Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

O objetivo geral deste procedimento é criar microarrays de biomembrana usando um método de preparação simples. Isso é feito primeiro revestindo grânulos de sílica com membranas de bicamada lipídica. A segunda etapa do procedimento é depositar as esferas revestidas de lipídios no substrato de micropoços de silicone.

O terceiro passo é remover as esferas que não estão em micro poços, usando um rodo de polimetil suboxano. A etapa final é obter imagens das matrizes de esferas revestidas com lipídios com microscopia de fluorescência. Em última análise, este método pode ser usado para determinar constantes de ligação para interações lipídicas de toxinas usando uma abordagem de imagem de matriz.

Este método pode ser usado para criar matrizes de bicamadas lipídicas esféricas suportadas e partículas de membrana natural derivadas de células. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que, além da fabricação dos micropoços, a técnica não requer modificação química do substrato ou das membranas lipídicas para criar matrizes de biomembranas espacialmente definidas. As aplicações desta técnica podem ser estendidas para detecção livre de marcação de interações de proteínas lipídicas usando plasma de superfície e ressonância com base em matrizes de furos de metal nanométricos.

Embora este método possa fornecer informações sobre as interações de proteínas lipídicas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudos de adesão focal celular, matrizes de micro poços e preparações de rodo são detalhados no protocolo de texto. Este vídeo começa com a preparação da vesícula. Primeiro em uma pequena mistura de frasco de vidro, os lipídios componentes para as vesículas.

Um total de meio miligrama de lipídio está nesta solução sob vácuo dessecar a mistura por seis horas. Em seguida, faça uma solução de cloreto de sódio 0,1 molar e adicione meio mililitro aos lipídios secos. Deixe a mistura incubar durante a noite em temperatura ambiente.

No dia seguinte, vórtice a mistura para suspender as vesículas. Em seguida, sonice a mistura por 20 minutos em um banho, sonice em temperatura ambiente. Após a sonicação, extrudar a suspensão através de um filtro de membrana de policarbonato de 100 nanômetros.

Passe a suspensão pelo filtro de extrusão um total de 17 vezes. Em seguida, armazene as vesículas extrudadas em um frasco de vidro a quatro graus Celsius. Primeiro usando grânulos de dióxido de silício de 700 nanômetros de diâmetro.

Faça uma suspensão de 15 bilhões de contas em cloreto de sódio 0,1 molar. Vortex da suspensão e centrifugue-a a 1700 Gs durante 20 minutos e rejeitar o sobrenadante. Repita a lavagem com resus, suspendendo as contas em outro mililitro de solução salina e girando-as por mais 20 minutos.

Em seguida, repita o processo uma terceira vez para formar as bicamadas lipídicas esféricas suportadas ou SSBs. Misture 25 microlitros da suspensão de esferas de dióxido de silício com 200 microlitros da suspensão de vesículas da seção anterior. Vortex a mistura e acenda-a incubar em temperatura ambiente por uma hora depois, centrifugue a mistura a 1700 Gs por 20 minutos.

Descarte o sobrenadante. O pellet é rosa para vesículas rompidas com linha DPPE nas contas. Ressuspenda-o em 225 microlitros de PBS a PH 7,4.

Repita as etapas de suspensão de rotação e Resus duas vezes para remover as vesículas não rompidas e concluir a criação dos SSBs. Divida wafers de micro matrizes de poços em partes retangulares com quatro a seis matrizes cada. Em seguida, vórtice, a suspensão SSLB da seção anterior e transfira 10 microlitros para cada matriz de micro poços.

Aguarde uma hora para que os SSBs se estabilizem mais tarde. Lave os chips da matriz com PBS suavemente e mergulhe a matriz em PBS usando o rodo deslize sobre a superfície dos chips submersos cinco vezes. Isso remove os SLPs que não estão dentro dos micropoços.

Em seguida, segure cada chip de matriz com uma pinça e sacuda suavemente o PBS. Em seguida, transfira-o para um banho PBS fresco. As superfícies superiores dos cavacos devem permanecer úmidas.

Remova um chip do banho e W. A maioria dos PBS com um lenço de laboratório. Deixe PBS suficiente para manter a matriz hidratada.

Agora adicione 200 microlitros de solução BSA à matriz para bloquear a ligação não específica. Deixe a matriz incubar por uma hora. Em uma caixa umidificada posteriormente, remova o BSA com uma micropipeta e adicione 200 microlitros de solução de toxina de cólera.

Em seguida, retorne a matriz para a câmara umidificada. Espere mais uma hora, depois lave a matriz com PBS e retire o excesso de PBS com um lenço de limpeza. Em seguida, coloque o chip de matriz em uma lâmina de microscopia padrão e anexe uma lamínula quadrada de 24 por 40 milímetros à matriz e prossiga com a imagem.

A análise de imagem pode ser feita com as funções de análise de partículas J.Automated da imagem. Em seguida, para cada matriz, resuma as intensidades médias dos SSBs individuais como histogramas. Depois de usar os métodos descritos, uma área quadrada de 100 mícrons em uma matriz mostra 936 SSBs.

Enquanto os dados de ocupação foram calculados e um histograma das intensidades fluorescentes SSLB foi gerado após uma semana de armazenamento. A mesma matriz foi reanalisada da mesma maneira e não houve alteração nas intensidades fluorescentes ou na ocupação da matriz. A deposição sequencial de diferentes SSBs com diferentes marcadores de identificação também foi possível com os métodos descritos.

Os segundos SSBs foram depositados em um décimo. A concentração dos primeiros SSBs depositados. Uma sobreposição de ambos os marcadores é mostrada para um experimento.

As matrizes foram feitas com SSBs com várias concentrações de GM um e expostas a uma concentração fixa de toxina da cólera. O inverso também foi realizado para determinar a constante de dissociação de equilíbrio. Para GM um.

matrizes de ligação à toxina da cólera também podem ser feitas de biomembranas naturais, como esta matriz feita de partículas de mielina. É marcado com fluoro lipofílico quatro FM 1 43. As jangadas lipídicas são enriquecidas em colesterol e gangliosídeos, como o GM.

Assim, a toxina da cólera conjugada Alexa 4 88 liga-se fortemente a microarrays de jangada lipídica, por outro lado, o Aden despojado marcado com fluorescência não se liga a esses arrays. Uma matriz foi feita entregando jangadas de mielina e lipídios aos micropoços por meio de um chip microfluídico com canais de 250 mícrons. Foi marcado com IgM anti-oligodendrócito e o sulfeto de S encontrado na mielina foi marcado, mas as jangadas lipídicas não.

Não Uma vez que os grânulos revestidos de bastão lipídico são preparados. Esta técnica pode ser usada para preparar matrizes em uma hora, se executada corretamente, após a criação de matrizes de partículas de membrana natural. Outros métodos, como plasma de superfície nano hole e ressonância, podem ser usados para detecção sem marcação de interações biomoleculares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar matrizes de biomembranas usando esferas revestidas com camada biliar lipídica e partículas de membrana natural.