Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e Ex vivo Os fibroblastos

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a biologia distinta na interface entre as células epiteliais malignas na frente invasiva do tumor e as células estromais associadas ao câncer. Isso é feito estabelecendo primeiro culturas primárias de fibroblastos a partir de implantes colônicos. O segundo passo é construir modelos de co-cultura organotípica usando fibroblastos colônicos primários e células de câncer colorretal cultivadas.

Os modelos organotípicos seguintes são fixados em formina, seccionados em lâminas montadas em membrana e corados com violeta crestal. A etapa final é a microdissecção a laser, a fim de separar as células tumorais invasoras das células tumorais não invasoras e das células estromais associadas ao câncer. Em última análise, técnicas de perfil molecular podem ser usadas para caracterizar a biologia de células tumorais invasoras e não invasoras e células estromais no microambiente tumoral circundante.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos como as células invasoras são claramente distinguíveis das células não invasoras em modelos tridimensionais de co-cultura organotípica de câncer colorretal. Para começar, obtenha amostras de tecido normal da mucosa do cólon humano diretamente da sala de cirurgia no laboratório. Coloque uma amostra no centro de uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e, em seguida, lave a cultura três vezes com solução salina tamponada com fosfato ou PBS suplementado com penicilina, estreptomicina e zona de fungos.

Não aspire após a lavagem final com pinça estéril e bisturi, corte o tecido em pedaços pequenos. Em seguida, coloque cada peça no centro de uma cruz desenhada com a lâmina do bisturi. Em uma placa de 12 poços, balance o bisturi suavemente sobre o tecido para permitir que ele adira à cultura.

Os espécimes em 750 microlitros de meios primários de crescimento de fibroblastos, que devem submergir o tecido sem permitir que ele flutue. Em seguida, coloque as amostras em uma incubadora de 37 graus Celsius, cinco a 10% de CO2 nos próximos cinco dias. Os fibroblastos começarão a crescer lentamente a partir da borda do tecido em aproximadamente sete dias.

Isso será mais visível após aproximadamente três a quatro semanas. E se houver fibroblastos suficientes crescendo, adicione 750 microlitros de tripsina a cada poço após as células terem se destacado e transfira-os para um frasco de cultura de tecidos T 25 para o gel organotípico impregnado com fibroblastos. Primeiro, prepare uma suspensão de células de fibroblastos contendo 500.000 células por gel em dmm suplementado.

Completar os géis organotípicos no gelo nas proporções encontradas no protocolo de texto para nove géis a um mililitro por gel. Prepare 10 mililitros e misture delicadamente para evitar bolhas. Em seguida, adicione um mililitro a cada poço de uma placa de 24 poços e incube por uma hora a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada.

Para permitir que os géis endureçam após uma hora, adicione um mililitro de DM EM suplementado em cima dos géis e retorne à incubadora durante a noite. No dia seguinte. Aspire o meio da parte superior dos géis e coloque um mililitro de meio contendo 500.000 células epiteliais de câncer colorretal para as folhas de náilon revestidas com gel.

Prepare folhas de náilon de autoclaves estéreis medindo 1,5 centímetros por 1,5 centímetros com antecedência usando pinças estéreis. Coloque o número necessário de folhas de náilon em uma placa de cultura de 10 centímetros. Prepare a mistura de gel no gelo conforme descrito no protocolo de texto e adicione hidróxido de sódio 0,1 molar à mistura de gel até que fique rosa, indicando que a solução foi neutralizada.

Em seguida, adicione 250 microlitros desta solução a cada folha de náilon. Em seguida, incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 por 30 minutos para permitir que o gel endureça. Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de glutaraldeído a 1% em PBS a cada placa de cultura de 10 centímetros.

Uma vez que o gel tenha endurecido antes de incubar a quatro graus Celsius por uma hora, lave as folhas de náilon três vezes em PBS e uma vez em dme suplementado. Incube as folhas durante a noite no mesmo tampão a quatro graus Celsius para elevar os géis organotípicos em grades de aço para grades de andaimes esterilizadas por invasão que foram preparadas dobrando chapas de aço inoxidável em uma formação de tripé. Em seguida, use uma pinça, esterilizada e etanol para colocar uma grade de aço em cada poço de uma placa de seis poços.

Coloque uma folha de nylon revestida com gel com o lado do colágeno para cima em cada grade. Transfira cuidadosamente os géis organotípicos da placa de 24 poços para a folha de náilon elevada usando uma espátula, esterilizada e etanol. Encha o poço com D mem suplementado até que a folha de náilon esteja em contato com o meio, mas não submersa.

Certifique-se de que o meio não toque no gel organotípico. Incubar durante 14 dias a 37 graus Celsius numa atmosfera humidificada de 5% de CO2. Substituir o meio a cada dois dias.

Remova todo o organotípico, incluindo a folha de náilon, do poço e coloque-o sobre um filme aderente. Dividir a folha organotípica e de nylon com um bisturi descartável limpo e fixar ambas as metades em formaldeído durante 24 horas. À temperatura ambiente, substitua o formaldeído por etanol a 70% após 24 horas e deixe durante a noite antes de incorporar em parafina, seccionar e colorir para realizar a microdissecção a laser.

Primeira seção, o organotípico com 10 mícrons de espessura em lâminas montadas em membrana. Depois de tratar as seções conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para realizar o microdissecamento a laser usando a forma de plataforma escolhida. Coloque a lâmina de vidro com a seção de mancha a ser micro dissecada.

Com a face voltada para baixo no estágio do microscópio, monte um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro no de coleta e adicione 50 microlitros de tampão de lise celular à tampa na qual o tecido microdissecado será coletado sob visão direta. Use o joystick para identificar o tecido de interesse e, usando a interface do software, anote a seção orgânica corada, destacando as células a serem microdissecantes na frente de invasão do tumor. Instrua o laser a disparar, o que deve cortar a seção destacada e impulsionar o tecido microsecto para dentro da tampa do tubo da microcentrífuga.

Proceder ao tratamento das amostras por um método adequado para extrair a substância a analisar em causa. Imagens de microdissecção a laser de células de câncer colorretal SW 480 invadindo o estroma organotípico são mostradas aqui. A violeta de crista é usada para destacar as células epiteliais do câncer colorretal.

As ilhas tumorais invasivas são então definidas antes que ocorra a dissecção a laser e a peça cortada seja transportada para um dispositivo de coleta. Células não invasoras e células estromais são identificadas e isoladas usando a mesma metodologia. As coculturas tridimensionais foram analisadas por perfil de microRNA para comparação de microRNAs diferencialmente expressos entre células na frente do tumor invasivo e aquelas nas zonas tumorais estratificadas.

Os dados foram classificados por alteração total e valores de dados mais ou menos duas vezes. A mudança de um experimento representativo é apresentada mostrando a expressão diferencial do gene de micro RNA entre as células da margem invasiva e as células da margem não invasivas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como construir modelos organotípicos anatomicamente apropriados e como usar a microdissecção a laser para isolar populações individuais de células para estudos posteriores. Uau.