Criação de Zebrafish e Manipulação de Embriões

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

4.1: Mouse Genotyping

4.3: Zebrafish Maintenance and Husbandry

57,141 Views

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07:48 min

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April 30, 2023

Overview

O zebrafish (Danio rerio) é um importante organismo modelo que é particularmente valioso para pesquisas em biologia do desenvolvimento. Os zebrafish são extremamente férteis e podem produzir centenas de descendentes por semana, por isso é relativamente fácil coletar um grande número de embriões para altos números amostrais. Além disso, os zebrafish passam por rápido desenvolvimento e os embriões são transparentes, permitindo uma fácil visualização dos processos de desenvolvimento.

Este vídeo abrange os passos necessários para a coleta de embriões de zebrafish recém-fertilizados. Uma breve visão geral do comportamento de acasalamento de zebrafish é apresentada, seguida de instruções para a instalação de cruzes em tanques especializados de reprodução de laboratório que permitem o acasalamento controlado. Também estão cobertas as condições necessárias para iniciar a liberação de ovos (conhecidos como desova) na manhã seguinte ao conjunto dos tanques. Em seguida, são apresentadas técnicas essenciais para o trabalho com embriões, incluindo a inibição do desenvolvimento de pigmentos com a PTU química, e a descorionação: um procedimento no qual a membrana semelhante à concha em torno do embrião (o acorde) é removida. Finalmente, o vídeo termina com algumas aplicações práticas dessas técnicas em pesquisa de desenvolvimento.

Procedure

Zebrafish são um pequeno, mas poderoso sistema de modelos. Esses peixes prolíficos podem gerar centenas de descendentes por semana e muitos milhares ao longo de suas vidas. Desenvolvimento externo rápido e corpos transparentes tornam os embriões ideais para diversas aplicações. Este vídeo abordará o básico da coleta e manuseio de embriões antes de descrever os métodos atuais de pesquisa que se aproveitam dos embriões de zebrafish.

Para gerar embriões, ajuda a saber um pouco sobre o comportamento de acasalamento de zebrafish.

Os zebrafish são submetidos à reprodução sexual, por isso a reprodução requer peixes machos e fêmeas. Os machos têm corpos mais finos com uma tonalidade ligeiramente vermelha, enquanto as fêmeas têm barrigas maiores e prateadas cheias de ovos.

O acasalamento periódico mantém os ovos saudáveis, mas fazer todos esses ovos requer muito trabalho, então as fêmeas individuais só devem ser acasaladas uma vez por semana.

Finalmente, como muitos outros animais, processos sensoriais guiam o comportamento de acasalamento em peixes.

Pistas olfativas do macho ajudam a deixar sua amiga pronta para desovar, enquanto um pouco de iluminação de humor coloca os dois em ação.

Tendo aprendido a identificar peixes machos e fêmeas, é hora de montar uma cruz.

Para a reprodução de zebrafish, os pesquisadores usam tanques especificamente projetados para acasalamento. Tanques de reprodução normalmente apresentam uma inserção removível com furos que permitem que os ovos caiam. Esta característica protege os ovos de serem comidos por peixes adultos famintos.

Para começar, misture peixes adultos em tanques de reprodução durante a tarde ou à noite. Para coletar embriões em estágio inicial na manhã seguinte, separe peixes machos e fêmeas com um divisor, o que os impede de procriar antes que você esteja pronto para começar um experimento. Para evitar que os peixes saltem para fora, certifique-se de cobrir o tanque de reprodução com uma tampa. Então, deixe os peixes se aclimatarem durante a noite.

Depois de passar a noite juntos em um tanque de reprodução, os peixes vão acasalar na manhã seguinte.

O primeiro passo da manhã é remover o divisor entre o peixe macho e fêmea para iniciar a desova. Se um divisor não for usado, o peixe colocará ovos logo após o início da luz.

Enquanto os machos perseguem as fêmeas ao redor do tanque, eles estimulam a desova de óvulos enquanto liberam esperma na água para fertilização. Espere aproximadamente 15 – 30 minutos depois de puxar um divisor para dar tempo ao peixe para acasalar. Em seguida, remova os adultos do tanque usando uma rede ou levantando a inserção do tanque e colocando o peixe em outro tanque.

Em seguida, despeje a água e os embriões através de um filtro de chá de malha para coleta. Em seguida, usando “água de ovo”, lave os embriões do coador em uma placa de petri. Pode ser necessário transferir embriões entre pratos para alcançar uma densidade ideal de 50 a 100 por prato. Para garantir que o desenvolvimento prossiga em um ritmo normal, coloque os pratos em uma incubadora a 28,5 °C.

Uma vez que você tem seus embriões, lidar com eles com cuidado. Eles são importantes para suas experiências! Vamos passar por cima de algumas dicas.

Para manter os embriões saudáveis, certifique-se de manter a água nas placas de petri limpas e livres de detritos. Embriões mortos serão opacos e devem ser removidos diariamente. Além disso, o azul de metileno pode ser adicionado à água para evitar o crescimento fúngico.

Sempre que você precisar mover embriões de um prato para outro, use um pipet de transferência. Ao rodar o prato, você pode concentrar os embriões no centro da placa, facilitando a pipetação.

Alguns protocolos exigem alguns passos adicionais para a manutenção de embriões. Nos primeiros três dias de vida, os embriões de zebrafish se desenvolvem dentro de um chorão, o que pode impedir a manipulação do embrião. O acorde pode ser removido por tratamento com a enzima proteolítica, pronase ou usando fórceps para removê-lo manualmente. Além disso, os zebrafish começam a desenvolver pigmento em 24 horas, como mostrado aqui nesta larva de zebrafish, que pode interferir com a microscopia. Para ver através desse problema, os cientistas complementam a água embrionária com PTU, o que inibe a produção do pigmento melanina.

Agora que você sabe como obter e cuidar de embriões de zebrafish, vamos explorar algumas das maneiras que os pesquisadores os usam para descobertas científicas.

O desenvolvimento externo de embriões de zebrafish permite manipulação genética por microinjeção de DNA, RNA ou reagentes de knockdown genético. Este método leva à distribuição uniforme de material injetado em todo o embrião e pode produzir fenótipos visíveis resultantes da superexpressão ou perda de uma proteína. A mesma técnica também pode ser usada para fazer peixes transgênicos nos quais estruturas específicas são marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes.

Além disso, o pequeno tamanho de embriões de zebrafish e larvas os tornam ideais para triagem química fenotípica. Aqui, os embriões são carregados em placas de 96 poços e, em seguida, tratados com bibliotecas de pequenas moléculas adicionando os produtos químicos na água. Mais tarde, essas placas de peixe são rastreadas para defeitos morfológicos, como o desenvolvimento anormal mostrado aqui.

Finalmente, a transparência dos embriões de zebrafish os torna adequados para microscopia. Embriões vivos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células específicas podem ser montados e visualizados com microscopia confocal, permitindo que os pesquisadores examinem os movimentos celulares no desenvolvimento de tecidos ao longo do tempo.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre reprodução de zebrafish e manuseio de embriões. Neste vídeo, discutimos o básico do acasalamento, criação de tanques de reprodução e manuseio de embriões. Também discutimos alguns métodos de pesquisa que se aproveitam desse poderoso embrião. Obrigado por assistir!

Transcript

Zebrafish are a small but powerful model system. These prolific fish can generate hundreds of offspring per week and many thousands over their lifetimes. Rapid external development and transparent bodies make the embryos ideal for diverse applications. This video will cover the basics of embryo collection and handling before describing current research methods that take advantage of zebrafish embryos.

In order to generate embryos, it helps to know a little bit about zebrafish mating behavior.

Zebrafish undergo sexual reproduction, so breeding requires both male and female fish. Males have slimmer bodies with a slightly red hue, while females have bigger, silver bellies full of eggs.

Periodic mating keeps eggs healthy, but making all those eggs takes a lot of work, so individual females should only be mated once per week.

Finally, like many other animals, sensory processes guide mating behavior in fish.

Olfactory cues from the male help to get his lady friend ready to spawn, while a little bit of mood lighting sets them both in action.

Having learned how to identify male and female fish, it’s time to set up a cross.

For zebrafish breeding, researchers use tanks specifically designed for mating. Breeding tanks typically feature a removable insert with holes that allow eggs to fall through. This feature protects the eggs from being eaten by hungry adult fish.

To begin, combine adult fish in breeding tanks during the afternoon or evening. To collect early stage embryos the following morning, separate male and female fish with a divider, which stops them from breeding before you’re ready to begin an experiment. To prevent the fish from jumping out, be sure to cover the breeding tank with a lid. Then, leave the fish to acclimate to each other overnight.

After spending the night together in a breeding tank, the fish will mate the following morning.

The first step in the morning is to remove the divider from between the male and female fish to initiate spawning. If a divider is not used, the fish will lay eggs shortly after light onset.

As the males chase the females around the tank, they stimulate spawning of eggs while releasing sperm into the water for fertilization. Wait approximately 15 – 30 minutes after pulling a divider to give the fish time to mate. Then, remove the adults from the tank by using a net or by lifting the tank insert and placing the fish into another tank.

Next, pour the water and the embryos through a mesh tea strainer for collection. Then, using “egg water,” wash the embryos off the strainer into a petri dish. It may be necessary to transfer embryos between dishes to achieve an optimal density of 50 – 100 per dish. To ensure development proceeds at a normal pace, place the dishes in an incubator at 28.5 °C.

Once you’ve got your embryos, handle them with care. They are important for your experiments! Let’s go over some pointers.

To keep embryos healthy, make sure to keep the water in the petri dishes clean and free of debris. Dead embryos will be opaque and should be removed daily. Additionally, methylene blue can be added to the water to prevent fungal growth.

Any time you need to move embryos from one dish to another, use a transfer pipet. By swirling the dish, you can concentrate the embryos in the center of the plate, making the pipetting easier.

Some protocols require a few additional steps for embryo maintenance. For the first three days of life, zebrafish embryos develop inside of a chorion, which can impede manipulation of the embryo. The chorion can be removed by treatment with the proteolytic enzyme, pronase, or by using forceps to remove it manually. Additionally, zebrafish begin to develop pigment by 24 hours, as shown here in this zebrafish larva, which can interfere with microscopy. To see through this problem, scientists supplement the embryo water with PTU, which inhibits production of the pigment melanin.

Now that you know how to obtain and care for zebrafish embryos, let’s explore some of the ways researchers use them for scientific discovery.

The external development of zebrafish embryos allows for genetic manipulation by microinjection of DNA, RNA, or gene knockdown reagents. This method leads to uniform distribution of injected material throughout the embryo and can produce visible phenotypes resulting from the overexpression or loss of a protein. The same technique can also be used to make transgenic fish in which specific structures are marked by the expression of fluorescent proteins.

Additionally, the small size of zebrafish embryos and larvae make them ideal for phenotypic chemical screening. Here, embryos are loaded into 96-well plates and then treated with libraries of small molecules by adding the chemicals into the water. Later, these plates of fish are screened for morphological defects, such as the abnormal development shown here.

Finally, the transparency of the zebrafish embryos makes them well suited for microscopy. Live embryos expressing fluorescent proteins in specific cell types can be mounted and visualized with confocal microscopy, allowing researchers to examine cell movements in developing tissues over time.

You’ve just watched JoVE’s video on zebrafish breeding and embryo handling. In this video, we’ve discussed the basics of mating, setting up breeding tanks, and embryo handling. We also discussed some research methods that take advantage of this powerful little embryo. Thanks for watching!

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