Demonstração de Proteolytic ativação do canal de sódio epitelial (ENAC) combinando Medidas atuais com Detecção de clivagem Fragments

O objetivo geral do seguinte experimento é investigar o efeito das proteases sobre o canal de sódio epitelial ou ENaC heterólogamente expresso em óocitos de *Xenopus laevis*. Isso é realizado primeiramente medindo a corrente de célula inteira sensível à amilorida em um óocito. Após permitir que o óocito se recupere, ele é exposto à protease e a corrente é medida novamente.

Em seguida, paralelamente, os ovócitos são biotinilados e submetidos à eletroforese em gel seguida de transferência para membrana (western blotting) para monitorar o aparecimento de fragmentos de clivagem da ENaC gama na superfície celular; os resultados obtidos demonstram uma ligação causal entre a clivagem do canal e sua ativação, com base em uma combinação da técnica de clampeamento de voltagem com dois eletrodos e da abordagem com biotina. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a medição não programada, é que a célula pode ser exposta a proteases ou outros agentes farmacológicos entre as duas medições, por períodos variados de tempo, em um pequeno volume de solução de teste. Dois dias após o isolamento dos ovócitos de zap lava e a injeção com CN de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize ND 96 para preencher uma seringa de um sistema de perfusão por gravidade e ND 96 contendo amida para preencher uma segunda seringa.

Após montar as seringas a 50 centímetros acima da câmara de banho, ligue uma fonte de luz fria de halogênio de 150 watts e ajuste-a a 10 centímetros acima da câmara de banho para ovócitos, permitindo uma boa visualização com o microscópio binocular. Ligue a sucção e posicione o tubo de sucção oposto ao adaptador do tubo de superfusão na câmara de banho para ovócitos. Em seguida, utilizando o dispositivo de controle de fluxo por gravidade IV, ajuste a velocidade de superfusão de cada solução para três a cinco mililitros por minuto. Depois, com um adaptador, conecte os tubos de superfusão à câmara de banho para ovócitos, utilizando uma micropipeta polar para puxar capilares de vidro e obter diâmetros de ponta inferiores a um micrômetro.

Em seguida, utilize cloreto de potássio 3 M para preenchê-los cerca de um quarto da capacidade. Insira as capilares nos suportes dos eletrodos de corrente e de voltagem e, com o auxílio dos micromanipuladores, posicione-os na solução de ND 96 contendo amida a 2 µM. Para medir as correntes totais sensíveis à amida, comece ajustando o botão de compensação de VM para zerar o potencial do eletrodo de voltagem e o botão de compensação de VE para zerar o eletrodo de corrente.

Coloque um sítio UO na câmara de banho e próximo ao eletrodo sensor de voltagem. Em seguida, usando ambos os microeletrodos, perfure suavemente o sítio UO, ajuste o potencial de retenção do amplificador para menos 60 milivolts e ligue o registrador de gráficos. Em seguida, ligue a solução contendo amida.

Em seguida, inicie a gravação e, se necessário, ajuste o ganho. Após a corrente medida atingir um platô estável, mude para a solução livre de amida. Quando um platô de corrente for alcançado, retorne a perfusão à solução contendo amida. Então, após a corrente do sítio UO retornar à corrente basal inicial, desligue o clamp de tensão e retire suavemente os eletrodos para permitir o re-selamento da membrana plasmática nos sítios de implantação.

Coloque o sítio Uoc em um poço de uma placa de 96 poços contendo de 100 a 150 microlitros de solução ND 96 livre de protease por cinco minutos antes de transferir o sítio UOC para uma solução contendo protease ou para uma solução controle sem protease. Trinta minutos após a incubação, repita a medição da corrente, descarte os ovócitos defeituosos sob o microscópio estereoscópico e prepare o anti 96 com e sem a protease apropriada. Prepare pipetas de vidro ao rotulá-las e aquecer brevemente suas pontas para evitar danos aos ovócitos.

Encha cada poço de uma placa de seis poços com 2,5 mililitros de ND 96 à temperatura ambiente ou ND 96 contendo uma protease. Em seguida, adicione 30 ovócitos por poço e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente. Após adicionar 2,5 mililitros de ND 96 aos poços de uma nova placa de seis poços, transfira cada grupo de ovócitos para um poço preenchido com ND 96.

Transfira os oócitos sequencialmente para mais dois poços com ND 96 para lavar qualquer protease remanescente e incube-os no poço final por cinco minutos; prepare a biotina no tampão de eluição de biotina de acordo com o protocolo descrito no texto. Após colocar cada grupo de oócitos em um poço contendo 2,5 mililitros de tampão de eluição de biotina, incube por 15 minutos com agitação suave. Em seguida, após colocar cada grupo de oócitos em um poço contendo 2,5 mililitros de tampão de parada, para interromper a reação de biotinação, transfira-os para um segundo poço com tampão de parada e incube por cinco minutos.

Com agitação suave, transfira cada grupo de ovócitos para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e, utilizando um mililitro de tampão de lise, suplementado com inibidores de protease, lise os ovócitos passando-os através de uma agulha de 27 gauge. Centrifugue os lisados por 10 minutos a 1500 ×g. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro contendo TRITON X-100 e MP-40, e incube os tubos no gelo por 20 minutos. Vortexe repetidamente os tubos para dissolver as proteínas após equilibrar 100 microlitros de beads de agarose por grupo de ovócitos, adicione-os às soluções de detergente com proteína e incube as amostras com rotação superior durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, centrifugue as amostras por três minutos a 1500 vezes G. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo para detectar fragmentos de clivagem da actina na superfície celular. Repare as amostras do gel utilizando tampão de lise para lavar as microesferas três vezes antes de adicionar o tampão amostral 2X SDS-PAGE. Após centrifugar as amostras por três minutos a 20.000 vezes G, pipete o sobrenadante para novos tubos microcêntrifuga.

Analise as amostras por meio de western blot de acordo com o protocolo descrito para investigar se a serina protease plasmina pode ativar correntes mediadas por ENaC. A delta IE de células individuais expressando ENaC foi determinada antes e após uma incubação de 30 minutos das células em solução livre de protease ou contendo plasmina. Utilizando a técnica de fixação de voltagem por dois eletrodos conforme mostrado aqui, a exposição à plasmina aumentou a delta IE em todas as células medidas.

Em contraste, a incubação em solução livre de protease teve um efeito desprezível. Esta figura compara o efeito da chi tripsina sobre o canal ENaC do tipo selvagem e sobre o ENaC com sítios de clivagem da prostasina e do plasmina mutados. Como visto aqui, o canal mutante atrasa e reduz a ativação da corrente mediada por ENaC induzida pela chi tripsina.

Além disso, ele gera um fragmento de clivagem em uma taxa reduzida em comparação com o ENaC do tipo selvagem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a combinação dos métodos descritos pode ser usada para correlacionar o efeito estimulatório das proteases sobre a ocorrência interna com a presença de produtos de clivagem na superfície celular. Isso pode ser útil para uma ampla gama de aplicações, por exemplo, para abordar questões semelhantes relacionadas à regulação de outros canais iônicos, transportadores ou receptores transmembranares.