Um método de baixo custo para análise de Apreensão-como atividade e movimento em Drosophila

O objetivo geral deste procedimento é identificar alterações nos comportamentos locomotores ou convulsivos em drosófilas. Isso é feito separando primeiro as moscas em frascos individuais com o uso de anestesia. Em seguida, uma webcam simples é usada para gravar o movimento das moscas.

Os dados são então importados para a Imagem J para iniciar a análise. Finalmente, um software de análise de moscas personalizado é usado para determinar a distância, velocidade e duração do movimento durante o período de gravação. Em última análise, este ensaio pode mostrar alterações no comportamento locomotor ou convulsivo que estão associadas a manipulações genéticas e farmacológicas.

Agora, essa técnica de registro de baixo custo que vamos descrever pode ser usada para analisar o comportamento convulsivo e a locomoção em moscas-das-frutas. Em particular, nós o usamos para identificar manipulações genéticas e farmacológicas que modificam o comportamento convulsivo nessas moscas. Mas hoje, Chris Burner, um assistente de pesquisa de graduação em meu laboratório, estará demonstrando essa técnica Para começar, configure a webcam que registrará as moscas durante os ensaios locomotores e convulsivos.

Assim que a câmera estiver no lugar, abra o prático programa de software VI. Para ajustar as configurações de gravação, selecione a opção de imagens com lapso de tempo na guia de captura e, quando a nova janela for aberta, selecione a webcam como dispositivo de captura. Para a maioria dos experimentos, um tamanho de quadro de vídeo de seis 40 por quatro 80 é adequado Na opção de compactação, selecione o codec Intel IUV e defina os segundos por quadro de acordo com o ensaio.

Na guia avançada, crie um arquivo de imagem bitmap para cada captura e selecione uma pasta para o programa armazenar a pilha de imagens depois de gravada. Em seguida, coloque uma mosca morta em uma folha de papel. Clique na caixa de configurações de vídeo e, na guia de configurações do dispositivo, ajuste as configurações até que o fundo branco brilhante esteja em contraste claro com a mosca mais escura.

Clique no botão Iniciar para iniciar a gravação. Quando o período de gravação terminar, clique no botão Parar. A pilha de imagens agora deve estar na pasta selecionada para iniciar o ensaio de atividade locomotora.

Transfira as moscas para frascos individuais tampados com um tampão de algodão. Deixe as moscas descansarem sem serem perturbadas por 20 a 30 minutos antes de prosseguir. Após este tempo, bata suavemente na mosca a ser testada para fora do frasco e sob uma tampa de placa de Petri.

A capa deve conter pequenas fendas para permitir que o fluxo de ar posicione a mosca sob a webcam configurada anteriormente. Quando estiver pronto, pressione start para começar a registrar a atividade locomotora. O primeiro passo do ensaio de convulsão é alimentar moscas sensíveis a convulsões de dois dias de idade, seja meio padrão ou meio misturado com a droga a ser testada.

Após dois dias de alimentação, transfira as moscas batendo suavemente em frascos vazios individuais e tampe os frascos com um tampão de algodão. Deixe as moscas sentarem-se sem serem perturbadas durante 20 minutos antes da observação. Quando estiver pronto, vortex um frasco em um vórtice de laboratório ou usando as configurações mais altas por 10 segundos.

Coloque imediatamente a mosca imobilizada em uma folha de papel branca diretamente abaixo da webcam. Uma vez no lugar, comece a gravar. Isso voa atividade.

A mosca sofrerá movimentos rápidos e descoordenados intercalados com períodos de paralisia. A gravação é encerrada assim que a mosca se endireita. Para começar a analisar os dados, abra o software de processamento de imagem gratuito image J uma vez aberto.

Importe a pilha de imagens desejada clicando primeiro na guia do arquivo e selecionando importar. E, finalmente, sequência de imagens. Selecione a pasta que contém a pilha de imagens e abra uma imagem.

Quando a caixa de diálogo de opções de sequência for aberta, selecione classificar nomes numericamente e, em seguida, selecione. Okey. A pilha de imagens agora será carregada na Imagem J.Em seguida, selecione a guia de imagem e defina o tipo de valor para oito bits. Clique na guia da imagem novamente e selecione o limite na opção de ajuste.

Isso define o limite em todas as imagens para que cada uma consista em um fundo branco com a mosca sendo convertida em um ponto preto. Isso também abre a caixa de diálogo de limite onde os pontos de corte podem ser ajustados. Examine as imagens para ver se alguma contém pontos pretos extras ou se a mancha está faltando.

Se necessário, ajuste o limite para aliviar quaisquer problemas. Depois que os ajustes forem feitos, selecione aplicar na caixa de diálogo limite. Quando a caixa de diálogo converter em máscara for aberta, clique em OK para limitar a pilha de imagens.

Para medir o movimento da mosca em pixels, selecione o plug-in multi tracker na guia de plug-ins. Quando a caixa de diálogo do rastreador de objetos aparecer, clique em todas as quatro opções fornecidas e selecione. Okey. O plug-in multi tracker anexará coordenadas ao preto.

em cada fatia e liste-as na janela de resultados, bem como o comprimento total em pixels. A janela de caminhos fornece a exibição gráfica do caminho que a mosca percorreu. Copie a lista de coordenadas X e Y da janela de resultados e cole os dados em uma planilha do Excel.

Se algum slide na pilha não tiver um preto. nele, o programa Multi Tracker irá parar nesse slide. Se isso ocorrer, limite novamente a pilha para garantir que a mosca seja registrada como preta.

no slide em questão. Para converter os comprimentos do caminho de pixels para centímetros, tire uma imagem de dois pontos espaçados a uma distância conhecida em um pedaço de papel branco em branco. Determine as coordenadas de pixel XY para os dois pontos e use essas informações para determinar o número de pixels correspondentes a um centímetro para obter resultados mais precisos.

Remova o ruído das imagens importando as coordenadas XY para um programa de análise de moscas personalizado. Depois de aberto, importe os dados de cada genótipo ou tratamento para planilhas separadas. Em seguida, selecione a guia da planilha de resumo e clique no botão clique em mim.

Selecione um valor limite de acordo com o tipo de análise, clique em OK e o programa calculará a velocidade, o tempo e a distância do movimento. Essas vias representativas mostram atividade semelhante a convulsões em moscas mutantes com e sem tratamento com metformina. A atividade convulsiva diminuiu com o tratamento nos dois mutantes testados.

A metformina reduziu significativamente a distância percorrida durante o ensaio de convulsão e a duração total da atividade semelhante a uma convulsão. Em contraste, não houve alteração na velocidade média nessas vias locomotoras individuais. O caminho da mosca CS do tipo selvagem mostra concentração em torno da periferia da arena circular.

Enquanto o caminho de Uma mosca BSS mutante mostra a mesma concentração, mas com menos movimento geral. Quando testados para locomoção em um novo ambiente, os mutantes BSS exibiram uma redução significativa no comprimento do caminho em comparação com as moscas CS. O ensaio também detectou mudanças na velocidade de movimento enquanto a mosca CS explorava durante o ensaio locomotor.

A mosca BSS permaneceu relativamente inativa durante todo o teste, exceto por algumas rajadas de atividade. Uma das coisas mais importantes a ter em mente ao realizar qualquer um desses ensaios comportamentais com essa técnica é garantir que você não anestesie as moscas antes de fazer as gravações. Acontece que a anestesia afetará tanto o comportamento convulsivo quanto o comportamento locomotor e pode alterar significativamente seus resultados.