Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

O objetivo geral deste procedimento é preparar uma amostra para crio TEM, extraindo uma lamela de feixe de íons focalizada de uma amostra a granel congelada criogenicamente. Isso é feito primeiro mergulho, congelando a amostra em nitrogênio líquido e montando-a dentro do feixe de íons criogênico SEM. O segundo passo é cortar um LA Melo fino com o feixe de íons e transferi-lo para uma grade MET por meio de um nano manipulador resfriado.

Em seguida, a grade MET é transferida do suporte SEM para o suporte MET em uma estação de transferência. A etapa final é a transferência do suporte do MET para o MET criogênico para análise posterior. Em última análise, o crio TEM é usado para mostrar imagens de alta resolução, tomo Grahams ou mapas de raios-x da lamela extraída.

Esta técnica nos permitirá analisar a matéria mole com resolução máxima no microscópio eletrônico de transmissão, pré-selecionando o local de análise por outras microscopias, como microscopia de luz ou microscopia de varredura. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a microtomia criogênica Mac, é que artefatos de preparação, como compressão e formação de definição da amostra, são evitados. Primeiro monte duas grades MET para amostras de feixe de íons focalizados.

No suporte de transferência SEM, prenda as grades apertando os parafusos correspondentes com uma chave de fenda e feche as persianas, monte um sample stub apropriado para a amostra e adicione uma parte da amostra. Por exemplo, use uma pipeta para depositar gotículas em um toco plano. Em seguida, monte o suporte de transferência SEM no dispositivo de transferência a vácuo ou VTD.

Depois de adicionar nitrogênio líquido na estação de lama e bombear, abra a estação e congele novamente a bomba do suporte de transferência SEM até que a fervura esteja completa e a lama seja obtida novamente. Em seguida, retraia o suporte de transferência SEM na câmara de vácuo do VTD e feche-o. Ventile a estação de lama e a câmara de preparação criogênica Ventile a câmara de ar externa.

Em seguida, combine a vedação VTD com a câmara de ar da câmara de preparação criogênica e da bomba. Quando um bom nível de vácuo for atingido, meça o pino da câmara de ar para abrir a vedação do VTD e a câmara de ar externa. Em seguida, insira o suporte de transferência SEM.

Em seguida, use uma faca fria para abrir as tampas protetoras das ranhuras da grade TEM. Desligue a alta tensão no feixe de íons focalizado SEM e abra a câmara de ar interna. Em seguida, use o VTD para transferir o suporte de SEM para a câmara de amostra.

Quando o suporte do SEM estiver no frio stage, desengate o VTD empurrando e girando. Retraia a haste VTD totalmente para dentro da câmara de vácuo VTD e feche a câmara de ar interna, a câmara de ar externa e a vedação VTD. Neste ponto, aqueça o gás precursor a 24 a 26 graus Celsius e posicione o sistema de injeção de gás ou agulha GIS a uma altura de cerca de um milímetro acima da superfície da amostra.

Durante a imagem com o feixe de elétrons, abra a válvula de gás por alguns segundos. Em seguida, cure o depósito sobre a região de interesse, ou ROI, usando um feixe de íons de 1000 pico ampire em baixa ampliação. Após a cura, incline a amostra a 52 graus para que a superfície fique perpendicular ao feixe de íons.

Moinho. Duas trincheiras terroristas. Em ambos os lados da ROI, incline a amostra de volta a zero grau e use o feixe de íons para cortar as laterais e a parte inferior da lamela, certificando-se de que as marcas de corte passem por toda a lamela.

Uma vez inserida a agulha GIS, manobre o nano manipulador até que sua ponta esteja em contato físico com a lamela, de preferência na lateral. Abra a válvula GIS por alguns segundos e monitore a deposição criogênica por meio de imagens contínuas com o feixe de elétrons. Quando uma camada adicional de um a dois micrômetros de platina tiver sido depositada criogênica, feche a válvula após esta cura a platina apenas nos poucos micrômetros ao redor do ponto onde o nano manipulador está em contato com a lamela.

Em seguida, use uma corrente de feixe de íons alta para cortar a lamela. Manobre cuidadosamente o nano manipulador para extrair a lamela das trincheiras e mova-a pelo menos 500 micrômetros acima da superfície da amostra. Depois de retrair a agulha, abaixe o sample stage alguns milímetros e mova-o até que uma das grades MET esteja à vista.

Mova a área de fixação na grade para a posição de trabalho e insira a agulha GIS. Em seguida, manobre cuidadosamente o nano manipulador para colocar a lamela anexada em contato físico com a área de fixação na grade TEM, abra a válvula de gás por alguns segundos e deposite criogogicamente uma camada adicional de um a dois micrômetros de platina para curar a platina apenas em alguns micrômetros ao redor do ponto de contato entre a lamela e a grade MET. Em seguida, use uma alta corrente de feixe de íons para cortar a lamela do nano manipulador.

Incline a amostra para 52 graus e use o feixe de íons para diluí-la até a transparência dos elétrons. Depois de lavar a estação de transferência criogênica com gás nitrogênio seco, insira o suporte MET de transferência criogênica no slot apropriado da estação de transferência criogênica e encha com nitrogênio líquido. Em seguida, mergulhe uma chave de fenda, a ferramenta de fixação de amostra TEM e uma pinça em um copo criogênico cheio de nitrogênio líquido para resfriar suas pontas até a temperatura desejada.

Uma vez que o VTD esteja combinado com a câmara de ar externa, leve o frio stage para a altura de transferência de 16 milímetros. Depois de desligar a alta tensão, abra a vedação VTD, a câmara de ar externa e a câmara de ar interna. Em seguida, use a haste VTD para travar no suporte de transferência SEM empurrando e girando no sentido horário.

Neste ponto, retraia o suporte de transferência SEM para a câmara de preparação criogênica. Use a faca fria para fechar as tampas protetoras das grades TEM. Em seguida, use a haste VTD para mover a amostra para a câmara de vácuo do fechamento do VTD e selar a câmara de descompressão.

Em seguida, ventile a câmara de ar externa e desconecte o VTD. Combine o VTD com a porta SEM da estação de transferência criogênica. Durante a lavagem com nitrogênio seco, use o pino na estação para abrir a vedação do VTD e deslize o suporte de transferência SEM no executor da estação de transferência criogênica.

Usando a chave de fenda resfriada, abra uma das tampas e solte o parafuso correspondente, mantendo a grade MET no lugar. Em seguida, pegue a grade TEM e coloque-a no suporte TEM usando a pinça resfriada. Em seguida, fixe a grade MET no suporte TEM.

Usando o anel sextavado resfriado, feche o obturador do suporte MET de transferência criogênica e desconecte a estação de transferência criogênica do sistema de bombeamento. Transporte a estação e o controlador do aquecedor do suporte TEM perto do TEM e reconecte-os. Defina o estágio de amostra TEM para uma inclinação de 70 graus negativos.

Em seguida, defina o menor tempo de bombeamento para a câmara de ar com apenas um ciclo de purga com gás nitrogênio seco. Remova o suporte MET da estação de transferência criogênica e insira-o no primeiro stage do goniômetro inclinado, que iniciará o ciclo de bombeamento. Quando o ciclo estiver concluído, ajuste o goniômetro para inclinar de volta a zero graus enquanto segura o suporte MET para que ele não gire com o goniômetro.

Em seguida, insira o suporte através do goniômetro totalmente dentro do TEM. Finalmente, reabasteça o doer de suporte TEM de transferência criogênica com nitrogênio líquido. Neste método, os esporos de aspergillus Niger são primeiro fotografados por MEV para identificar o local de extração.

Uma seção transversal de qualquer esporo é suficiente, mas é possível posicionar o ROI para extração com precisão submicrométrica para cortar uma célula específica a uma distância específica da membrana celular. Uma vez identificada a característica de interesse, a primeira etapa da deposição criogênica é implementada Para proteger a amostra de danos ao feixe durante a moagem de íons, a amostra é inclinada a 52 graus, seguida pela pulverização catódica de duas trincheiras em ambos os lados da mela. A amostra é então inclinada para trás e fresada ainda mais, deixando apenas duas pequenas pontes conectando-a ao volume.

O nano manipulador resfriado é colocado em contato com a mela e outra deposição criogênica de platina os solda. As pequenas pontes de conexão são fresadas e o nano manipulador move a lamela perto da área de fixação do grau TEM, onde é soldada com uma deposição criogênica final de platina. O nano manipulador é então separado da lamela, que é fina até a transparência dos elétrons.

Com o feixe de íons, a lamela é transferida para o MET, onde espectroscopia de imagem de alta resolução, tomografia e outras técnicas podem ser empregadas. Este método contribuirá para entender as interfaces da matéria mole do coração em sistemas como neurossondas ou implantes ósseos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras de crio TM que são o artefato três e que podem ser extraídas de uma região específica de uma amostra de bug com precisão submicrométrica.