Name: Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a analisar fosfopeptídeos em espermatozoides de roedores durante a maturação espermática. Este método utiliza lavagem retrógrada e espectrometria de massas para quantificar mudanças na fosforilação proteica.

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Os autores gostariam de agradecer ao NHMRC pelo prêmio de desenvolvimento de carreira e apoio financeiro APP1066336 que apoiaram este trabalho.

1. Preparação de Meios de Cultura e Pratos <ol><li> Adicione 200 ml de Biggers Whitten e Whitten (PD) 17 Solução de trabalho pela adição de 5,54 g de NaCl, 0,356 g de KCl, 0,25 g de CaCl2, 0,162 g de H 2 KO 4 P, e 0,294 g de MgSO4 e 1 L de água Milli-Q . Esta é a solução estoque e pode ser mantida a 4 ° C durante até um mês. </li><li> A partir da solução estoque, adicionar 420 mg de NaHCO3 -, 200 mg de glucose, 6 mg de piruvato de sódio, 600 mg de albumina de soro bovino, 0,74 ml lactato de sódio, e 4,0 ml de tampão HEPES a 193 ml do estoque de BWW. Esta é a solução de trabalho e é sempre frescos no dia e equilibrou-se a 37 ° C antes de usar. </li><li> Para fazer com que a cânula, ter de polietileno (PE), tubagem com um diâmetro interno de 0,4 mm e um diâmetro externo de 1,1 mm e mantenha em fogo baixo (tipicamente metanol chama) de tal modo que o tubo começa a derreter. Tire imediatamente a tubulação outward para esticar e fazer o diâmetro exterior mais estreito. </li><li> Cut para produzir um estreitamento de uma extremidade que permite a fácil punção dos vasos deferentes. </li><li> Cortar a outra extremidade da cânula até cerca de 15 cm. Inserir uma agulha G 30 no fim brusco, e anexar uma seringa de 3 ml para ele (totalmente retraída). </li><li> Adicione um bocal de sucção por um corte 20 cm de comprimento de tubagem de PE (4,2 mm de diâmetro interno, 6,4 mm de diâmetro exterior). Insira um porta-voz em uma das extremidades. </li><li> Insira o suporte tubo de vidro a micro-capilar e da própria micro-capilar de vidro (tipicamente 3 ul para um rato, 40 ul para um rato). </li></ol> 2. Remoção de epidídimos de Mouse <ol><li> Eutanásia ratos de acordo com os procedimentos aprovados IACUC específicas para cada instituição. </li><li> Leve o animal e fazer uma pequena incisão no escroto para expor o epidídimo. Puxe o testículo e epidídimo para fora da cavidade usando um par de # 5 pinças de relojoeiro. </li><li> Cortam os canais deferentes de tal modo que, pelo menos, 1-2 cm de permanecer ligados à cauda do epidídimo. Além disso, cortar os ductos eferentes proximais e tecidos de ligação do epidídimo ao testículo e remover a faixa reprodutiva masculina inteira. </li><li> Coloque a faixa reprodutor masculino inteira sob um microscópio de dissecação com uma gama de ampliação na ordem de 5-40X. </li></ol> 3. canulação do epidídimo <ol><li> Fita para baixo da cânula para o microscópio, de tal modo que 1-2 cm da extremidade (em forma de cone) estreitada é livre e visível através da lente. </li><li> Pegue um par de # 5 pinças de relojoeiro e apertar suavemente cada lado do canal deferente e puxe o canal deferente para a cânula, de tal modo que a cânula vai para os canais deferentes. </li><li> Pegue um pedaço de não-absorvível trançado preto de seda tratado (tamanho 5-0) e dê um nó em torno dos vasos deferentes canulados. Verifique se o nó é puxado com força para segurar a cânula no interior dos vasos deferentes, quando a pressão do ar from a seringa é aplicado. </li></ol> 4. Retrograde ou Backflushing do caudal do epidídimo Espermatozóides <ol><li> Usando relojoeiros # 5 fórceps, pegue a extremidade distal dos epidídimos Cauda e remover a túnica albugínea, a fim de expor um único túbulo epidídimo. </li><li> Usando a pinça, puxe para fora do túbulo para expor e, em seguida, provocar uma separação, de modo a criar uma abertura para o esperma para ser liberado. </li><li> Suavemente empurrar os 3 ml (rato) ou 20 ml (rato) de seringa, de modo a expelir o ar a partir da seringa para dentro do vaso deferente. À pressão adequada, espermatozóides vai começar a sair lentamente do túbulo quebrada na extremidade distal da cauda do epidídimo. Neste momento, para aplicar sucção do bocal para desenhar os espermatozóides no capilar de vidro. Nota: Tipicamente, um rato, 2-3 ul de espermatozóides pode ser obtida, dependendo da idade do animal. A vontade de rato, no rendimento médio de 30-40 mL. </li></ol> 5. LavarLise e espermatozóides em Preparação para Proteomics <ol><li> Expulsar os espermatozóides do capilar de vidro, em 1 ml de solução de solução de BWW (37 ° C), soprando suavemente para dentro do bocal ou anexar uma seringa e expelir o ar de modo a empurrar os espermatozóides de volta para fora do capilar. </li><li> Uma vez que os espermatozóides são difundidos, lavar 3x (300 x g, 5 min) com 1 ml BWW para remover proteínas contaminantes. Após a lavagem final, remover o sobrenadante. Nota: Neste ponto, as células de esperma podem ser congeladas para uso posterior. </li><li> Solubiliza-se proteínas utilizando 4% CHAPS, 2 M tioureia, e Tris 50 mM, pH 7,4, durante 1 hora com agitação em vórtex intermitente. </li><li> Após a lise das células, de centrifugação (10.000 xg, 20 min), ter sobrenadante e transferir para um tubo novo. Nota: Neste ponto, a quantificação de proteína pode ser realizada. </li></ol> 6. Disulfide bond Redução e alquilação <ol><li> Adicionar DTT 10 mM como uma concentração final de proteínas de lisados, vortex e incubar à TA durante 30 min. </li><li> Adicionar 50 mM idodoacetamide como uma concentração final de lisado, vortex e incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. </li></ol> 7. Precipitação <ol><li> Metanol clorofórmio precipitar a amostra por adição de 1 volume de lisado (400 ul como um exemplo), adicionar um volume (400 ul) de metanol e 0,5 volumes (200 mL) de clorofórmio. </li><li> Vortex da amostra e rotação (10.000 xg, 2 min). </li><li> Note-se que duas fases aparece depois da centrifugação. Descarte todos mas 2 mm da camada superior (tomando cuidado para não perturbar a interface). </li><li> Adicionar 1 volume (400 ul) de metanol, tubo invertido 1-2X suavemente para misturar e novamente girar (10.000 xg, 15 min). Elimine o sobrenadante para o lixo e ar pellet seco para 3-4 min. </li></ol> 8. A digestão com tripsina <ol><li> Reconstituir tripsina em 25 mM de bicarbonato de amónio contendo ureia 1 M a uma proporção de 50: 1 (W / W; proteína: tripsina) e incubadas overnight a 37 ° C, de preferência a 700 rpm num termomisturador. </li><li> Rotação (10.000 xg, 15 min) para sedimentar o material não digerido. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. </li></ol> 9. fosfopéptido Enriquecimento <ol><li> Realizar purificação e do enriquecimento de fosfopéptidos da digestão tríptica como previamente descrito 18. Diluir péptidos trípticos 10 vezes em tampão de DHB [tampão DHB consiste de: 350 mg / ml de ácido 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v), ACN (acetonitrilo), 2% (v / v) de TFA (trifluoroacético ácido)], e aplicam-se a secar o TiO 2 esferas (200 ug). </li><li> Deixar num rotor a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar a amostra com tampão DHB, girar e remover o sobrenadante. Em seguida, lava-se a amostra três vezes com tampão de lavagem [80% de ACN (v / v), TFA a 2% (v / v)] para remover o DHB. </li><li> Após a centrifugação final, eluir directamente os fosfopéptidos utilizando tampão de eluição por adição de 25 ul de um hidróxido de amónio a 2,5%, pH 10,5 ≥ solução. Sprender e remover o sobrenadante. Imediatamente ~ neutralizar com ácido fórmico a 0,3 ul. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos críticos para uma análise proteómica bem sucedida e reprodutível de espermatozóides são: 1) pureza do material de partida; 2) a remoção de sais não desejados e detergentes; 3) desnaturação de proteínas toda a sua extensão de modo a permitir que a tripsina para digerir um elevado rendimento de proteínas e 4) minimizando o manuseamento da amostra para reduzir a perda de péptido. A fim de backflush cauda do epidídimo com sucesso, é essencial para localizar a área da qual os espermatozóides vai sair. No caso de ambos os ratos e ratinhos, isto é, no vértice da superfície côncava, no meio da região caudal do epidídimo (ver Figura 2A). Se alguém vem mais para o canal deferente, backflushing é mais fácil e a taxa de sucesso é geralmente mais elevada. No entanto, isso vem com a perda do número de espermatozóides. Em alternativa, se se tenta mover-se mais próximo do corpo, então a quantidade de pressão necessária para empurrar o espermatozóides de volta através do epididymdutos de AL é muitas vezes tão alto, que os danos para o epidídimo inevitavelmente ocorre. Backflushing do epidídimo é tradicionalmente realizado utilizando água saturada com óleo mineral e uma solução salina equilibrada na própria seringa, assim como um meio para remover os espermatozóides 22-25. Ambos os procedimentos são potencialmente problemática da LC-MS. Em primeiro lugar, mineral é susceptível de bloquear os nano-nano-C18 colunas que são basicamente utilizadas em todo o mundo para a análise proteômica e os cuidados devem ser tomados para que nenhum é transportado no procedimento. Se isto ocorre, é impossível continuar e a amostra é essencialmente perdido. Isto pode ser ultrapassado através da utilização de BWW ou outras soluções salinas equilibradas na seringa, no entanto, embora este seja bem sucedido, é reconhecido logo que muitos dos espermatozóides móveis se tornar tão logo a solução BWW entrou em contacto e misturado com o caudal do epidídimo células. Para contornar esse problema, simplesmente backflush dos espermatozóides com o ar. Não é só a quadade de espermatozóides comparável à dos métodos à base de líquidos, mas a quantidade é idêntica. Phosphoproteomics é talvez uma das únicas maneiras de estabelecer vias de sinalização que estão ocorrendo em espermatozóides pós-ejaculação. Uma das principais vias que estamos a investigar é o processo de capacitação. Espermatozóides deve sofrer &quot;capacitação&quot; antes que seja capaz de se ligar a um ovo. Na prática, isto é conseguido, basicamente, por incubação de espermatozóides durante um período de tempo (40 min ratinho; de rato de 1,5 h; 3-24 h humana) numa solução de albumina de soro com BWW. Anteriormente, nós e outros têm demonstrado um papel para várias quinases envolvidas na capacitação. De interesse, a exclusão da PKA μ II produzir camundongos cujos espermatozóides nadam de forma espontânea in vitro, mas não podem ser submetidos a hiperativação 26. O último é uma marca registrada de capacitação, em que os espermatozóides alterar o seu padrão de natação a partir de uma velocidade elevada, de baixa amplitude, com um baixovelocidade, amplitude alta frequência de batimento. Nós mostramos quinases a jusante envolvidos neste processo incluem pp60-CRV (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. Curiosamente, a inibição de SRC pára-dependente capacitação fosforilação da tirosina 13. No entanto, isso pode ser superado com o ácido ocadaico, sugerindo que SRC não está directamente envolvido no aparecimento geral de fosforilação da tirosina 29, mas podem regular uma fosfatase 29. O problema com o uso BWW como um meio para forçar espermatozóides fora do epidídimo é que uma vez ativado, espermatozóides mouse apenas levar cerca de 40 min para capacitar. Dado que o isolamento de espermatozóides pode levar de 5 min / rato e frequentemente vários ratos são usados ​​em uma experiência, em seguida, os espermatozóides será em diferentes fases de maturidade no início da experiência. Para ultrapassar esta situação, a pressão de ar pode ser usado para empurrar o espermatozóides do epidídimo caudal em uma cânula de vidro. Não só são todos inact espermaive e essencialmente como eles seriam encontrados no meio caudal, isso faz com que seja possível comparar phosphoproteomics não-móveis e imóveis. Manuseamento da amostra para phosphoproteomics devem ser mantidos a um mínimo quando se comparam os espermatozóides em dois estados funcionais diferentes. A utilização de metanol clorofórmio sobre os outros métodos tradicionais de precipitação da proteína 1) reduz a necessidade de passos de lavagem adicionais, 2) remove quase todos os vestígios de sais e gorduras e 3) tem uma capacidade comprovada para precipitar as proteínas de baixa abundância ao longo TCA 19. Precipitação de proteína antes da digestão com tripsina é recomendado uma vez que isto não só ajuda a desnaturar proteínas (o qual auxilia a digestão de tripsina), mas remove muitos dos metabolitos MS-incompatíveis presentes na célula. A comparação de fosfopéptidos de esperma pode ser feito de um número de maneiras. No nível básico, uma simples comparação do fosfopéptido identificada em uma amostra, para que, em outroamostra no processo conhecido como &quot;contagem espectral&quot; pode ser feito. No entanto crítica tem sido a esta abordagem, basicamente, porque os estudos de proteômica primeiros estavam usando baixas repetições (para uma discussão mais completa ver Lundren et al. 30). Uma abordagem mais sofisticada é olhar para a intensidade da massa pai peptídeo e comparar com as outras amostras (comparação livre-label). No exemplo mostrado na Figura 4, um péptido ausente do de não-móveis (Figura 4 em cima), mas presente no móveis (Figura 4 inferior) espermatozóides de m / z 650-670 pode ser visto. Este processo, designado por etiqueta baseada em MS quantificação livre é uma estratégia livre de marcador. Uma estratégia alternativa utilizada para reduzir a quantidade de funcionamentos necessárias para quantificação proteómica é o uso de isótopos. À medida que a massa de um isótopo é diferente, no espectrómetro de massa pode ser utilizado para comparar as intensidades da eluting péptidos. No entanto, diferentemente da maioria dos outros tipos de células, algumas marcação isotópica não pode ser aplicada aos espermatozóides. Por exemplo, a adição de isótopos estáveis ​​(um isótopo pesado é adicionado a uma amostra, ao passo que uma versão mais leve é ​​adicionado ao outro) podem ser utilizados em cultura de tecidos. Quando os isótopos são incorporadas na proteína, uma análise proteómica pode ser realizado através da combinação das duas amostras (multiplexação). No entanto, no caso de espermatozóides, isto não pode ser feito, simplesmente em virtude do facto de que 1) marcação isotópica requer várias passagens (até 8) em cultura de tecidos e 2) as células de esperma tem nenhuma transcrição do gene nuclear e tradução e, portanto, eles não podem incorporar os isótopos em todas as suas proteínas de qualquer maneira. Uma maneira de contornar isso é pedir camundongos radiofármacos, no entanto, estes são notoriamente caros. Uma abordagem alternativa é a utilização de uma etiqueta química. Isto foi feito quando os ratos não-capacitada foram comparados com ratinhos capacitadas. Neste caso, um e um D 0 D <sub&gt; 3 -label foi usada para distinguir entre uma amostra e um outro no espectrómetro de massa 31. Outras abordagens podem incluir o uso de iTRAQ (tag isobárica para a quantificação relativa e absoluta), em que as lisinas são rotulados quimicamente com diferentes isótopos de massa; iCAT (isótopo codificada marca de afinidade), pelo que cisteínas são marcados com diferentes isótopos de massa e rotulagem de água pesada e leve. Em cada caso, no entanto, uma coisa que precisa de ser mantido em mente. O MS apenas relata o que está presente em uma amostra, e isso é um reflexo de tudo o que aconteceu para que a amostra até esse ponto. Minimizando o manuseamento da amostra enquanto maximiza o rendimento em cada passo é necessário para uma análise proteómica bem sucedida.

Tendo emergido dos testículos, os espermatozóides são muito diferenciados ainda notavelmente, estas células são imaturas 1,2. Como tal, eles não têm a funcionalidade completa, incluindo a capacidade de nadar e se ligam a um ovócito 3. Embora seja necessário continuar a maturação do espermatozóide, isso não pode ocorrer por vias canônicas, uma vez que, nesta fase do seu processo de diferenciação celular, eles são incapazes de transcrição do gene e proteína mais biossíntese 4. Competência Biológica é conferido a espermatozóides como eles deixam o testículo e digite uma parte do sistema reprodutor masculino, conhecido como o epidídimo 5. O epidídimo é um tubo em espiral apertado, altamente diferenciado, que liga as condutas de eferentes (de testículos) para os canais deferentes e está presente em todos os mamíferos do sexo masculino 6. Espermatozóides adquirir progressivamente o seu potencial fertilizante durante a descida do epidídimo, contando com o ambiente luminal em constante mudança que é created pelas células epiteliais do epidídimo locais 7. As diversas atividades secretoras e re-absorção presentes no ato epididymal meio para modificar o próprio esperma, alterando a sua proteína, carboidratos e lipídeos composição 6. A importância do epidídimo, particularmente a região inicial &#39;caput&#39; dessa estrutura tenha sido exemplificada utilizando técnicas de ligação 8 cirúrgicos. Espermatozóides retida dentro do testículo por ligadura de ducto eferente são completamente desprovido de qualquer capacidade de fertilizar o óvulo 9-11. Além do ambiente epididimal, vias de transdução de sinal dentro do trabalho de espermatozóides ao pós-traducionalmente modificar o complemento existente de células de esperma. Por exemplo, os espermatozóides a partir do início regiões do epidídimo exibir diferentes padrões de fosforilação de proteínas em comparação com estas últimas regiões 5,12. Isto não é surpreendente uma vez que existem grandes diferenças na capability do esperma destas regiões. Por exemplo, os espermatozóides do início, caput epidídimo são immotilite. Em contraste, as células do esperma da região da cauda para a frente serão submetidos a motilidade progressiva, uma vez colocados em meio isotónico. Como as células de esperma do epidídimo são incapazes de biossíntese de proteínas-novo, todas as vias intrínseca que regulam a função do esperma deve ser através de modificações pós-traducionais (PTM). Por isso, é lógico que proteômica e, nomeadamente, a investigação de PTMs como fosforilação deve ser um grande impulso para que possamos conhecer a maturação do espermatozóide. Um método alternativo para a obtenção dos espermatozóides epididymidies usar retro-backflushing 13-16. Embora esta técnica é, certamente, mais demorada e tem um maior grau de habilidade por parte do operador, os espermatozóides obtidos demonstram de forma consistente pureza superior a 99,99%. Além disso, ao contrário de todas as outras técnicas, ca espermatozóidesn ser isolada num estado de repouso, tornando-se possível estudar a motilidade do esperma como é iniciada. Como preparação da amostra é o aspecto mais importante para a análise proteômica, isolamento de espermatozóides tornou-se um dos aspectos mais importantes de estudos de esperma-proteômica. Este protocolo proporciona uma explicação de como os espermatozóides são isolados a partir de cauda do epidídimo. Após isto, o processo de enriquecimento de TiO 2 fosfopéptido é descrito, com referência específica sobre como extrair péptidos a partir das células de esperma altamente diferenciadas. A abordagem MS pode ser usado para distinguir mudança fosfopeptídeos se fosse para comparar os espermatozóides do epidídimo caudal em um estado (immotile ou não capacitados) para outro (móveis, capacitados, acrossoma reagido, etc.) tornando-a uma abordagem poderosa para estudar esperma função.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihidroxi-1,4-benzoquinona</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>Kit de quantificação 2-D</td><td>VWR (GE Healthcare)</td> <td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>Albumina do soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Solução de amônia 25%</td> <td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de cálcioSigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3- [3- (cholamidopropil) dimetilamônio] -1-propanossulfonato</td><td>Research Organics</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (ácido livre)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ácido livre de ácido iodoacético</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Ácido láctico</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (estéril)</td> <td>VWR (GE Healthcare)</td> <td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de fosfatase Cocktail Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td> <td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de potássio</td><td>Loja Médica</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris, grau ultra puro</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Ouro, grau de especificidade de massa</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de 0,4 mm</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 30 G</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de 4,2 mm</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>Seda trançada (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 grânulos (da coluna desmontada)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

fosfopéptido análise de rodent epidídimo espermatozóides

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Os espermatozóides são bastante único entre os tipos de células. Embora produzido no testículo, tanto a transcrição do gene nuclear e tradução são desligadas uma vez que a célula rodada pré-cursor começa a se alongar e se diferenciar em que é morfologicamente reconhecida como um espermatozóide. No entanto, o espermatozóide é muito imaturo, não tendo capacidade para motilidade ou reconhecimento de ovo. Ambos os eventos ocorrem uma vez que o trânsito espermatozóides um órgão secundário conhecido como o epidídimo. Durante a passagem ~ 12 dias que demora para uma célula de esperma de passar através do epidídimo, modificações pós-traducionais das proteínas existentes desempenham um papel crucial na maturação da célula. Uma faceta importante de tal proteína é a fosforilação. A fim de caracterizar eventos de fosforilação que ocorrem durante a maturação do esperma, é necessário estabelecer as duas populações de células de esperma puros e pré-fracionamento de fosfopeptídeos. Usando técnicas de descarga de volta, um método para o isolamento do puro espermatozóides of alta qualidade e rendimento dos epidídimos distais ou caudal é delineada. Os passos para a solubilização, a digestão, e pré-fraccionamento de fosfopéptidos de esperma por meio de cromatografia de afinidade de TiO 2 são explicadas. Uma vez isolado, fosfopéptidos pode ser injectado na MS para identificar os dois eventos de fosforilação de proteína sobre os resíduos de aminoácidos específicos e quantificar os níveis de fosforilação que ocorre durante os processos de maturação do esperma.

A qualidade dos resultados de qualquer análise proteômica é fortemente dependente do material de partida. Com MS modernos, leves contaminações em preparações de amostra são facilmente apanhados. Portanto, é essencial, no caso de células de esperma proteómica, para escolher um método que dá espermatozóides altamente puro. Como ilustrado na Figura 1, backflushing retrógrada é usado para recuperar células de esperma de cauda do epidídimo. Trata-se de canulação dos vasos deferentes com tubagem PE que permite aplicar lentamente a pressão de ar da seringa em anexo. Figura 1A demonstra cauda do epidídimo, juntamente com os canais deferentes. Figura 1B é um fim acima do tiro de como o canal deferente é ligada em que o é inserida uma cânula. Ao fazer, por isso, os espermatozóides são liberados no final extirpado de um túbulo dos epidídimos caudais. Como mostrado na Figura 2A, os espermatozóides são extraídos a partir das regiões apicais do CAUDum epidídimo e são sugados para dentro de um capilar de vidro em um estado de repouso (Figura 2B). Isto tem várias vantagens sobre os métodos tradicionais &quot;nadar-up&quot;, não o menos importante dos quais é a capacidade de realizar uma análise phoshoproteomic dos espermatozóides antes e depois da activação da motilidade. Os espermatozóides podem então ser expelido para a mídia de sua escolha. Figura 2C (lado esquerdo) demonstra como o esperma procurar imediatamente após expulsão em media BWW. Muitas das células são aglutinados. No entanto, após 10 min da competência das células é demonstrada porque nadar para homogeneidade na solução (Figura 2C, células à direita). Uma vez que a técnica backflushing tem muito pouco impacto sobre as células do esperma, obtém-se perto de 100% e a motilidade das células dispersam-se rapidamente para o meio externo sem provocação. Em um experimento backflushing típico, esperma recuperado da Swiss-rato contémentre 1-5 x 10 6 células. Isto é altamente dependente da idade do animal, e pode variar entre diferentes estirpes de ratinhos. Em um rato da Noruega, que tipicamente se obter 200 x 10 6 espermatozóides, ± 20%. A Figura 2D representa o grau de pureza obtido a partir de espermatozóides cauda do epidídimo de rato. Além da própria amostra, uma das principais questões relacionadas com a preparação da amostra é o rendimento da digestão de tripsina. Precipitação de proteínas desempenha um papel importante, não apenas na remoção de detergentes e sais indesejados, ambos os quais são incompatíveis com MS, mas também em desnaturação de proteínas. Nós descobrimos que o precipitação metanolclorofórmio funcionar melhor. Não apenas esse procedimento foi relatado para precipitar proteínas abundantes baixas melhor do que outros, incluindo TCA precipitação 19, mas tem vantagens adicionais. Após precipitação com TCA, é muitas vezes necessário reajustar o pH após a suspensão da pelota ACT, que pode permanecer bastanteácida. Embora o sedimento precipitado de TCA pode ser lavado em soluções orgânicas elevadas para remover o ácido, o que aumenta o manuseamento da amostra e irreproducibility de resultados. A falha em neutralizar o ácido vai resultar em baixos rendimentos de péptidos trípticos. Precipitação de metanol-clorofórmio é não só rápido, mas não se acidificar a amostra. A Figura 3 ilustra o sedimento de proteína tipicamente visto a partir de 100 mg de amostra a interfase entre inferior e superior. O isolamento dos fosfopéptidos pode ocorrer em um número de maneiras; no entanto reprodutibilidade depende de como a amostra ter sido tratada até e incluindo esta etapa. Um dos métodos em desenvolvimento, mais comuns é TiO 2, originalmente desenvolvido pelo grupo de Martin Larsen 18,20,21. Embora tenha sido descrito como um processo para usar em microcolunas, podemos obter dados reprodutíveis usando cromatografia em lotes. O sucesso do processo é fortemente dependente do tampão de eluição, que deve estar louco<html> e com a composição correta; caso contrário, não são eluídas fosfopéptidos em tudo. A reprodutibilidade dos dados do protocolo e representativos de TiO2 a partir da cauda do epidídimo fosfopéptidos esperma enriquecido em um não-móveis (Figura 4 em cima) e móveis (Figura 4 inferior) estado de m / z 650-670 pode ser visto. Nós demonstramos que esta é uma técnica extremamente reprodutível mesmo quando se usa repetições biológica 17. As estrias azul aparecem ao longo do tempo são péptidos que eluem a partir de um nano-coluna C18 como a concentração de acetonitrilo aumenta. Claramente, a população em móveis (n = 3 ilustrados, n = 8 funcionam tipicamente), há um peptídeo de grupo, com uma massa monoisotópica torno da faixa de 651,5 Da que está completamente ausente no intervalo não-móveis. Espectrometria de massa em tandem é então utilizado para identificar este péptido. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Canulação da cauda do epidídimo (A) Imagem da cauda do epidídimo. A própria cânula é gravada para baixo para expor aproximadamente 1-2 cm da extremidade pré-puxado. Este é inserido nos vasos deferentes usando finas # 5watchmakers fórceps. (B) A cânula é mantida no lugar por amarrar seda fina em torno de um segmento que contém ambos os canais deferentes e da cânula. A partir do ratinho, aproximadamente 2-3 ul de células do epidídimo e caudais de fluido são recolhidos a uma concentração de 1 x 10 6 / mL. A partir do rato (mostrado), cerca de 30-40 uL de fluido são obtidos em concentrações semelhantes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figura 2: capilar de vidro usado para coletar espermatozóides do epidídimo competente. (A) Um túbulo do ápice da cauda e<html> pididymis é isolado e quebrado. A posição aproximada do qual isto ocorre é mostrado. (B) A parte superior da imagem mostra um tubo capilar de vidro vazia e a parte inferior apresenta uma a partir de um rato previamente backflushed. Não há contaminação sanguínea e contaminação de células epiteliais mínima. (C) Como os espermatozóides são ainda diluído no líquido do epidídimo, eles não começaram a ativar. Quando os espermatozóides são inicialmente expulsos em uma solução BWW, eles vêm como uma &quot;string&quot; compacto (lado esquerdo). A competência da célula é facilmente estabelecida, uma vez que depois de 10 min mais dos espermatozóides nadam em solução, sem qualquer perturbação externa (lado direito). (D) Uma imagem de uma alíquota de células do epidídimo caudais imediatamente depois de terem sido deixados para nadar fora demonstra a pureza das células. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3:. Precipitação de metanol-clorofórmio Uma vez que os espermatozóides foram solubilizados, a fracção solúvel é precipitado de metanol-clorofórmio para assegurar a desnaturação das proteínas e a remoção de substâncias contaminantes. O sedimento de proteína aparece na interface entre as fases de metanol / água e clorofórmio. A camada superior é removido com cuidado, de modo a não perturbar este pellet. É comum para deixar cerca de 2-3 mm da fase superior, de modo nenhum se perde proteína. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Típica TiO2 perfil fosfopéptido enriquecido Utilizando o protocolo descrito, caudal espermatozóides epididimal foram isolados em qualquer immotile (topo, N = 3) ou estados com motilidade (inferior, N = 3). Um cluster de peptídeo com uma massa mono-isotópica do ~ 651,5 Dum é mostrado para estar presente nas populações com motilidade mas completamente ausente em os immotile (seta). Comparações desta natureza são referidos como &quot;livre de marcador (baseado em MS)&quot;. A massa do péptido e o tempo de retenção são então utilizadas para direccionar o composto para espectrometria de massa em tandem e identificar a proteína a partir dos quais o péptido foi derivado.

A análise proteômica de qualquer tipo de célula é altamente dependente da pureza e do pré-fracionamento do material de partida, a fim de descomplexificar a amostra antes da espectrometria de massa (MS) por cromatografia líquida. Usando técnicas de retrolavagem, espermatozóides puros podem ser obtidos de roedores. Após a digestão, os fosfopeptídeos podem ser enriquecidos com TiO2.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar as alterações em peptídeos fosforilados que ocorrem nos espermatozoides durante a maturação da célula espermática. Isso é conseguido removendo o epidídimo caudal do camundongo, realizando uma lavagem retrógrada das células espermáticas e coletando as células em um tubo capilar microscópico. Em seguida, as células espermáticas são deixadas nadar para uma solução salina balanceada, o que permite a remoção de proteínas contaminantes, e então são lavadas, lisadas e precipitadas para remover sais e gorduras contaminantes.As proteínas da glote são digeridas usando tripsina e, em seguida, enriquecidas com dióxido de titânio para enriquecer peptídeos fosforilados. Os resultados mostram alterações quantitativas no estado de fosforilação das proteínas com base na análise por cromatografia líquida e espectrometria de massas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia reprodutiva, como quais são as alterações fosfoproteômicas quando os espermatozoides percorrem os EPIs ou durante a capacitação.Embora este método tenha proporcionado uma compreensão da biologia das células espermáticas, ele também pode ser aplicado a organismos modelo, estudos de doenças como câncer, patologias neurológicas e vias gerais de transdução de sinal. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é difícil determinar a anatomia das áreas nas quais os EPIs serão manipulados. Comece preparando 200 mililitros de solução de trabalho Biggers, Whitten e Whitten ou BWW, adicionando os seguintes componentes a um litro de água Milli Q para fabricar uma cânula.Utilizando um tubo de polietileno com diâmetros interno e externo de 0,4 milímetros e 1,1 milímetro, respectivamente. Mantenha-o sobre calor baixo até que o tubo comece a derreter. Imediatamente puxe as extremidades do tubo para fora, esticando-o, reduzindo assim o diâmetro externo.Corte o tubo para produzir um estreitamento em uma das extremidades, o que permitirá uma canulação mais fácil do S deens. Corte a extremidade oposta em aproximadamente 15 centímetros. Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 na extremidade romba e acople uma seringa de três mililitros totalmente recolhida a ela.Prepare uma peça bucal de sucção cortando um trecho de 20 centímetros de tubo PE e insira-o em uma das extremidades da cânula. Insira o suporte de microcapilar de vidro e o microcapilar de vidro. Após eutanasiar um camundongo de acordo com o protocolo descrito, faça uma pequena incisão no escroto para expor o epi.Em seguida, utilize um par de pin&ccedil;as de relojoeiro n&uacute;mero cinco para puxar o test&iacute;culo e o epid&iacute;dimo para fora da cavidade. Corte para remover tudo, exceto cerca de um a dois cent&iacute;metros do ducto deferente a partir do cauda do epid&iacute;dimo.Em seguida, corte para remover os ductos EENT proximais e o tecido que conecta o epidídimo ao testículo e remova todo o trato reprodutivo masculino sob um microscópio estereoscópico, utilizando ampliação entre 5 x e 40 x. Coloque um a dois centímetros da extremidade estreitada da cânula no campo de visão e use fita para fixá-la com pinça de relojoeiro número cinco. Segure suavemente cada lado do ducto deferente e puxe-o sobre a porção visível da cânula.Em seguida, com seda preta trançada tratada não absorvível, dê um nó seguro ao redor do tecido canulado utilizando pinças de relojoeiro. Pinças número cinco. Segure a extremidade distal do kata epi ides e remova a túnica Eugenia.Para expor um único túbulo epidérmico, exponha cuidadosamente o túbulo e separe-o para criar uma abertura por onde os espermatozoides possam ser liberados. Em seguida, pressione suavemente o êmbolo da seringa para expelir ar para dentro do ducto deferente. A pressão fará com que os espermatozoides saiam do túbulo rompido.Em seguida, aplique sucção ao bocal para aspirar os espermatozoides para dentro da capilar de vidro. Sopre suavemente no bocal ou acople uma seringa e expulse os espermatozoides da capilar de vidro para um mililitro de solução WW pré-aquecida. Utilize a solução para lavar as células três vezes, a fim de remover quaisquer proteínas contaminantes.Após remover a lavagem final, congele o esperma para uso posterior ou utilize 4% de CHAPS, tioureia 2 molar e Tris 50 milimolar pH 7,4 para solubilizar as proteínas; incube por uma hora com vortex intermitente. Em seguida, centrifugue a solução a 10.000 ×g por 20 minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo para reduzir as ligações dissulfeto e alquilar as proteínas com DTT em uma concentração final de 10 milimolar na solução proteica. Faça vortex e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, adicione 50 milimolares de acetamida de IO ao lisado, vortexie e incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para precipitar as proteínas, combine um volume de lisado, um volume de metanol e 0,5 volumes de clorofórmio. Após vortexar a amostra, centrifugue-a a 10.000 Gs por dois minutos, colete a camada superior, deixando cerca de dois milímetros para evitar a aspiração da interface.Após adicionar um volume de metanol, inverta suavemente o tubo e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante e seque o pellet ao ar por três a quatro minutos para realizar a digestão com tripsina e o enriquecimento de peptídeos fosforilados. Inicie utilizando bicarbonato de amônio 25 milimolar contendo ureia 1 molar.Para reconstituir a tripsina, combine F 50 em uma proporção de um peso por peso de proteína em relação à tripsina e incube em um termoagitador a 37 graus Celsius e 700 RPM durante a noite. Após centrifugar para formar o pellet do material não digerido, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Usando o tampão DHB preparado conforme o protocolo descrito no texto, dilua dez vezes os peptídeos tripsinados e aplique-os a 200 microgramas de esferas secas de dióxido de titânio; incube em agitador rotativo por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, use o tampão DHB para lavar a amostra mais uma vez, antes de usar o tampão de lavagem composto por 80% ACN e 2% TFA para lavar a amostra três vezes. Após a centrifugação final, elua os peptídeos fosforilados adicionando 2,5% de hidróxido de amônio imediatamente após centrifugar e coletar o sobrenadante.Utilize 0,3 microlitros de ácido fórmico para acidificar a amostra, conforme mostrado aqui. Uma vantagem deste protocolo é que os espermatozoides são isolados. Em estado quiescente, muitas células se agregam logo após a expulsão para o meio B WW.No entanto, após 10 minutos, tornam-se modais e a solução se torna homogênea. O preparo descrito neste vídeo produz tipicamente 200 vezes 10 à sexta zoóticos. Esta figura demonstra a pureza dos espermatozoides do epidídimo de rato AR Cota.Um dos principais problemas relacionados à preparação da amostra é o rendimento das etapas de precipitação e digestão. Diferentemente da precipitação com TCA, que frequentemente exige o ajuste do pH da amostra, a precipitação com fenol-clorofórmio é rápida e não acidifica a amostra, conforme mostrado aqui. Abaixo, observa-se o pellet proteico tipicamente obtido a partir de 100 microgramas de amostra, localizado entre a interface inferior e superior demonstrada. Aqui está a reprodutibilidade deste protocolo.As listras azuis que aparecem ao longo do tempo são peptídeos eluindo de uma coluna nano C 18. Conforme a concentração de acetonitrila aumenta na população modal, há um agrupamento de peptídeos em aproximadamente 651,5 Daltons que está completamente ausente na faixa não enriquecida. Assim que o protocolo de enriquecimento de peptídeos fosfatados for uma técnica eficiente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a preparação da amostra é um aspecto fundamental para obter resultados reprodutíveis em proteômica. Este método pode ser adaptado para isolar glicoproteínas, o que pode ser utilizado para responder perguntas adicionais, como quais proteínas sofrem alteração no teor de ácido siálico de seu proteoma.

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos a imunoprecipitação baseada em anticorpos de fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos. Os fosfopeptídeos enriquecidos são concentrados a vácuo e armazenados para análise a jusante.

Enriquecimento de fosfopeptídeos: uma técnica de imunoprecipitação baseada em anticorpos para separar peptídeos fosforilados específicos de misturas complexas de peptídeos

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Este protocolo descreve um procedimento para extrair e enriquecer o phosphopeptides de linhas de células de câncer de próstata ou tecidos para uma análise da phosphoproteome através de massa baseado em espectrometria proteômica.

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.

Análise da síntese proteica epidídimo e secreção

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Este protocolo descreve como realizar registros elétricos de espermatozóides de mamíferos em uma configuração de célula inteira, com o objetivo de registrar diretamente a atividade do canal iônico. O método tem sido fundamental na descrição dos perfis eletrofisiológicos de vários canais iônicos do esperma e ajudou a revelar sua identidade e regulação molecular.

Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Aqui, dois modelos distintos de injeção cirúrgica são descritos para induzir estímulos inflamatórios no segmento inicial (injeção intersticial) e na cauda epidímidea (injeção intravasal) de camundongos. Esses métodos permitem estudos das respostas específicas de região nas diferentes regiões do epidídimo.

Modelos camundongos de epididimite induzidos por padrões moleculares associados a patógenos

Aprenda a analisar fosfopeptídeos em espermatozoides de roedores durante a maturação espermática. Este método utiliza lavagem retrógrada e espectrometria de massas para quantificar mudanças na fosforilação proteica.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

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