Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a biologia distinta na interface entre células epiteliais malignas na frente invasiva do tumor e células estromais associadas ao câncer. Isso é realizado primeiramente estabelecendo culturas primárias de fibroblastos a partir de implantes colônicos. O segundo passo consiste em construir modelos de co-cultura organotípica utilizando fibroblastos colônicos primários e células de câncer colorretal cultivadas.

Os próximos modelos organotípicos são fixados em formalina, seccionados e montados em lâminas com membrana, sendo então corados com violeta cristal. O passo final é a microdissecção a laser, com o objetivo de separar células tumorais invasoras de células tumorais não invasoras e células estromais associadas ao câncer. Por fim, técnicas de perfil molecular podem ser utilizadas para caracterizar a biologia das células tumorais invasoras e não invasoras, bem como das células estromais no microambiente tumoral circundante.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao percebermos quão claramente distinguíveis são as células invasoras das células não invasoras em modelos tridimensionais de co-cultura organotípica de câncer colorretal. Para começar, obtenha amostras de tecido da mucosa do cólon humano normal diretamente do centro cirúrgico para o laboratório. Coloque um espécime no centro de uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros e, em seguida, lave a cultura três vezes com solução salina tamponada com fosfato ou PBS suplementada com penicilina, estreptomicina e fungizona.

Não aspire após a lavagem final; com pinças estéreis e bisturi, corte o tecido em pequenos pedaços. Em seguida, posicione cada pedaço no centro de uma cruz desenhada com a lâmina do bisturi. Em uma placa de 12 poços, movimente suavemente o bisturi sobre o tecido para permitir sua adesão à cultura.

Os espécimes em 750 microlitros de meio de crescimento primário para fibroblastos, que deve submergir o tecido sem permitir que ele flutue. Em seguida, coloque os espécimes em um incubador a 37 graus Celsius, com 5 a 10% de CO2, pelos próximos cinco dias. Os fibroblastos começarão lentamente a crescer a partir da borda do tecido em aproximadamente sete dias.

Isso ficará mais visível após aproximadamente três a quatro semanas. E se houver fibroblastos suficientes crescendo, adicione 750 microlitros de tripsina a cada poço após as células se desatarem, colete-as e transfira-as para um frasco de cultura de tecidos T 25 para o gel organotípico impregnado com fibroblastos. Primeiro, prepare uma suspensão celular de fibroblastos contendo 500.000 células por gel em dmm suplementado.

Prepare os géis organotípicos em gelo nas proporções indicadas no protocolo do texto, para nove géis de um mililitro cada. Prepare 10 mililitros e misture suavemente para evitar bolhas. Em seguida, adicione um mililitro a cada poço de uma placa de 24 poços e incube por uma hora a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada.

Após uma hora, para permitir que os géis solidifiquem, adicione um mililitro de DM EM suplementado sobre os géis e retorne à incubadora durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio do topo dos géis e plaque um mililitro de meio contendo 500.000 células epiteliais de câncer colorretal nas lâminas de náilon revestidas com gel.

Prepare com antecedência folhas de náilon estéreis para autoclave medindo 1,5 centímetro por 1,5 centímetro usando pinças estéreis. Coloque o número necessário de folhas de náilon em uma placa de cultura de 10 centímetros. Prepare a mistura de gelo conforme descrito no protocolo do texto e adicione hidróxido de sódio 0,1 molar à mistura de gel até que fique rosa, indicando que a solução foi neutralizada.

Em seguida, adicione 250 microlitros dessa solução a cada folha de náilon. Incube então a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5%CO2 por 30 minutos para permitir que o gel se forme. A seguir, adicione 10 mililitros de uma solução de 1% de glutaraldeído em PBS a cada placa de cultura de 10 centímetros.

Uma vez que o gel tenha solidificado, incube a quatro graus Celsius por uma hora, depois lave as lâminas de náilon três vezes em PBS e uma vez em dme suplementado. Incube as lâminas durante a noite no mesmo tampão a quatro graus Celsius para elevar os géis organotípicos sobre grades de aço para invasão, grades de sustentação esterilizadas que foram preparadas dobrando lâminas de aço inoxidável em uma formação de tripé. Em seguida, use pinças, esterilizadas e com etanol, para colocar uma grade de aço em cada poço de uma placa de seis poços.

Coloque uma folha de náilon revestida com gel com o lado de colágeno voltado para cima sobre cada grade. Transfira cuidadosamente os géis organotípicos da placa de 24 poços para a folha de náilon elevada usando uma espátula, esterilizada e com etanol. Encha o poço com DMEM suplementado até que a folha de náilon entre em contato com o meio, mas sem ficar submersa.

Certifique-se de que o meio não toque o gel organotípico. Incube por 14 dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5%CO2. Substitua o meio a cada dois dias.

Remova todo o organotípico, incluindo a folha de náilon, do poço e coloque-o sobre uma película aderente. Divida ao meio o organotípico e a folha de náilon utilizando um bisturi descartável limpo e fixe ambas as metades em formaldeído por 24 horas. À temperatura ambiente, após 24 horas, substitua o formaldeído por etanol 70% e deixe durante a noite antes da inclusão em parafina, seccionamento e coloração para realizar a microdissecção a laser.

Primeira seção, o corte organotípico com espessura de 10 mícrons sobre lâminas com membrana. Após tratar os cortes conforme descrito no protocolo do texto, prepare-se para realizar a microdissecção a laser utilizando a plataforma escolhida. Coloque a lâmina de vidro com o corte corado a ser microdissecado.

Com o microscópio virado para baixo no estágio, monte um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro na cassete de coleta e adicione 50 microlitros de tampão de lise celular à tampa, onde o tecido microdissecado será coletado sob visão direta. Use o joystick para identificar o tecido de interesse e, por meio da interface do software, anote a seção orgânica corada, destacando as células a serem microdissecadas na frente de invasão tumoral. Instrua o laser a disparar, o que deve remover a seção destacada e propelir o tecido microdissecado para dentro da tampa do tubo microcentrífugo.

Prossiga com o processamento das amostras por um método apropriado para extrair o analito de interesse. Imagens de microdissecção a laser de células cancerígenas colorretais SW 480 invadindo o estroma organotípico são mostradas aqui. Violeta de genciana é usado para destacar as células epiteliais cancerígenas colorretais.

As ilhas tumorais invasivas são então definidas antes da microdissecção a laser, e o fragmento cortado é transportado para um dispositivo de coleta. Células não invasivas e células estromais são identificadas e isoladas utilizando a mesma metodologia. Os cultivos co-tridimensionais foram analisados por meio de perfilagem de microRNA para comparação dos microRNAs diferencialmente expressos entre as células na frente invasiva do tumor e aquelas nas zonas tumorais estratificadas.

Os dados foram classificados por alteração completa e valores de dados maiores ou menores que duas vezes. São apresentadas as alterações de um experimento representativo, mostrando a expressão diferencial de genes de microRNA entre as células da margem invasiva e as células da margem não invasiva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como construir modelos organotípicos anatomicamente apropriados e de como usar a microdissecção a laser para isolar populações individuais de células para estudos posteriores.Opa.