Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas

O objetivo geral deste procedimento é examinar as interações entre células raras de câncer de próstata e células endoteliais que expressam e selectina usando um conjunto de fluxo micro slide. Isso é feito primeiro revestindo uma micro lâmina com fibronectina. O segundo passo é cultivar células endoteliais da veia umbilical humana ou VE em um sistema de fluxo dinâmico em uma micro lâmina com uma pequena largura de canal.

Em seguida, as células do câncer de próstata são marcadas com um antígeno de membrana específico da próstata ou anticorpo monoclonal humanizado PSMA, que é internalizado. A etapa final é perfundir as células de câncer de próstata marcadas com anti-PSMA sobre a e-selectina que expressa ve. Em última análise, a microscopia de vídeo é usada para mostrar as interações entre as células do câncer de próstata e as células endoteliais.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como câmara de fluxo de placas paralelas e outros conjuntos dinâmicos, é que com esta técnica você pode examinar as interações entre células raras de câncer de próstata, como células tumorais circulantes e células endoteliais cultivadas em um sistema de fluxo dinâmico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase, como as células tumorais da próstata eles metastatizam através do sistema vascular sanguíneo? Eles usam o mesmo mecanismo usado pelos leucócitos durante sua ização?

Geralmente, os indivíduos que são novos nessa técnica terão dificuldades porque envolve a cultura de uma monocamada de células endoteliais em um canal estreito sob perfusão sob o capuz de cultura de tecidos. Primeiro, enxágue a microlâmina com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Em seguida, cubra suavemente a micro lâmina com 200 microlitros de 50 microgramas por mililitro de fibronectina usando uma seringa de bloqueio de isca de um mililitro.

Cubra a micro lâmina com a tampa e mantenha-a dentro da capa de cultura de tecidos por 30 minutos. Em seguida, perfunda 200 microlitros de meio de crescimento qve quente sobre a micro lâmina e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. A distribuição lenta do líquido na micro lâmina evita a formação de bolhas no canal.

Durante a perfusão, prepare a suspensão vex enxaguando vex com PBS e adicionando 0,1% de colagenase mais 0,05% de EDTA em PBS por um a dois minutos em temperatura ambiente. Centrifugue o gota em dois mililitros de meio de crescimento a 180 vezes G por cinco minutos. Em seguida, meça a concentração de células usando um hemocitômetro e prepare 10 milhões de células por 100 microlitros de meio de crescimento.

Em seguida, remova cuidadosamente o meio da entrada da microlâmina. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, leve a micro lâmina ao nível dos olhos e, usando uma seringa de trava de isca de um mililitro, perfu suavemente 200 microlitros da concentração preparada de vex no canal. É necessário cuidado nesta etapa para evitar a formação de bolhas se as bolhas aparecerem, continue perfundindo por um tempo um pouco mais longo até que as bolhas entrem no canal de saída.

Em seguida, pipete um volume igual de aproximadamente 80 microlitros de meio VE na entrada e na saída da microlâmina. Isso impede o fluxo de células em qualquer direção. Cubra o slide e mantenha-o em uma incubadora de 37 graus Celsius por 1,5 horas.

Para iniciar a montagem da câmara de fluxo, coloque uma seringa estéril de 20 mililitros, conectores de isca fêmea e macho, uma bomba de seringa e tubulação na incubadora por 15 minutos para um volume morto mínimo. Tubulação usada com diâmetro interno de 0,04 polegadas. O diâmetro menor da tubulação evita a formação de bolhas.

Em seguida, encha a seringa de 20 mililitros com 12 mililitros de meio VE quente. Remova completamente a bolha da seringa. Encha a entrada da micro corrediça com meio VE.

Conecte este conjunto à micro corrediça. Conecte cuidadosamente o conector de saída à micro corrediça. Traga a configuração para a incubadora e conecte-a à bomba de seringa.

Em seguida, defina a bomba para uma taxa de cisalhamento de 10 microlitros por minuto antes de deixar as células durante a noite na incubadora a 37 graus Celsius. No dia seguinte, desmonte a configuração removendo o conector conectado à entrada da micro corrediça. Em seguida, remova o conector de saída dois para regular positivamente e expressão de selectina nas células endoteliais.

Prepare um meio de crescimento fresco contendo interleucina uma beta. Aspirar o meio numa seringa de 10 mililitros. Remova o meio restante da entrada da lâmina e, em seguida, adicione o meio fresco preenchendo completamente a entrada.

Conecte a seringa à lâmina. Defina a bomba de seringa a uma taxa de cisalhamento de 10 microlitros por minuto por quatro horas na incubadora durante a incubação de interleucina uma beta de vex, prepare células de câncer de próstata marcadas com anticorpos anti PSMA Alexa 4 88. Primeiro, adicione 0,05% de tripsina EDTA às células de câncer de próstata MDA por um minuto.

Não exponha as células à tripsina por mais tempo, pois isso pode afetar os glicopeptídeos presentes na superfície celular. Centrifugar as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, ressuspenda o palato celular MDA em um mililitro de Hank's Buffer e adicione o anticorpo anti-PSMA incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em local escuro, suspendendo novamente as células durante a incubação.

Após 30 minutos, centrifugue a solução celular a 800 vezes G por cinco minutos. Aspire e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de Hank. Conte as células MDA marcadas e leve a concentração final a 1 milhão de células por mililitro.

Encha uma seringa de cinco mililitros com as células MDA marcadas e remova as bolhas. Ligue o microscópio invertido e ajuste a iluminação do modelador em 10 x objetiva. Coloque a bomba de seringa no mesmo nível do estágio de amostra do microscópio e ajuste-o em uma moeda de dez centavos por centímetro quadrado de tensão de cisalhamento.

Em seguida, abra o software de visão Zeiss Axio. Selecione o objetivo na tela do computador. Crie uma nova pasta na opção de ferramentas no software.

Abra a opção de experimentos inteligentes no Axio Vision e ajuste as configurações para gravar vídeos curtos do 32º por 30 minutos Para vídeo fluorescente ao vivo, defina as opções de imagem. Esses parâmetros ajudam a obter vídeos próximos à taxa de quadros de vídeo com a câmera Zeiss MRM para visualizar a largura total do canal de fluxo a 10 x objetiva na tela do computador, use um interruptor adaptador de montagem CM na lâmpada de mercúrio antes de colocar a seringa e o conector contendo as células na bomba de seringa. Em seguida, conecte o conector ao canal de entrada preenchido da micro lâmina contendo interleucina um machado estimulado beta.

Conecte o canal de saída com o conector conectado à tubulação. Coloque o tubo em um prato ou em um tubo cônico de 15 mililitros para coletar o fluxo. Inicie a infusão através da micro lâmina a 10 microlitros por minuto.

Observe as interações entre as células endoteliais e as células MDA marcadas ou CTCs marcadas derivadas de pacientes com menos de 488 nanômetros. Filtro no microscópio de epifluorescência. Comece a gravar o experimento como 32º vídeos curtos.

Durante a análise de reprodução, meça a velocidade de rolamento. A velocidade de rolamento é medida dividindo a distância percorrida pelas células ao longo do tempo. Aqui é mostrada uma cultura noturna de uma monocamada de células endoteliais.

No micro slide. As escalas mostram que 100% da micro lâmina é visível usando uma objetiva de cinco x, enquanto 70% é visível usando uma objetiva de 10 x para interações mediadas selecionadas, as células rolando nas bordas não são consideradas, o que torna mais de 70% da micro lâmina disponível para gravação de vídeo e análise de reprodução. O gráfico de caixa mostra a distribuição das velocidades de rolamento de células MDA não marcadas e anti-PSMA, marcadas em células endoteliais estimuladas por interleucina e beta em diferentes condições de estresse de cisalhamento.

Nenhuma diferença significativa foi observada nas velocidades de rolamento em um e cinco dines centímetro quadrado em maior tensão de 10 centavos por centímetro quadrado. Uma diferença estatisticamente significativa foi observada entre as velocidades de rolamento de células MDA não marcadas e anti-PSMA, marcadas, Um vídeo costurado no tempo feito com o sangue de um paciente com câncer de próstata mostra três tipos de interações entre CTCs de próstata marcadas e células endoteliais que expressam lectina, amarrando onde as CTCs se ligam e reconectam adesão estável onde as CTCs não se desprendem mesmo após 30 segundos e nenhuma interação quando as CTCs não interativas entram no campo de visão. As microlâminas podem ser facilmente imunocoradas e visualizadas com fluorescência da adesão firme de células MDA anti-PSMA, marcadas.

Após a profusão sobre a interleucina, uma célula endotelial beta estimulada pode ser vista aqui. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como examinar as interações entre células raras, como células tumorais de próstata circulantes e células endoteliais que expressam S selectina após este procedimento. Outros métodos, como a imunofluorescência, também podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a presença de s selectina. Ligands.

Técnicas como essas podem ajudar os pesquisadores a entender as diferentes etapas envolvidas na metástase.