Name: Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a induzir plasticidade em receptores GPCR astrocitários usando fatias hipocampais de camundongos e microscopia confocal. Este método permite estudar mudanças na sinalização cálcica astrocitária em resposta à atividade neuronal.

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Os autores gostariam de agradecer o Centro de UC Riverside para glia neuronais interações para valiosa discussão dos protocolos de escala e dados. Os autores também gostaria de dar um agradecimento sincero você Abcam por patrocinar a publicação de seu trabalho.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
<li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li>
<li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoceptors+in+brain%3A+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li>
<li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li>
<li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li>
<li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li>
<li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li>
<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
<li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II%3A+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Funct%22%5BJournal%5D)">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li>
<li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2%2B-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li>
<li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors%3A+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li>
<li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cortex%22%5BJournal%5D)">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li>
<li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors%3A+%28patho%29physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li>
<li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade%3A+synaptic+scaling%2C+intrinsic+plasticity+and+age-dependence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
<li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer+1+and+layer+2%2F3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li>
</ol>

Os autores pretendem revelar que a tetrodotoxina utilizado nestes estudos foi comprado de Abcam. Abcam não teve nenhuma participação nas hipóteses, design, ou coleta de dados. Toda a comunicação sobre o patrocínio da obra por Abcam ocorreu após o processo de revisão por pares foi completa.

Os modelos de dimensionamento descritos representam métodos práticos para a pesquisa de plasticidade de longo prazo do grupo astrocitário eu mGluRs. Geração de imagens espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos fornece um ensaio sensível para medir mudanças na atividade astrocitária Gq GPCR, como evidência empresa foi estabelecido que astrócitos Ca 2 + elevações ocorrem após liberação do IP 3 lojas sensível-R jusante da ativação Gq GPCR 10, 12, 17, 18. O percentual de astrócitos na população responder ao grupo I mGluR agonista eo padrão de tais Ca 2 + respostas relatam mudanças no grupo I mGluRs pelos astrócitos. A técnica específica utilizada para carregar os astrócitos com Ca 2 + indicador é uma consideração importante na concepção de ensaios para observar as mudanças na actividade astrocitário Gq GPCR. Bolus de carga ou carregamento a granel vários astrócitos, ou patch-carregamento da braçadeira de astrócitos individuais pode ser utilizado para imagem transientes de Ca 2 + em astrócitos. Cada abordagem oferece certas vantagens e desvantagens. Preenchendo diretamente astrócitos com Ca 2 + indicador via patch clamp permite a identificação inequívoca da célula como um astrócitos, sem necessidade de um marcador secundário, como SR-101. Entrega de patch-clamp de indicador também permite a gravação de Ca 2 + atividade de pequenos compartimentos astrocitárias incluindo os processos de multa espessas, potencialmente mais profundas na fatia onde as células são mais saudáveis ​​e com interações mais intactas com as sinapses (dependendo da potência do laser disponível). No entanto, patch-clamp carregamento sofre com baixa taxa de transferência como os dados são coletados uma célula de cada vez. De carregamento de grandes quantidades, por outro lado, permite que um grande número de astrócitos para ser carregado com Ca2 + indicador e fotografada simultaneamente. No entanto, apenas os astrócitos perto da superfície (&lt;20 mm) da fatia são carregados, com a preocupação associadas sobre a saúde das células e sinapses intactas. O protocolo de bolus de carregamento contrapressão aqui apresentado oferece um meio termo, com relativamente alto rendimento ea capacidade de monitorar Ca 2 + atividade mais profunda dentro da fatia (40-75 mm). Um aumento significativo na percentagem de astrócitos espontaneamente activas utilizando a técnica de bolus de carregamento é observada em relação ao volume de carga, o que sugere que as ligações entre as sinapses neuronais e os processos astrocíticos são mais completa 15. Com boa carga, pode-se frequentemente controlar Ca 2 + na actividade principais processos de astrócitos (dados não mostrados) ou, potencialmente, mesmo compartimentos menores usando microscopia de dois fotões. No entanto, os cuidados que precisam ser exercido em atribuir os processos menores para um astrocyte particular, como os limites mistura no fundo não específica coloração. Uma preocupação adicional com o uso de procedimentos de grandes quantidades de carga ou bolus de carregamento é a necessidade de um mar secundárioker para identificação dos astrócitos. Embora tenha sido conhecida há muitos anos que os astrócitos preferencialmente ocupam AM éster Ca 2 + indicadores, o marcador secundário SR-101 é frequentemente usado para verificar as células carregadas como astrócitos. SR-101 pode, por si só alterar a excitabilidade de neurónios intrínsecos 29. O uso de SR-101 corrobora a necessidade de realizar todos os Ca 2 + medições de astrócitos em TTX para limitar possíveis SR-101 efeitos sobre a excitabilidade neuronal. Supondo-se que ambos os grupos controle e experimentais incluem SR-101, o marcador em si não deve contabilizar os efeitos observados em astrócitos Ca 2 + sinalização seguintes manipulação de longo prazo dos potenciais de ação neuronais. SR-101 pode ser mais uma preocupação em alta K + experiências, no entanto, uma vez que pode reduzir a diferença entre os 2,5 mM de K + vs 5,0 mM K + se a taxa de disparo basal não é alterado proporcionalmente. Uma abordagem muito promissora para entregar Ca 2 + </sup&gt; Indicador de astrócitos surgiu recentemente, que oferece uma alternativa atraente para as abordagens mais tradicionais usando Ca 2 + corantes. Avanços significativos têm sido feitos ao longo dos últimos anos, com indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) direcionados para os astrócitos 30-32. Gecis pode ser entregue a astrócitos in vivo por microinjecção de vectores virais adeno-associados para uma região do cérebro de interesse, tais como o hipocampo. Expressão de Gecis é alcançada após cerca de duas semanas após a infecção viral 32. Há inúmeras vantagens oferecidas pela utilização de Gecis nos astrócitos. Em primeiro lugar, os vetores são direcionados para os astrócitos, utilizando um promotor específico do astrócitos, por isso as células marcadas são astrócitos 32. Em segundo lugar, o ruído de sinal-para-agora parece comparável com o que pode ser obtido usando a entrega de patch-clamp de corante, mas sem a capacidade de invasão de ter tido uma pipeta patch na célula 32. Em terceiro lugar, os indicadores podem ser delivered e expressa em tecidos adultos, o que é problemático usando métodos de entrega em massa-carga. Além disso, a expressão é mosaico, oferecendo a capacidade de diferenciar entre as várias astrócitos. Assim, vários astrócitos podem potencialmente ser trabalhada ao mesmo tempo, e ao mesmo tempo de gravação no soma e Branchlets finas, ao mesmo tempo. Portanto, potencialmente uma técnica simples pode ser usado no lugar de três técnicas diferentes (massa de carregamento, bolus de carregamento, e patch-clamp de carga) para gravar a atividade de escala de GPCRs Gq astrocitárias, aumentando significativamente a eficiência. Uma desvantagem potencial do uso de entrega viral mediada de Ca 2 + indicadores de astrócitos é o possível efeito sobre a fatia de saúde 32. Os vectores virais adeno-associados utilizados para entregar as Gecis ter sido mostrado previamente para causar a gliose reactiva de 33 astrócitos. Preparação de fatias do cérebro em geral provavelmente inicia estágios iniciais da patologia, incluindo liberação de inflammatory moléculas 10. Portanto, combinado com o tempo de incubação longos necessários para induzir a descamação de receptores astrocíticos, utilização de Gecis entregues utilizando vectores virais que necessitam de receber consideração adicional no contexto da fatia de saúde nestes tipos de experiências. Quando se emprega este protocolo, é importante ter em mente que o tempo de aplicação para o agonista para produzir uma resposta irá variar em função da disponibilidade de receptor. Para uma dada concentração do agonista, o tempo de aplicação terá de ser mais longo, se os receptores têm reduzida, e mais curtos, se os receptores têm ampliados, para a droga para alcançar uma concentração suficiente no tecido para activar os receptores suficientemente para produzir um Ca2 + resposta. Portanto, os tempos de aplicação de droga, e, potencialmente, as suas concentrações, pode ter de ser ajustado, dependendo da direcção pretendida para o dimensionamento. Por exemplo, a concentração de agonista pode ter de ser reduzido no case de TTX para evitar a saturação respostas, e aumentou após a incubação fatias em alto K + até mesmo ver uma resposta. Especificamente, a concentração de DHPG foi deslocado 5-15 fiM após o tratamento TTX 30-50 uM após tratamento 5,0 mM de K +, a fim de estudar de Ca 2 + os padrões de resposta, tal como de 5-15 uM é muitas vezes demasiado baixa para produzir respostas em fiáveis astrócitos após a escala para baixo do grupo I mGluRs. Gravação de astrócitos Ca 2 + atividade fornece nenhuma evidência direta de inserção receptor ou internalização de ou para a membrana plasmática. No entanto, com base na similaridade notável dos dados com os dados de estudos anteriores in vitro que examinaram a relação direta entre os níveis de expressão Gq GPCR e espontânea e evocadas Ca 2 + transientes 21-24, a interpretação mais lógica das mudanças em Ca 2 + sinalização é que os níveis de expressão dos receptores de superfície de astrócitos têmalterados. Uma abordagem complementar pode ser uma consideração importante quando se quer fornecer evidências adicionais sobre o locus do efeito sobre o Ca 2 + atividade. Uma estratégia que usamos foi examinar o efeito de TTX incubação em fatias de hipocampo de ratos MrgA1R astrocitárias. Estes ratos transgênicos expressar uma Gq GPCR estrangeira (o MrgA1R) só nos astrócitos. Porque este não é o receptor nativo para o cérebro, não há neurotransmissor endógeno presente para alterar os seus níveis de actividade. Trabalho anterior sugeriu que este receptor envolve o mesmo intracelular moléculas de sinalização como grupo endógeno I mGluR nas mesmas astrócitos 34. Após incubação a longo prazo das fatias de ratinhos MrgA1R em TTX, não há diferenças nas respostas MrgA1R evocada por agonista, em comparação com o controlo de ninhada incubadas fatias poderia fornecer provas de que o efeito em astrócitos de Ca 2 + a actividade é devida a variações localizadas para o receptor da superfície, especialmente se as respostas do grupo I mGluR ainda são signifivamente melhorado nos mesmos astrócitos. Uma alternativa, no entanto estratégia talvez mais envolvido seria isolar astrócitos das fatias para análise de Western blot, enquanto uma fracção de membrana pode ser analisado para alterações nos níveis de expressão dos receptores de superfície. Fluorescência ativado celular (FACS) ou citometria de fluxo pode ser útil aqui. As possíveis aplicações desta técnica para o estudo de neurónios, astrócitos e interacções astrócitos neuronal são muitos. Em nossos experimentos, único grupo DHPG evocadas eu mGluR foram estudados astrocitárias Ca 2 + respostas, em fatias de hipocampo agudas isoladas de ratos juvenis. Esta preparação não só tem as aferentes intactos (efeitos colaterais Schaffer), mas também os neurônios que dão origem a eles (células piramidais CA3), tornando-se possível manipular as taxas de disparo desses neurônios glutamatérgicos sobre as células pós-sinápticas (células piramidais CA1) e astrócitos no estrato radiatum cujos processos assoenviar um e com estas sinapses. A fatia do hipocampo aguda pode não ser a melhor preparação para a manipulação de taxas de disparo de outros tipos de neurônios, no entanto, como muitos aferentes são cortados a partir dos neurônios que dão origem a eles. No entanto, pode ser possível, em certas preparações fatia observar plasticidade de outros subtipos Gq GPCR astrocíticos. Por exemplo, as fatias podem ser preparados com os neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal e suas projeções para hipocampo intacto. A incubação dessas fatias em TTX ou elevada K + afetaria taxas de disparo dos neurônios colinérgicos basais, levando a descamação dos receptores muscarínicos em astrócitos de oriens estrato, que recebem uma parcela significativa da entrada colinérgica 1. Uma alternativa abordagem ainda não testados para estudar o dimensionamento do receptor astrocitário dentro de uma área específica do cérebro, com todas as ligações intactas, enquanto ocorre escamação, poderia ser a utilização de um modelo in vivo, onde uma libertação prolongada de TTX é conseguido por implantação de um plastpolímero ic Elvax 40W acima da região de interesse 35. Esta abordagem tem sido usada anteriormente em um estudo de escalonamento neuronal, mas também deve ser aplicável a descamação astrocitária. Finalmente, com a leitura adequada, estudos futuros poderiam examinar outras famílias GPCR, incluindo mudanças na L s ou L i GPCRs. Alguém poderia prever astrocitário GABA B G i GPCRs a ser afetado com a inibição do disparo no local projetando interneurônios GABA dentro de qualquer preparação fatia. Desenvolvimento de novos indicadores que visam outras moléculas sinalizadoras, como um indicador de tempo real do segundo acampamento mensageiro, abriria toda uma nova área de pesquisa sobre comunicação neurônio receptor-a-astrócitos. Escamação bidireccional de mGluRs astrocíticos por manipulação das taxas de queima neurónios basais fornece uma medida da sensibilidade dos astrócitos para libertação AP-mediada de neurotransmissor. Os astrócitos aparentemente pode sentir APs espontâneos e glutamatoliberação te a garantia Schaffer-CA1 sinapses celulares piramidal mesmo quando extracelular K + está dentro de uma faixa fisiológica. Embora a aplicação aguda da TTX não reduz a freqüência de astrócitos espontânea Ca 2 + actividade 18, 36, 37, o Ca 2 + atividade entre os astrócitos na população torna-se decorrelated 36, fornecendo evidências de que os receptores astrocitárias são detectores de AP. Isto sugere que os astrócitos sentir APs neuronal espontânea sem afetar em seu Ca 2 + actividade global. É amplamente aceito que as concentrações intracelulares de IP 3 precisa atingir um nível de limiar para estimular IP 3 Rs suficiente para levar a uma detectável Ca 2 + elevação. Poderia APs neuronal espontânea ativar GPCRs astrocitárias sem produzir mensuráveis ​​Ca 2 + elevações? Estudos futuros poderão utilizar fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) ou um tecnol semelhante<html> ique (tais como BRET) para analisar a relação entre a proteína G de acoplamento ao receptor (uma medida da activação do receptor) e Ca 2 + de libertação das reservas internas. BRET tem sido amplamente utilizado para a detecção in vitro de proteína G-a-GPCR de acoplamento 38, embora possa haver algum tempo antes de esta tecnologia esteja disponível para utilização em preparações de tecidos intactos. É possível que GPCRs Gq astrocitárias estão sendo ativados com muito mais freqüência do que pode ser gravado usando as ferramentas de Ca 2 + de imagem atualmente disponíveis. Além de sentir os potenciais de ação, GPCRs Gq astrocitárias também pode ser capaz de detectar liberação quântica miniatura de neurotransmissores como relatado em um estudo recente 39. O método de escalonamento bidireccional aqui descrito pode ser utilizado em estudos futuros para fornecer uma medida da extensão em que os GPCRs astrocitário Gq detectar libertação vesicular quântico de neurotransmissor, incluindo bafilomicina A1 no protocolo de incubação. ntent &quot;&gt; Até aqui, os protocolos de dimensionamento apenas têm sido utilizadas em fatias de hipocampo de ratinhos jovens (p12-p18). Portanto, é actualmente desconhecido se o dimensionamento do receptor astrocitário também podia ser induzida em tecidos obtidos a partir de ratinhos adultos. Um estudo recente convincente sugere que a expressão grupo I de mGluR em astrócitos diminui consideravelmente após a primeira semana de idade e continua a descer até à idade adulta, com níveis muito baixos de expressão do receptor nos astrócitos adultos 40. Assim, seria interessante determinar se os mGluRs astrocíticos intensificar seguinte longo inibição prazo de disparo neuronal em fatias do hipocampo do rato adulto para níveis próximos aos observados em astrócitos de ratos juvenis. Este achado sugere que a expressão do receptor astrocitário não é estática a uma determinada idade, mas podem mudar rapidamente, dependendo de níveis de atividade neuronal. Em contraste com expressão reduzida de mGluRs grupo I em ratos adultos, estão surgindo evidências que os receptores adrenérgicos, incluindo &amp; #945, 1A, 2A α, e β subtipos 1, são predominantemente expressos por astrócitos no cérebro adulto 3, 4. O adrenérgicos α 1A Gq GPCR pode ser um alvo atraente para futuros estudos de comunicação neurônio-a-astrócitos, inclusive se esses receptores são sensíveis a mudanças nas taxas de disparo dos neurônios adrenérgicos.

Os astrócitos responder em segundos a estimulação dos neurônios ou axônios neuronais com o aumento do Ca 2 + citoplasmático resultantes quase exclusivamente da ativação de GPCRs Gq astrocitárias. Por exemplo, os receptores de acetilcolina muscarínicos 1, 2 receptores de canabinóides, receptores adrenérgicos α 1A 3, 4 e grupo I mGluRs (veja abaixo) são todos os subtipos astrocitárias Gq GPCR que agudamente respondem à atividade neuronal. A activação do grupo astrocitário I mGluR foi demonstrado mais extensivamente, após a estimulação de aferentes glutamatérgicos neuronais in situ (tal como fatias de hipocampo agudas) 5-7, assim como no córtex do rato adulto in vivo após estimulação sensorial 8. O resultado da ativação de astrócitos Gq GPCR sinalização sobre a biologia e fisiologia dos astrócitos, neurônios, ou interações astrócitos-neurônios tem sido uma questão de debate 9-12. Será some tempo antes que a função de sinalização do receptor do neurônio-a-astrócitos é totalmente apreciado. Embora seja claro que os neurônios podem ativar receptores astrocitárias usando protocolos experimentais, existem aspectos da comunicação neurônio-a-astrócitos receptor que permanecem pouco conhecidos. Em primeiro lugar, a quantidade real de actividade neuronal requerida para activar astrocitário Gq GPCRs não é bem definida, e em segundo lugar, a capacidade dos receptores astrocíticos para expor dependente de utilização plasticidade tem recebido pouca atenção. Para começar a responder a estas questões, que recentemente desenvolveu um protocolo para induzir a descamação bidirecional de grupo astrocitário I mGluRs em fatias de hipocampo juvenis agudos em resposta às mudanças de longo prazo no potencial de ação neuronal (AP)-dependentes atividade sináptica. À semelhança do que foi descoberto para a plasticidade homeostático bidirecional de receptores de glutamato ionotrópicos neuronais 13, 14, grupo astrocitário eu mGluRs expandir as following bloqueio de potenciais de ação neuronais e escala para baixo quando a ação neuronal freqüência potencial é aumentado 15. Estas alterações de compensação em receptores astrocíticos pode ser medido através da gravação espontânea e evocada astrócitos transientes de Ca 2 + e comparação das propriedades destes eventos para aqueles a partir de astrócitos em condições de controle. Neste artigo, descrevemos a metodologia completa para o uso deste protocolo, incluindo a preparação de fatias do hipocampo, condições agudas de incubação para induzir a descamação receptor astrócitos, astrócitos Ca 2 + indicador corante de carregamento, Ca 2 + técnicas de imagem por meio de microscopia confocal e efeitos esperados em astrócitos atividade Gq GPCR. Previsíveis efeitos em astrócitos Ca 2 + propriedades de sinalização - que correspondam às registradas previamente em pilhas cultivadas transfectadas com diferentes níveis de GPCRs Gq de expressão - fornecer um &quot;roteiro&quot;, que pode ser usado em estudos futuros para analisar mudanças em comoexpressão GPCR trocytic. As ramificações e aplicações potenciais para o uso desta técnica irá contribuir para a nossa compreensão das interações astrócitos-neurônios no cérebro saudável e doente.

<table><tbody><tr><td>Chamber Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brinkmann recipiente de armazenamento de pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>Use a parte da gaveta como câmara de incubação</td></tr><tr><td>Furadeira</td><td></td><td></td><td></td>elétrica</tr><tr><td>Tubulação flexível</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Selante de costura de silicone&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Também chamado de selante de costura de aquário</td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td><td></td> de gás <td>95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta chanfrada natural</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>Corte para conectar linhas oxigenadas</td></tr><tr><td>Manifold de uma a seis linhas</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)</td><td>Para o aparelho de microloader-manifold</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Para o aparelho de microcarregador, Rack de</td></tr><tr><td>Bolhas Flutuante</td> Cortado para Encaixar <td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td><td>Para suporte de fatias</td></tr><tr><td>600 &micro; m Sefar Nitex Nylon mesh</td><td>ELKO Filtering Co.</td><td>06-600/51</td><td>Para suporte de fatia</td></tr><tr><td>Krazy Cola</td><td></td><td></td><td>Para suporte de fatia<</td></tr><tr><td>strong>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicose Fisher</td><td></td><td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroxi-2,5,7,8- ácido tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>citrato de tetrodotoxina (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforrodamina 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Plurônico F-127</td><td>Invitrogen, Sondas Moleculares</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *célula permeável (embalagem especial)</td><td>Invitrogen, Sondas Moleculares</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoilcolina cloreto (Carbachol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-ATP disódico (Na-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda única&nbsp;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>Para bissecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de dois gumes</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>Para cortar fatias</td></tr><tr><td>Mayo Tesoura, supercut</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>Para decapitação</td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina, reta</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14094-11</td><td>Para cortar o crânio</td></tr><tr><td>Pinça de íris, curva</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>Para remover a pele e o crânio</td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td> pequena <td>Para remover / transferir o cérebro</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont # 5 Pinça de ponta Biologie</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11295-10</td><td>Para dissecção do hipocampo</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Para transferência de fatias de cérebro</td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur bulbo de borracha</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>Para transferência de fatias de cérebro</td></tr><tr><td>Poliestireno 100 mm placas de cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher</td><td>ISOTEMP 210</td><td>Para incubação quente</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Para pipeta de carregamento de bolus</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td></td><td>Olympus Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem de banho de diamante aberta de baixo perfil com plataforma PM-1</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>banho de diamante com perfil baixo</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Para pipeta de carregamento de bolus</td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>ROE-200</td><td>Para pipeta de carregamento de bolus</td></tr><tr><td>Filtro de tubo de centrífuga Spin-X com 0,22 &micro; M Acetato de Celulose</td><td>Costar</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

induzir plasticidade de astrocítica receptores de manipulação de neuronal queima de moeda

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Perto de duas décadas de pesquisa estabeleceu que os astrócitos in situ e in vivo expressar inúmeros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que podem ser estimulados pelo transmissor neuronalmente-lançado. No entanto, a capacidade dos receptores astrocitárias para expor plasticidade em resposta a mudanças na atividade neuronal tem recebido pouca atenção. Aqui, descrevemos um sistema modelo que pode ser usado para escalonar globalmente para cima ou para baixo grupo astrocíticos que os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) em fatias cerebrais agudas. Estão incluídos os métodos de como preparar fatias de hipocampo parassagitais, construir aposentos adequados para a incubação fatia de longo prazo, bidirectionally manipular ação neuronal potencial de freqüência, astrócitos de carga e processos de astrócitos com fluorescente Ca 2 + indicador, e medir as mudanças na atividade Gq GPCR astrocitário por gravação astrócitos espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos usando microscopia confocal. Em essência, um &quot;r cálciooadmap &quot;é prevista como medir a plasticidade de GPCRs Gq astrocitárias. São discutidas aplicações da técnica para o estudo dos astrócitos. Ter uma compreensão de como a sinalização do receptor astrocitária é afetada por mudanças na atividade neuronal tem implicações importantes tanto para a função sináptica normal, assim como os processos subjacentes distúrbios neurológicos e doenças neurodegenerativas.

Os resultados representativos na Figura 3 mostra o efeito da incubação de fatias do hipocampo do rato agudas em TTX para 4-6 horas em astrócitos sr Ca 2 + actividade. Os dados incluem tanto espontâneas Ca 2 + transientes e grupo DHPG evocadas eu mGluR Ca 2 + respostas, a partir de fatias incubadas no controle ACSF vs ACSF mais TTX. Para além de características morfológicas características básicas, a montagem processo stellate e pequeno tamanho físico (~ 10 mM), os astrócitos são identificados na sr por sobreposição do Ca 2 + indicador OGB-01:00 com o marcador de astrócitos selectiva SR-101 19, 20 ( Figura 3A). As caixas numeradas mais de corpos celulares de astrócitos corresponde à fluorescência numeradas sobre traços de tempo mostrado na Figura 3B. O agonista de mGluR do grupo 1 (RS)-3.5-DHPG é aplicado para determinar os efeitos de dimensionamento específicos no grupo 1 mGluRs em astrócitos. Para discriminar entre physiology na especificidade do efeito de escala para os mGluRs do grupo 1, versus outros GPCRs Gq, um cocktail de agonistas é aplicado no final de cada experiência. Aqui utilizou-se 10 ^ M de cada de Gq GPCR agonistas de histamina, cloreto carbamilcolina (carbacol) e adenosina-5&#39;-ATP dissódico (Na-ATP). O coquetel de agonista também serve como um controlo positivo para identificar, os astrócitos reactivos viáveis ​​nos casos em que as células não respondem a DHPG, presumivelmente porque estas astrócitos particulares não expressam quantidades suficientes do receptor para induzir uma resposta a DHPG. Foram utilizados diferentes concentrações de DHPG, incluindo 5 uM e 15 uM (Figura 3B), bem como 30 uM e 50 uM (Figura 4A) para ajudar a revelar alterações no grupo astrocitária I mGluR. A relação entre Ca 2 + respostas celulares e os níveis de expressão Gq GPCR foi examinado anteriormente in vitro 21-24. Em primeiro lugar, olimiar de resposta a um agonista em particular a concentração depende da densidade de receptores expressos por cada célula. Em uma população de células, mais as células respondem com um Ca2 + elevação para uma dada concentração de agonista quando as células são transfectadas com maiores densidades de receptores. Após a incubação as fatias em TTX, a percentagem de astrócitos na população de responder a uma concentração fixa de agonistas aumentos (figuras 3B e 3C). Verificou-se que 5 uM e 15 uM DHPG revelam diferenças óbvias na percentagem de astrócitos reactivos entre o controlo e as células tratadas TTX, enquanto que 30 e 50 uM DHPG são necessários para comparar as respostas de grupo I de mGluR em 5,0 mM de K + tratados vs controle células (Figura 4A). A relação entre os padrões de Ca 2 + resposta astrocitárias e concentração agonista também foi examinada in situ. Aumentando o agonistaconcentração muda o padrão do Ca 2 + resposta em astrócitos de pico único Ca 2 + elevações para multipeak e planalto Ca 2 + elevações 25-27. Com base nestas descobertas anteriores, previmos que o padrão de resposta a uma única concentração de agonista mudará se houver alterações no nível de expressão do receptor. Assim, dependendo de qual dos dois métodos de escala está a ser utilizado (inibindo o disparo neuronal ou aumentando-a), a concentração de agonista necessária para produzir um padrão de resposta particular irá aumentar ou diminuir. Por exemplo, os astrócitos foram incubadas em TTX deslocar sua DHPG evocadas Ca 2 + padrão de resposta a mais platô do tipo Ca 2 + elevações e responder a reduzir as concentrações de agonista, em comparação com o controle astrócitos (Figura 3C). Tendo em conta estudos anteriores, estas observações sugerem que o I mGluR os níveis de expressão do receptor em astrócitos grupo aumentou. Tempo de subida e início (latência) dos Ca 2 + elevações também foram mostrados para correlacionar diretamente a mudanças nos níveis de expressão Gq GPCR em células cultivadas 22-24. Níveis mais elevados de expressão do receptor de resultar em menores latências de resposta e tempos de subida mais rápido enquanto que a redução na densidade do receptor produz o efeito oposto. Para astrócitos incubados em TTX, Ca 2 + transientes evocadas pela aplicação de DHPG têm significativamente mais rápido subir vezes em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF (Figura 3D). Como mencionado anteriormente, as amplitudes das respostas de Ca 2 + evocada por agonista permanecem inalterados, independentemente da concentração de agonista ou o modelo de escalonamento 15 (Figura 3D). Além das mudanças observadas pelo grupo ativando diretamente eu mGluRs com DHPG, astrócitos espontânea Ca 2 + atividade também é afetada significativamente por esta manipulação. Observamosda aumento de 2,26 vezes na percentagem de astrócitos espontaneamente activos incubadas em TTX versus controlo. Isso representa um aumento de apenas 12,9% dos astrócitos de controle exibindo atividade espontânea na soma para 42,1% no TTX incubadas astrócitos (Figura 3E). Porque é sabido que a actividade GPCR exposição &quot;intrínseco&quot; ou constitutiva na ausência de agonista de 21, 26, 28, e que o nível de esta actividade intrínseca aumenta com o aumento dos níveis de expressão do receptor, estes dados sugerem que a densidade de astrocíticos Gq GPCRs aumentos seguinte redução longo prazo ação neuronal potencial fuzilamento. Similar às respostas evocadas por agonistas, os tempos de subida dos espontâneos Ca 2 + elevações são também aumentou (Figura 3E). Dados representativos utilizando o segundo protocolo, incubação em potássio extracelular elevada (5,0 mM), está representado na Figura 4. Um aumento em K + extracelular 2,5-5,0 resultados mM em um aumento significativo na acção basal neurónio CA3 potencial de frequência 15. As concentrações mais elevadas de DHPG (30 uM e 50 uM) são necessárias com o fim de provocar o grupo I de mGluR de Ca 2 + as respostas a partir dos astrócitos incubados em elevada de potássio (Figuras 4A e 4B). Isto é consistente com um nível reduzido de mGluR do grupo I, a capacidade de resposta em astrócitos seguindo um aumento de longa duração em potenciais de acção neuronais. Além disso, o padrão de resposta evocada a uma concentração fixa de DHPG muda de respostas do tipo plataforma para respostas mais fracas de um único pico (Figura 4B). Examinando o percentual de astrócitos espontânea ativos nas duas condições potássio revela que menos astrócitos incubados em alta K + são espontânea ativa em relação à condição controle (Figura 4C). Este efeito é na opposite direcção da condição TTX em que a percentagem de astrócitos exibem espontânea de Ca 2 + elevações é aumentada. Por último, tanto evocado e espontâneas Ca 2 + elevações têm tempos de subida mais lenta em astrócitos incubados em relação à condição controle (Figuras 4C e 4D) de altura K +. Globalmente, estes dados sugerem que os níveis de expressão astrocitárias Gq GPCR escama bidirecional, dependendo do nível de ação neuronal atividade potencial ao longo de um período de tempo prolongado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Fabricação Slice câmara de incubação e configurar. (A) A parte de gaveta de um recipiente de armazenamento pipeta Brinkmann, juntamente com a tampa hermeticamente fechado é usado para construir a câmara de fatia incubação. (B) Drill um furo no lado do recipiente de cerca de 1 ¼ a partir do topo e ¼ a partir do lado. Coloque em um pedaço de tubo flexível. (C) ligação ao aparelho microloader-colector para a extremidade interior da tubagem flexível. Nota cut-to-ajuste natural ponta da pipeta de 200 mL (seta branca). (D) Seis 20 ul microloaders Eppendorf são cortadas-para-ajuste a um colector de linha de um a seis para criar um aparelho microloader-colector. (E) Faça dois pequenos furos na tampa. (F) A cremalheira da bolha flutuante para fazer o suporte da fatia. (G) As &quot;pernas&quot; inferiores da cremalheira bolha flutuante são removidos de modo a que um pedaço de material de malha de nylon pode ser colada à parte inferior. (H) Encha a câmara de incubação com quantidade suficiente de ACSF para que os carros alegóricos titular fatia. Ajuste o comprimento da tubulação de modo que as pontas dos microloaders pode descansar em um canto do chão da câmara. Ao colocar a câmara de incubação ema água do banho, o nível da água no banho deve estar no mesmo nível que o ACSF na câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Estimativa da fatia de saúde. (A) Uma fatia do hipocampo com aparência saudável usando diferencial interferência contraste (DIC) óptica. Fatias saudáveis ​​têm uma aparência aveludada e uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 saudáveis. Observe as dendrites apicais projetando em estrato radiatum. Patch-clamp de neurônios que se parecem com os apresentados aqui revelam um potencial de repouso baixa (-61 a -62 mV) no padrão de 2,5 mM K + ACSF com poucos potenciais de ação espontânea. O potencial de membrana e de queima taxas vão variar em função do exintracelular de K + (Xie et al. 15). As setas apontam para os astrócitos putativos. Abreviações: sr, estrato radiatum; s.py., estrato pyramidale. Barra de escala, 10 ^ m. (B) fatias insalubres terá uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 mortos, que têm a aparência de ovos fritos (setas brancas apontam para núcleos de neurônios mortos - a &quot;gema&quot; do ovo frito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Gravação amplificado actividade de GPCR e Gq grupo evocado I de mGluR de Ca 2 + respostas após a inibição de longo prazo de APs neuronais por incubação em TTX. (A) Imagens representativas de células no campo de gravação incubadas em control condições (painéis superiores) ou em TTX (painéis inferiores) que assumiram Oregon Verde BAPTA-1 AM Ca 2 + corante indicador (painéis à esquerda) e SR-101 (painéis de média). A barra de escala representa 10 um. Sobreposição de ambos os sinais (&quot;merge&quot;) indica que a carga astrócitos com Ca 2 + indicador. As caixas são desenhadas sobre soma astrocyte indivíduo para registrar a intensidade de fluorescência ao longo do tempo no canal verde para monitorar Ca 2 + atividade em astrócitos. (B) os vestígios de amostra das caixas registradoras em A) de Ca 2 + atividade nos astrócitos. Os astrócitos incubados em TTX mostram aumento da atividade espontânea e evocada grupo mais robusto eu mGluR Ca 2 + respostas como evidenciado por mudanças no padrão de resposta. Exemplos de pico único (círculo), multipeak (retângulo) e planalto (retângulo pontilhado) Ca 2 + transientes são mostrados. (C) As mudanças nos padrões de resposta são especialmente evidentes usando concent diferenterações do grupo I mGluR agonista DHPG. Mais multipeak planalto e respostas são evidentes após incubação em TTX em comparação com o controlo de uma determinada concentração de agonista. (D) Aumento tempos de Ca 2 + respostas DHPG-evocadas são mais rápidos em astrócitos incubados em TTX em relação ao controle (painel superior), enquanto amplitudes não mudam (painel inferior), indicativo de &quot;tudo-ou-nada&quot; amplitudes de resposta, uma vez o limiar de resposta foi atingido. (E) Aumento tempos de astrócitos espontânea de Ca 2 + transientes também são mais rápidos em TTX incubadas vs controle incubadas astrócitos (painel superior), enquanto o percentual de astrócitos na população exibindo espontâneas Gq GPCR Ca 2 + atividade aumenta (painel inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width = &quot;6 pol&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 4. Gravação astrocitário diminuída atividade Gq GPCR e de grupo evocou eu mGluR Ca 2 + respostas seguintes aumento a longo prazo em APs neuronais por incubação em potássio extracelular elevada. (A) os traços representativos dos astrócitos Ca 2 + gravações de fatias incubadas em 5,0 mM K + ACSF para despolarizar neurônios e aumentar a sua taxa de disparo basal em relação ao controle ACSF (2,5 mM K + ACSF). Os astrócitos incubados com 5,0 mM K + ACSF exposição menos espontâneas somáticas Ca 2 + transientes e mais fraco DHPG respostas evocadas em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. (B) uma comparação de padrões de respostas evocadas para várias concentrações de DHPG revela tipos de respostas mais fracas após crescimento a longo prazo em APs neuronais. (C) A redução no percentual de astrócitos no população exibindo espontânea de Ca 2 + observa-se a actividade após incubação a longo prazo em elevado K + comparado com o controlo ACSF (painel superior), enquanto que tempos de subida da actividade espontânea tornar mais lento (painel inferior). (D) Aumento tempos de astrócitos evocado Ca 2 + respostas a diferentes concentrações de DHPG ficar mais lenta após 5,0 mM K + tratamento em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores astrocitárias a mudanças na atividade neuronal.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir um aumento ou diminuição de longo prazo na sinalização de receptores acoplados à proteína GQG em astrócitos em resposta a alterações na transmissão sináptica neuronal. Isso é realizado primeiramente preparando fatias hipocampais agudas de camundongos selvagens. O segundo passo consiste em aplicar sulur Rumine 1 0 1 às fatias para marcar os astrócitos.Em seguida, os cortes hipocampais agudos são incubados por quatro a seis horas com tetrodotoxina para bloquear os potenciais de ação neuronais ou em fluido céfalo-raquidiano artificial regular. O passo final consiste em carregar os astrócitos na camada radiata do corte com um indicador de cálcio, utilizando um protocolo de carregamento por pressão retrógrada. Por fim, utiliza-se microscopia confocal para demonstrar alterações na atividade de sinalização GQ GPCR dos astrócitos, registrando as mudanças nos transientes de cálcio espontâneos e evocados nos astrócitos.Este método fornece informações sobre a plasticidade de receptores de astrócitos e alterações associadas na sinalização de PCR TQG. Também pode ser utilizado para medir a plasticidade homeostática de receptores metabotrópicos em neurônios. Para iniciar este procedimento, ligue o vibratótomo e certifique-se de que o dreno esteja fechado.Em seguida, fixe a câmara de corte no vibrátomo e coloque gelo ao redor da câmara de corte. Depois, remova a graxa de fábrica da lâmina de barbear de dupla face mergulhando-a em etanol 70% por cinco minutos e, em seguida, enxaguando com água duplamente destilada. Corte-a ao meio cuidadosamente e monte uma metade sobre o bloco de corte para a preparação de fatias cerebrais.Após obter um cérebro de camundongo seccionado com uma lâmina de barbear gelada em uma placa de Petri para permitir maior área de superfície para resfriamento e oxigenação. Deixe os hemisférios seccionados repousarem no tampão de corte gelado por dois a três minutos até que fiquem completamente frios e mais firmes. Em seguida, aplique uma fina camada de cola instantânea sobre a plataforma do vibrátomo e fixe ambos os hemisférios à plataforma.Com os lados cortados voltados para baixo, os lados laterais voltados para cima e o bulbo olfatório voltado para frente, fixe a plataforma na câmara de corte. Preencha a câmara de corte com tampão de corte gelado e bem oxigenado. Continue oxigenando a câmara de corte enquanto prepara fatias parasagitis de 300 mícrons de espessura utilizando o vibrátomo. Após o corte, dissecar o hipocampo e o córtex entorrinal adjacente de cada fatia parasagital no tampão de corte gelado e bem oxigenado.Para fazer uma pipeta de transferência, quebre a ponta longa de uma pipeta de vidro de Pasteur e coloque uma bolsa de pipeta na parte quebrada. Transfira as fatias de hipocampo para a câmara de incubação na banho-maria a 35 graus Celsius, uma por vez. Observe que, por motivos de visibilidade, esses passos estão sendo mostrados com as câmaras de incubação fora do banho-maria a 35 graus Celsius.Incube as fatias hipocampais por 20 minutos em um micromolar de SR 1 0 1 diluído em A CSF com baixo teor de cálcio no banho-maria a 35 graus. Em seguida, transfira-as para o A CSF com baixo teor de cálcio sem SR 1 0 1 por mais 10 minutos. Recuperação em temperatura aquecida.Em seguida, transfira as fatias para o ACSF controle ou experimental para os restantes 15 minutos da incubação aquecida. Após a recuperação de 45 minutos, mova cuidadosamente as câmaras de incubação do banho-maria a 35 graus Celsius para a bancada e permita que as fatias continuem a incubar à temperatura ambiente por um tempo total de três horas antes de iniciar o protocolo de carregamento em bolus. Neste procedimento, prepare uma pipeta a partir de uma capilar de vidro borossilicato puxada até uma resistência de aproximadamente 1,3 mega ohm quando preenchida com a solução do corante.Em seguida, coloque uma fatia hipocampal em uma câmara de registro e perfunda continuamente com A CSF oxigenado a 1,5 mililitros por minuto; utilize apenas uma fatia hipocampal que apresente uma alta porcentagem de células paramentais CA1 saudáveis e superfície com aparência lisa, descartando-a se parecer não saudável. Usando óptica de contraste por interferência diferencial, localize um campo apropriado de astrócitos no estrato raiado, a 40 a 70 micrômetros abaixo da superfície da fatia. Em seguida, posicione a pipeta de vidro pré-carregada com solução D em um eletrodo microscópico padrão para grampo de patch.Abixe-o até a superfície da fatia acima do campo com a pipeta na superfície da fatia. Aplique pressão positiva à pipeta para começar a ejetar o corante. Abaixe lentamente a pipeta até aproximadamente 40 micrômetros abaixo da superfície da fatia utilizando um micromanipulador e permita que o corante seja ejetado por cerca de 45 a 60 segundos.Em seguida, abaixe a pipeta em mais 35 micrômetros e ejetar o corante por aproximadamente 45 a 60 segundos. Depois, retire lentamente a ponta da pipeta do corte para garantir que um grande número de astrócitos incorpore o corante. Geralmente é útil injetar um segundo volume de corante a uma curta distância.Para tanto, eleve a pipeta de volta até a superfície da fatia e certifique-se de que a pipeta não está entupida. Em seguida, mova a pipeta aproximadamente 80 a 100 micrômetros de distância do primeiro local de injeção ao longo do estrato radiado, repita a injeção em bolus neste local e aguarde de 30 a 45 minutos antes de imagens os astrócitos, utilizando o microscópio confocal para a aquisição. Limitar a exposição da fatia à luz laser é de extrema importância, pois uma exposição elevada pode levar ao desbotamento do corante e/ou fototoxicidade.Defina os valores padrão para cada laser em uma configuração alta do foto multiplicador, ganho de um x e potência de saída do laser de 0,5% por hora. Em seguida, aplique um zoom de 1,5 x para melhor visualização dos processos dos astrócitos. Depois, defina a resolução do campo para 512 pixels por 512 pixels.Em seguida, ajuste a velocidade de varredura para a mais rápida possível, o que equivale a cerca de 1,2 segundo por varredura. Usando o modo de varredura unidirecional, colete espectros de emissão utilizando filtros de passagem de banda de 503 a 548 nanômetros para o laser de 488 nanômetros e de 624 a 724 nanômetros para o laser de 559 nanômetros. Então, confirme a identidade das células carregadas com o corante de cálcio como astrócitos, visualizando a marcação dupla com o SR 1 0 1.Utilizando o laser de 559 nanômetros para registrar a atividade de cálcio em astrócitos. Primeiro, desenhe caixas sobre as regiões de interesse dentro da célula usando o software de aquisição de imagem, neste caso sobre os corpos celulares dos astrócitos. Em seguida, desenhe uma caixa sobre a área de fundo como referência.Obtenha 10 minutos de gravação basal da atividade espontânea de cálcio nas ROI. Em seguida, aplique um agonista de interesse em concentrações crescentes sequenciais, deixando um intervalo mínimo de cinco minutos entre as aplicações para reduzir o possível desensibilização do receptor. Ao final da gravação, aplique um coquetel de agonistas para outros GPCR astrocíticos GQ como controle positivo das vias de sinalização GPCR GQ astrocíticas Inpact.Após a conclusão da gravação de cálcio, adquira imagens fixas com os lasers de 488 nanômetros e 559 nanômetros para posterior confirmação da identidade dos astrócitos e posicionamento das ROI. Abaixo estão as imagens representativas de células no campo de gravação, incubadas em condições controle ou em TTX, que incorporaram o corante indicador de cálcio Oregon Green BAFTA 1:00 AM e SR 1 0 1. A sobreposição de ambos os sinais indica os astrócitos carregados com o indicador de cálcio; caixas são desenhadas sobre os somas individuais dos astrócitos para registrar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo no canal verde, a fim de monitorar a atividade de cálcio nos astrócitos.Aqui estão os traços amostrais das caixas de gravação de atividade de cálcio em astrócitos. Astrócitos incubados em TTX apresentam aumento da atividade espontânea e respostas de cálcio ao grupo um MGL R evocadas mais robustas, conforme evidenciado pelas alterações no padrão de resposta. São mostrados exemplos de transitórios de cálcio com pico único, múltiplos picos e platô, e aqui estão traços representativos de gravações de cálcio em astrócitos provenientes de fatias incubadas em A CSF com potássio 5,0 milimolar para despolarizar os neurônios e aumentar sua taxa de disparo basal em comparação com o controle em A CSF com potássio 2,5 milimolar. Astrócitos incubados com A CSF contendo potássio 5,0 milimolar exibem menos transitórios de cálcio somáticos espontâneos e respostas evocadas por DHPG mais fracas em comparação com astrócitos incubados em A CSF controle. O mapeamento de cálcio em astrócitos fornece uma boa leitura funcional das alterações na sinalização de receptores acoplados à proteína G.No entanto, não é capaz de identificar onde, na via de sinalização, essas alterações estão ocorrendo. Portanto, uma abordagem complementar seria utilizar a triagem de células ativadas por fluorescência ou citometria de fluxo em astrócitos que expressam a proteína verde fluorescente, aplicar um anticorpo contra o receptor acoplado à proteína G de interesse e, em seguida, realizar blotagens sulternas para detectar alterações nos níveis de expressão do receptor. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a amplificação da atividade de PCR em tempo real em astrócitos, seguindo alterações na transmissão sináptica neuronal por meio do registro de eventos espontâneos e induzidos por Agnes nos níveis de cálcio em astrócitos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

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Aprenda a induzir plasticidade em receptores GPCR astrocitários usando fatias hipocampais de camundongos e microscopia confocal. Este método permite estudar mudanças na sinalização cálcica astrocitária em resposta à atividade neuronal.

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