4.12: Criação de Zebrafish e Manipulação de Embriões

O peixe-zebra é um sistema modelo pequeno, mas poderoso. Esses peixes prolíficos podem gerar centenas de descendentes por semana e muitos milhares ao longo de suas vidas. O rápido desenvolvimento externo e os corpos transparentes tornam os embriões ideais para diversas aplicações. Este vídeo abordará os fundamentos da coleta e manuseio de embriões antes de descrever os métodos de pesquisa atuais que aproveitam os embriões de peixe-zebra.

Para gerar embriões, ajuda saber um pouco sobre o comportamento de acasalamento do peixe-zebra.

O peixe-zebra sofre reprodução sexuada, portanto, a reprodução requer peixes machos e fêmeas. Os machos têm corpos mais magros com uma tonalidade levemente vermelha, enquanto as fêmeas têm barrigas maiores e prateadas cheias de ovos.

O acasalamento periódico mantém os ovos saudáveis, mas fazer todos esses ovos dá muito trabalho, então as fêmeas individuais só devem ser acasaladas uma vez por semana.

Finalmente, como muitos outros animais, os processos sensoriais orientam o comportamento de acasalamento em peixes.

Dicas olfativas do macho ajudam a preparar sua amiga para desovar, enquanto um pouco de iluminação ambiente coloca os dois em ação.

Tendo aprendido a identificar peixes machos e fêmeas, é hora de montar uma cruz.

Para a reprodução de peixes-zebra, os pesquisadores usam tanques projetados especificamente para o acasalamento. Os tanques de reprodução geralmente apresentam uma inserção removível com orifícios que permitem que os ovos caiam. Esse recurso protege os ovos de serem comidos por peixes adultos famintos.

Para começar, combine peixes adultos em tanques de reprodução durante a tarde ou noite. Para coletar embriões em estágio inicial na manhã seguinte, separe os peixes machos e fêmeas com uma divisória, que os impede de se reproduzir antes de você estar pronto para iniciar um experimento. Para evitar que os peixes saltem, certifique-se de cobrir o tanque de reprodução com uma tampa. Em seguida, deixe os peixes se aclimatarem durante a noite.

Depois de passar a noite juntos em um tanque de reprodução, os peixes acasalarão na manhã seguinte.

O primeiro passo pela manhã é remover a divisória entre os peixes machos e fêmeas para iniciar a desova. Se uma divisória não for usada, o peixe botará ovos logo após o início da luz.

À medida que os machos perseguem as fêmeas ao redor do tanque, eles estimulam a desova de óvulos enquanto liberam espermatozóides na água para fertilização. Espere aproximadamente 15 a 30 minutos depois de puxar uma divisória para dar tempo ao peixe para acasalar. Em seguida, remova os adultos do tanque usando uma rede ou levantando a inserção do tanque e colocando os peixes em outro tanque.

Em seguida, despeje a água e os embriões em uma peneira de chá de malha para coleta. Então, usando "água de ovo", Lave os embriões da peneira em uma placa de Petri. Pode ser necessário transferir embriões entre placas para atingir uma densidade ideal de 50 - 100 por placa. Para garantir que o desenvolvimento prossiga em um ritmo normal, coloque os pratos em uma incubadora a 28,5 ° C.

Depois de obter seus embriões, manuseie-os com cuidado. Eles são importantes para seus experimentos! Vamos rever algumas dicas.

Para manter os embriões saudáveis, certifique-se de manter a água nas placas de Petri limpa e livre de detritos. Os embriões mortos serão opacos e devem ser removidos diariamente. Além disso, o azul de metileno pode ser adicionado à água para prevenir o crescimento de fungos.

Sempre que você precisar mover embriões de um prato para outro, use uma pipeta de transferência. Ao girar o prato, você pode concentrar os embriões no centro da placa, facilitando a pipetagem.

Alguns protocolos requerem algumas etapas adicionais para a manutenção do embrião. Nos primeiros três dias de vida, os embriões de peixe-zebra se desenvolvem dentro de um córion, o que pode impedir a manipulação do embrião. O córion pode ser removido por tratamento com a enzima proteolítica, pronase, ou usando uma pinça para removê-lo manualmente. Além disso, o peixe-zebra começa a desenvolver pigmento em 24 horas, como mostrado aqui nesta larva de peixe-zebra, o que pode interferir na microscopia. Para superar esse problema, os cientistas suplementam a água do embrião com PTU, que inibe a produção do pigmento melanina.

Agora que você sabe como obter e cuidar de embriões de peixe-zebra, vamos explorar algumas das maneiras pelas quais os pesquisadores os usam para descobertas científicas.

O desenvolvimento externo de embriões de peixe-zebra permite a manipulação genética por microinjeção de DNA, RNA ou reagentes de knockdown de genes. Este método leva a uma distribuição uniforme do material injetado em todo o embrião e pode produzir fenótipos visíveis resultantes da superexpressão ou perda de uma proteína. A mesma técnica também pode ser usada para fazer peixes transgênicos nos quais estruturas específicas são marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes.

Além disso, o pequeno tamanho dos embriões e larvas de peixe-zebra os torna ideais para triagem química fenotípica. Aqui, os embriões são carregados em placas de 96 poços e depois tratados com bibliotecas de pequenas moléculas, adicionando os produtos químicos à água. Mais tarde, essas placas de peixes são rastreadas quanto a defeitos morfológicos, como o desenvolvimento anormal mostrado aqui.

Finalmente, a transparência dos embriões de peixe-zebra os torna adequados para microscopia. Embriões vivos que expressam proteínas fluorescentes em tipos específicos de células podem ser montados e visualizados com microscopia confocal, permitindo que os pesquisadores examinem os movimentos celulares nos tecidos em desenvolvimento ao longo do tempo.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre reprodução de peixe-zebra e manuseio de embriões. Neste vídeo, discutimos os fundamentos do acasalamento, a criação de tanques de reprodução e o manuseio de embriões. Também discutimos alguns métodos de pesquisa que tiram proveito desse pequeno embrião poderoso. Obrigado por assistir!