Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar as alterações do peptídeo fosfofoso que ocorrem nos espermatozóides durante a maturação dos espermatozoides. Isso é conseguido removendo o epidídimo do camundongo, realizando a retrolavagem retrógrada dos espermatozoides e coletando as células em um tubo microcapilar. Em seguida, os espermatozoides podem nadar para uma solução salina balanceada, o que permite a remoção de proteínas contaminantes, e então são lavados, deitados e precipitados para remover sais e gorduras contaminantes.

As proteínas gulares são digeridas usando tripsina e depois enriquecidas com dióxido de titânio para enriquecer peptídeos fosfo. Os resultados mostram mudanças quantitativas no estado de fosforilação das proteínas com base em cromatografia líquida, análise por espectrometria de massas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva, como quais são as alterações fosfoproteômicas à medida que os espermatozoides atravessam os EPIs ou durante a capacitação.

Embora esse método tenha fornecido uma visão sobre a biologia das células espermáticas, ele também pode ser aplicado a organismos modelo, estudos de doenças como câncer, patologias neurológicas e vias gerais de transdução de sinal. A demonstração visual desse método é crítica, pois é difícil determinar a anatomia das áreas nas quais os EPIs serão manipulados. Comece fazendo 200 mililitros de solução de talo de trabalho Biggers, Whitten and Whitten ou BWW, adicionando o seguinte a um litro de água Milli Q para fazer uma cânula.

Usando tubos de polietileno com diâmetros internos e externos de 0,4 milímetros e 1,1 milímetros, respectivamente. Segure-o em fogo baixo até que o tubo comece a derreter. Puxe imediatamente as extremidades do tubo para fora para esticá-lo, diminuindo assim o diâmetro externo.

Corte o tubo para produzir um estreitamento de uma extremidade, o que permitirá uma canulação mais fácil do S deens. Corte a extremidade oposta em aproximadamente 15 centímetros. Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 na extremidade cega e prenda uma seringa de três mililitros totalmente retraída a ela.

Faça um bocal de sucção cortando um tubo de PE de 20 centímetros de comprimento e insira-o em uma extremidade da cânula. Insira o suporte do tubo de vidro microcapilar e o microcapilar de vidro. Depois de sacrificar um camundongo de acordo com o protocolo de texto, faça uma pequena incisão no escroto para expor o epi.

Em seguida, use um par de relojoeiros. Número cinco fórceps para puxar o testículo e o epidídimo para fora da cavidade. Corte para remover tudo, exceto cerca de um a dois centímetros da vasta deferência do epidídimo do kata.

Em seguida, corte para remover os ductos proximais de EENT e o tecido que conecta o epidídimo ao testículo e remova todo o trajeto reprodutivo masculino sob um microscópio de dissecação usando entre cinco x e 40 x de aumento. Coloque um a dois centímetros da extremidade estreita da cânula no campo de visão e use fita adesiva para prendê-la com o número cinco, pinça de relojoeiro. Aperte suavemente cada lado da vasta deferência e puxe-a sobre a parte visível da cânula.

Em seguida, com seda tratada trançada preta não absorvível, dê um nó seguro ao redor do tecido canulado usando relojoeiros. Fórceps número cinco. Pegue a extremidade distal dos epíides kata e remova a túnica Eugenia.

Para expor um único túbulo epidérmico, exponha suavemente o túbulo e separe-o para criar uma abertura para que o esperma seja liberado. Em seguida, pressione suavemente o êmbolo da seringa para expelir o ar para a vasta deferência. A pressão fará com que os espermatozóides saiam do túbulo quebrado.

Em seguida, aplique sucção no bocal para atrair os espermatozóides para o capilar de vidro. Sopre suavemente no bocal ou coloque uma seringa e expulse os espermatozóides do capilar de vidro para um mililitro de solução B WW pré-guerra. E use a solução para lavar as células três vezes para remover quaisquer proteínas contaminantes.

Após remover a lavagem final, congele o esperma para uso posterior ou use 4% de rachaduras, dois molares de tioureia e 50 milimolares tris pH 7,4 para solubilizar as proteínas incubadas por uma hora com vórtice intermitente. Em seguida, centrifugar a solução a 10 000 GS durante 20 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo para reduzir as ligações dissulfeto e alquilar as proteínas na TDT a uma concentração final de 10 milimolares em relação à solução proteica. Vórtice e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, adicione 50 milimolares de acetamida IO ao vórtice de lisado e incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Para precipitar as proteínas, combine um volume de lisado, um volume de metanol e 0,5 volume de clorofórmio. Após o vórtice da amostra, gire-a a 10.000 Gs por dois minutos, colete a camada superior, deixando cerca de dois milímetros para evitar a aspiração da interface.

Depois de adicionar um volume de metanol, inverta suavemente o tubo e gire novamente. Rejeitar o sobrenadante e secar ao ar o pellet durante três a quatro minutos para efectuar o enriquecimento da tripsina, da digestão e do fosforepeptídeo. Comece usando bicarbonato de amônio 25 milimolar contendo uma uréia molar.

Para reconstituir a tripsina, combine F 50 para uma proporção de peso por peso de proteína para a tripsina e incube em um misturador térmico a 37 graus Celsius e 700 RPM durante a noite. Depois de girar para granular o material não digerido, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Usando tampão DHB preparado de acordo com o protocolo de texto, dilua os peptídeos trys inizados dez vezes e aplique-o a 200 microgramas de grânulos secos de dióxido de titânio incubados em um rotador por uma hora em temperatura ambiente após a incubação, use tampão DHB para lavar a amostra mais uma vez antes de usar o tampão de lavagem consistindo de 80% A CN e 2% TFA para lavar a amostra três vezes após a centrifugação final eluir os peptídeos fosfofos por adicionando 2,5% de hidróxido de amônio imediatamente após girar e coletar o sobrenadante.

Use 0,3 microlitros de ácido fórmico para acidificar a amostra, como visto aqui. Uma vantagem deste protocolo é que os espermatozóides são isolados. Em um estado quiescente, muitas células se aglomeram logo após a expulsão para o meio B WW.

No entanto, após 10 minutos, tornam-se modais e a solução torna-se homogénea. A preparação descrita neste vídeo normalmente produz 200 vezes 10 elevado a seis zoas. Esta figura demonstra a pureza dos espermatozóides do epidídimo de Cota de rato AR.

Uma questão importante em relação à preparação da amostra é o rendimento de viagens e digestão. Ao contrário da precipitação de TCA, que muitas vezes requer que o pH da amostra seja ajustado, a precipitação de clorofórmio fenol é rápida e não acidifica a amostra mostrada aqui é o pellet de proteína normalmente visto a partir de 100 microgramas de amostra entre a interface inferior e superior demonstrada. Aqui está a reprodutibilidade deste protocolo.

As listras azuis que aparecem ao longo do tempo são peptídeos alusivos a uma coluna C 18 nano. À medida que a concentração de acetonitrila aumenta na população modal, há um aglomerado de peptídeos em cerca de 651,5 Daltons que está completamente ausente na faixa não. Uma vez que o protocolo de enriquecimento do peptídeo fosfato é uma técnica eficiente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a preparação da amostra é um aspecto fundamental para obter resultados reprodutíveis para proteômica. Este método pode ser adaptado para isolar glicoproteínas, que podem ser usadas para responder a perguntas adicionais, como quais proteínas sofrem uma alteração no conteúdo de ácido sic de seu proteoma.