Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas

O objetivo geral deste procedimento é examinar as interações entre células raras de câncer de próstata e células endoteliais que expressam e selectina, utilizando um conjunto de fluxo com lâmina microscópica. Isso é realizado primeiramente revestindo uma lâmina microscópica com fibronectina. O segundo passo consiste em cultivar células endoteliais de veia umbilical humana ou VE em um sistema de fluxo dinâmico sobre uma lâmina microscópica com largura de canal pequena.

Em seguida, as células de câncer de próstata são marcadas com um anticorpo monoclonal humanizado anti-antígeno de membrana específico da próstata ou PSMA, que é internalizado. O passo final consiste em perfundir as células de câncer de próstata marcadas com anti-PSMA sobre as VE que expressam E-selectina. Por fim, a microscopia de vídeo é utilizada para demonstrar as interações entre as células de câncer de próstata e as células endoteliais.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a câmara de fluxo em placas paralelas e outros conjuntos dinâmicos, é que com esta técnica é possível examinar as interações entre células raras de câncer de próstata, como células tumorais circulantes e células endoteliais cultivadas, em um sistema de fluxo dinâmico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de metástase, como: como as células tumorais de próstata metastatizam através do sistema vascular sanguíneo? Elas utilizam o mesmo mecanismo empregado pelos leucócitos durante sua diapedese?

De modo geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois ela envolve o cultivo de uma monocamada de células endoteliais em um canal estreito sob perfusão sob a capela de cultura de tecidos. Primeiro, enxágue a lâmina microscópica com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Em seguida, recubra suavemente a lâmina microscópica com 200 microlitros de fibronectina a 50 microgramas por mililitro usando uma seringa de bloqueio de encaixe de um mililitro.

Cubra a lâmina microscópica com a tampa e mantenha-a dentro da cabine de cultura de tecidos por 30 minutos. Em seguida, perfunda 200 microlitros de meio de crescimento qve morno sobre a lâmina microscópica e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. A dispensação lenta do líquido na lâmina microscópica evita a formação de bolhas no canal.

Durante a perfusão, prepare a suspensão de vex lavando o vex com PBS e adicionando colagenase 0,1% mais EDTA 0,05% em PBS por um a dois minutos à temperatura ambiente. Centrifugue o hve em dois mililitros de meio de crescimento a 180 ×g por cinco minutos. Em seguida, meça a concentração celular utilizando um hemocitômetro e prepare 10 milhões de células por 100 microlitros de meio de crescimento.

Em seguida, remova cuidadosamente o meio da entrada da microplaca. Utilizando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, posicione a microplaca ao nível dos olhos e, com uma seringa de bloqueio de um mililitro, perfunda suavemente 200 microlitros da concentração preparada de vex no canal. É necessário ter cautela nesta etapa para evitar a formação de bolhas; caso apareçam bolhas, continue a perfusão por um tempo ligeiramente mais longo até que as bolhas entrem no canal de saída.

A seguir, pipete um volume igual de aproximadamente 80 microlitros de meio VE para dentro da entrada e da saída do microcâmara. Isso evita o fluxo de células em qualquer direção. Cubra a câmara e mantenha-a em uma incubadora a 37 graus Celsius por 1,5 hora.

Para iniciar a montagem da câmara de fluxo, coloque uma seringa estéril de 20 mililitros, conectores fêmea e macho do tipo lure, uma bomba de seringa e tubos no incubador por 15 minutos para volume morto mínimo. Utilize tubos com diâmetro interno de 0,04 polegadas. Um diâmetro menor do tubo evita a formação de bolhas.

Em seguida, encha a seringa de 20 mililitros com 12 mililitros de meio VE morno. Remova completamente a bolha da seringa. Encha a entrada do microscópio com meio VE.

Conecte esta montagem ao lâmina microscópica. Fixe suavemente o conector de saída à lâmina microscópica. Leve o conjunto para o incubador e conecte-o à bomba de seringa.

Em seguida, ajuste a bomba para uma taxa de cisalhamento de 10 microlitros por minuto antes de deixar as células durante a noite no incubador a 37 graus Celsius. No dia seguinte, desmonte o conjunto removendo o conector ligado à entrada do lâmina microscópica. Em seguida, remova o conector de saída dois para aumentar a expressão de e-selectina em células endoteliais.

Prepare meio de crescimento fresco contendo interleucina um beta. Aspire o meio com uma seringa de 10 mililitros. Remova o meio remanescente da entrada da lâmina, então adicione meio fresco, preenchendo completamente a entrada.

Conecte a seringa ao lâmina. Ajuste a bomba de seringa em uma taxa de cisalhamento de 10 microlitros por minuto por quatro horas no incubador durante a incubação com interleucina um beta de vex, prepare células de câncer de próstata marcadas com anticorpo anti-PSMA Alexa 488. Primeiro, adicione tripsina EDTA 0,05% às células de câncer de próstata MDA por um minuto.

Não exponha as células à tripsina por períodos mais longos, pois isso pode afetar os glicopeptídeos presentes na superfície celular. Centrifugue as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, re-suspenda o palato celular MDA em um mililitro de solução tampão de Hank e adicione o anticorpo anti-PSMA, incubando por 30 minutos à temperatura ambiente em local escuro, re-suspendendo as células durante a incubação.

Após 30 minutos, centrifugue a solução celular a 800 vezes G durante cinco minutos. Aspire e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de Hank. Conte as células MDA marcadas e ajuste a concentração final para 1 milhão de células por mililitro.

Encha uma seringa de cinco mililitros com as células MDA marcadas e remova as bolhas. Ligue o microscópio invertido e ajuste a iluminação de campo claro no objetivo de 10 x. Posicione a bomba de seringa no mesmo nível da platina do microscópio e configure-a para um cisalhamento de um dime por centímetro quadrado.

Em seguida, abra o software Zeiss Axio Vision. Selecione o objetivo na tela do computador. Crie uma nova pasta na opção ferramentas do software.

Abra a opção de experimentos inteligentes no Axio Vision e ajuste as configurações para gravar vídeos curtos de 1/32 de segundo durante 30 minutos. Para o vídeo fluorescente em tempo real, defina as opções de imagem. Esses parâmetros ajudam a obter vídeos próximos à taxa de quadros com a câmera Zeiss MRM para visualizar a largura total do canal de fluxo com objetivo de 10x na tela do computador. Use um adaptador tipo CM e ligue a lâmpada de mercúrio antes de colocar a seringa e o conector contendo as células na bomba de seringa. Em seguida, conecte o conector ao canal de entrada preenchido da microplaca contendo ax estimulado por interleucina um beta.

Conecte o canal de saída ao conector preso ao tubo. Coloque o tubo em um recipiente ou em um tubo cônico de 15 mililitros para coletar o fluxo que passa. Inicie a infusão através do microslide a 10 microlitros por minuto.

Observe as interações entre células endoteliais e células MDA marcadas ou CTCs marcadas derivadas de pacientes em 488 nanômetros. Filtre no microscópio de fluorescência epifluorescente. Inicie a gravação do experimento como 32 vídeos curtos.

Durante a análise de reprodução, meça a velocidade de rolamento. A velocidade de rolamento é medida dividindo a distância percorrida pelas células pelo tempo. É mostrado aqui um cultivo de uma noite de uma monocamada de células endoteliais.

No lâmina microscópica. As escalas indicam que 100% da lâmina microscópica é visível utilizando uma objetiva de cinco x, enquanto 70% são visíveis utilizando uma objetiva de 10 x para interações mediadas selecionadas; células rolantes nas bordas não são consideradas, o que torna mais de 70% da lâmina microscópica disponíveis para análise de gravação e reprodução de vídeo. O gráfico de caixas mostra a distribuição das velocidades de rolamento de células MDA não marcadas e marcadas com anti-PSMA sobre células endoteliais estimuladas com interleucina um beta sob diferentes condições de tensão de cisalhamento.

Nenhuma diferença significativa foi observada nas velocidades de rolamento a um e cinco centímetros quadrados sob estresse cisalhante mais alto de 10 dinas por centímetro quadrado. Uma diferença estatisticamente significativa foi observada entre as velocidades de rolamento de células MDA não marcadas e marcadas com anti-PSMA. Um vídeo composto por imagens consecutivas, obtido usando sangue de um paciente com câncer de próstata, mostra três tipos de interações entre CTCs da próstata marcadas e células endoteliais expressando lectina: fixação, na qual as CTCs se ligam e religam; adesão estável, na qual as CTCs não se destacam mesmo após 30 segundos; e ausência de interações, quando CTCs não interativas entram no campo de visão. Lâminas de microscopia podem ser facilmente imunomarcadas e visualizadas por fluorescência para demonstrar a adesão firme de células MDA marcadas com anti-PSMA.

Após a profusão sobre células endoteliais estimuladas pela interleucina um beta, pode-se observar aqui. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar as interações entre células raras, como células tumorais prostáticas circulantes, e células endoteliais que expressam S-seletina, seguindo este procedimento. Outros métodos, como imunofluorescência, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a presença de ligantes da S-seletina.

Técnicas como essas podem ajudar os pesquisadores a compreender diferentes etapas envolvidas na metástase.