu eixo menor em, em comparação com seu eixo maior, o papel do citoesqueleto de actina e microtúbulos na regulação da capacidade de deformação nuclear foi examinado por despolimerização, os filamentos de actina ou microtúbulos seletivamente usando cito-D e neol, respectivamente, despolimerização. Descobriu-se que os filamentos de actina ou os microtúbulos induzem uma perda da deformabilidade anisotrópica do núcleo.

Esses resultados apóiam as descobertas de que os componentes do citoesqueleto transmitem forças para o núcleo a partir do substrato e também são essenciais para preservar o comportamento mecânico natural do núcleo. Durante a deformação, a plataforma de alongamento biaxial também foi usada para avaliar o efeito da superexpressão crônica da proteína de choque térmico 27 ou HP 27 na rigidez do vaso HSP sobre a expressão. Em um modelo de camundongo propenso à aterosclerose, um POE homozigoto negativo modifica a composição histológica das lesões de aterosclerose, aumentando as células musculares lisas intimais e o conteúdo de colágeno.

Para determinar o impacto desse remodelamento histológico nas propriedades mecânicas dos vasos, a plataforma de alongamento foi utilizada para medir a rigidez aórtica. Este gráfico mostra uma curva de tensão e deformação típica obtida a partir do alongamento de um vaso aórtico, enquanto a rigidez é calculada em 30% de deformação. A rigidez é a inclinação da tangente indicada pela linha vermelha à curva.

Verificou-se que a rigidez dos segmentos aórticos de camundongos com superexpressão de HSP 27 aumentou significativamente em 41% em comparação com o modelo de camundongo controle. Em conjunto, a avaliação mecânica combinada com a histologia do vaso e da placa demonstrou que a superexpressão de HSP 27 é caracterizada pelo aumento da rigidez do vaso e do conteúdo de células musculares lisas do colágeno. Esses resultados sugerem que a HSP 27 poderia potencialmente aumentar a estabilidade das lesões ateroscleróticas e, portanto, diminuir o risco de ruptura da placa após seu desenvolvimento.

Esta técnica paga uma nova maneira para o pesquisador no campo da bioengenharia explorar a resposta celular à deformação mecânica complexa e inotrópica para aplicações em biologia mecânica, mas também para monitorar a mecânica dos tecidos biológicos na doença.