Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

O objetivo geral deste procedimento é identificar as etapas em que a expressão gênica viral é afetada pelo tratamento químico. Para isso, células de cultura de tecidos são semeadas e incubadas até atingirem confluência. Em seguida, as células são infectadas com um vírus vaccinia triplo marcador ou com um vírus controle sem promotor.

Em seguida, são aplicados os compostos de tratamento e as células são incubadas por 18 horas para permitir a conclusão de todas as etapas da expressão gênica viral. A fluorescência resultante é então determinada utilizando um leitor de placas. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram as alterações relativas na expressão causadas pelos compostos experimentais.

A principal vantagem desta técnica em relação à infecção com um vírus que expressa uma única proteína de fusão fluorescente é que este conjunto de vírus fornece mais informações sobre em qual etapa do ciclo vital viral uma droga terapêutica específica está atuando, oferecendo insights sobre seu mecanismo de ação. Embora este método possa ser usado para identificar inibidores da infecção viral, ele também pode ser empregado para detectar a etapa da replicação viral concluída em linhagens celulares não permissivas ou em telas de RNAi, identificando fatores celulares necessários para a infecção. Este protocolo utiliza o vírus repórter multietapa triplo ou TrpV, no qual três fluoróforos espectralmente distintos são incorporados ao genoma de fita dupla de um único vírus vaccinia.

Cada um desses fluoróforos é controlado por um promotor específico bem definido para cada estágio. O promotor C 11 R para a expressão inicial da Venus, o promotor intermediário G eight R para a expressão da m-cherry e o promotor F 17 R para a expressão tardia da tag BFP. Assim, Venus, m-Cherry e tag BFP são expressos sequencialmente durante a infecção.

Como controle, utiliza-se um vírus sem promotor. O PLV contém uma construção semelhante à Venus presente no TrpV, no entanto, não possui um promotor de transcrição funcional.

Inicie este protocolo dissociando células HeLa cultivadas em uma placa de 10 centímetros, diluindo as células em meio de crescimento até aproximadamente 2,0 vezes 10⁵ células por mililitro. Em seguida, distribua 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços com paredes pretas, fundo transparente e plano. Incube as células por 24 horas em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono até que atinjam confluência. Para diluir os vírus, descongele TrpV e PLV em banho-maria a 37 °C e, em seguida, sonique por cinco minutos para promover a desagregação. Em seguida, dilua o estoque viral até 1,0 vezes 10⁷ PFU por mililitro em meio de infecção previamente aquecido a 37 °C.

Para infectar as células, substitua o meio de crescimento por 50 microlitros do vírus diluído em cada poço. Para cada tratamento, infecte três poços em replicata com TrpV e outros três com PLV para levar em conta a fluorescência de fundo específica de cada tratamento. Isso é definido como o tempo igual a zero hora pós-infecção. Por exemplo, prepare 350 microlitros para 6 poços de uma placa de 96 poços, com 50 microlitros cada. Cada composto deve ser diluído para duas vezes a concentração final, já que será adicionado ao volume do inóculo já presente no poço. Em seguida, para cada condição de tratamento, prepare uma mistura-mãe 2x diluindo os compostos experimentais ou os solventes de controle veículo, como PBS ou DMSO, em quantidade suficiente do meio de infecção para todas as replicatas, mais uma. Observe que a concentração de solvente nos controles experimental e apenas vetor deve ser a mesma. Por exemplo, se você estiver usando IBT a um microlitro por mililitro em DMSO, também deve usar DMSO puro a um microlitro por mL como seu controle de vetor. Imediatamente após a adição do vírus, adicione 50 microlitros do meio de infecção contendo os compostos de tratamento e controle desejados a cada poço, conforme mostrado nesta ilustração.

Observe que cada composto é testado com TrpV e PLV em triplicata, e um controle de veículo é realizado em triplicata para cada vírus.

Incube por 18 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, fixe as células adicionando 100 microlitros de paraformaldeído a 8% ao meio de infecção já presente em cada poço. Incube a placa à temperatura ambiente por 15 minutos protegida da luz.

Adicionar duas vezes o volume de paraformaldeído a 8% diretamente ao meio de infecção impedirá a aerosolização do vírus, que poderia ocorrer caso o vírus não fixado fosse invertido diretamente no recipiente de resíduos. Após 15 minutos, remova o fixador invertendo a placa no recipiente de resíduos. Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS à temperatura ambiente e feche a placa com filme adesivo opticamente transparente.

Se a placa não for lida imediatamente, armazene-a a quatro graus Celsius. Certifique-se de retornar as placas seladas à temperatura ambiente antes da leitura para evitar que a condensação distorça as medições do espectrofotômetro.

Para quantificar o crescimento viral, utilize um espectrofotômetro para medir a fluorescência no ponto final. Realize quatro medições por poço utilizando configurações de ganho otimizadas para cada canal. O leitor de microplacas TECAN Infinite M 1000 Pro utilizado neste vídeo exporta as medições brutas de fluorescência para um arquivo do Microsoft Excel. Após obter as leituras, abra os dados brutos no Microsoft Excel.

Em seguida, copie e cole os dados em uma planilha de resultados do GraphPad Prism. No Prism, determine a média das poças replicatas de TrpV e PLV. Subtraia então o valor médio das poças de PLV do valor médio das poças de TrpV para cada tratamento. Para facilitar a comparação com experimentos replicados, normalize os dados dividindo os dados com fundo subtraído pelas poças de TrpV com veículo apenas. Após repetir o experimento várias vezes, realize uma análise de variância unidirecional ou teste ANOVA unidirecional e um teste pós-comparação múltipla para determinar se algum dos tratamentos é significativamente diferente do tratamento com DMSO para cada canal. Para realizar ensaios cinéticos, infecte as células e aplique os compostos em teste como anteriormente; é particularmente importante usar um meio tamponado para manter o pH adequado sem a adição de 5% de dióxido de carbono.

Após selar a placa com filme adesivo, coloque-a na câmara do leitor de placas equilibrada a 37 graus Celsius. É necessário ter cuidado especial para manter as placas consistentemente a 37 graus Celsius. Isso evitará estresse celular indevido e condensação.

Defina manualmente o ganho do leitor de placas para evitar a saturação dos pontos de tempo posteriores. Adquira leituras horárias durante oito a 24 horas após a infecção e normalize como no ensaio de ponto final. Pontos de tempo individuais podem ser analisados quanto à significância estatística utilizando métodos semelhantes aos do ensaio de ponto final descrito anteriormente.

Para comparar pontos de inibição, células HeLa infectadas com TrpV ou PLV vaccinia foram cultivadas na presença dos inibidores de poxvírus, AraC, IBT, Rifampicina e ST 246. Este filme com lapso de tempo mostra a expressão sequencial dos fluoróforos verde, vermelho e azul durante o crescimento viral em células controle. Quando infectadas na presença do fármaco inibidor da replicação do DNA, AraC, o fluoróforo verde precoce é produzido como antes, mas a produção intermediária e tardia da fluorescência vermelha e azul não ocorre.

A análise quantitativa por espectrometria mostrou um aumento de 210% na expressão de genes precoces, mas ausência de expressão intermediária e tardia em células tratadas com araC. Células infectadas na presença de IBT, que se acredita promover a transcrição por leitura contínua, apresentaram níveis de expressão intermediária e tardia equivalentes a 24,7% e 2,9% dos níveis do controle. Células infectadas na presença de ST246 e rifampicina, que inibem após a expressão de genes tardios durante a montagem e maturação do virion, não diferiram significativamente dos controles. Esses resultados são consistentes com o mecanismo de ação conhecido desses compostos e sugerem que o vírus repórter TrpV pode ser utilizado para identificar a fase específica de inibição viral por compostos desconhecidos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de incluir controles apropriados. Isso não apenas permite a normalização correta dos resultados, mas também ajuda a determinar um mecanismo potencial para o seu composto experimental. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus vaccínia pode ser extremamente perigoso; sempre use equipamentos de proteção individual adequados e siga as técnicas recomendadas de contenção em nível BSL-2.