Name: Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprenda a construir um biorreator vibratório para estudar células-tronco mesenquimais em ambiente que imita a fonação. Este método permite analisar respostas celulares em níveis proteico e translacional.

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Agradecemos ao Dr. Jeffrey Caplan para a sua formação e assessoria em imagem confocal. Agradecemos também o Keck Laboratório de Microscopia Eletrônica e Dr. Chaoying Ni de assistência SEM. Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 e R01DC011377). ABZ reconhece NSF Integrativa Pós-Graduação e Pesquisa Estágio programa (IGERT) para financiamento.

1. Assembléia biorreator (Video 1) <ol><li> Fazer um molde de alumínio (matriz circular + pino espaçador) com as dimensões interiores e exteriores pré-determinados (Figura 1). </li><li> Usando o molde a partir do passo 1.1, o fabrico de uma membrana de silicone (diâmetro: 42 mm, espessura: 1,5 mm, Figura 1) com uma manga entranhado (diâmetro: 12 mm, espessura de ~ 0,25 mm, em forma de pino do espaçador da Figura 1) em o meio usando um kit de elastómero de silicone disponíveis comercialmente. </li><li> Faça um par de blocos de acrílico (Figura 2 (4, 5)), com uma abertura circular (diâmetro: 24 mm) no meio, gravar o topo (1,8 cm de espessura) e inferior (0,9 cm de espessura) blocos com sulcos e ranhuras correspondentes 10. </li><li> Sanduíche a membrana de silicone entre os blocos de acrílico emparelhados. Fixe o conjunto com quatro parafusos de canto usando uma chave de fenda de torque micro definido como uma força constante (35 cN · m). Como resultado, uma prova de água, 24 mm de largura e 18 mm de profundidade da câmara de vibração é criada (Figura 2C). </li><li> Monte um &quot;alcance estendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por baixo da câmara de vibração através de um outro conjunto de parafusos de canto no bloco de acrílico inferior. Neste ponto, um módulo de vibração individual é montado. </li><li> Replicar sete módulos de vibração adicionais. Apor quatro deles a uma das duas barras de alumínio estacionários (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando as bases dos altifalantes em furos circulares espaçados uniformemente (diâmetro: 7 cm, espessura: 2 cm) cortado em barras. Estabilizar cada altifalante inserindo um parafuso através do lado da barra de alumínio em cada furo circular. </li><li> Individualmente controlar os alto-falantes por um seletor de alto-falante. Ligue colunas individuais para o selector ligando fios para as entradas positivas e negativas para o corpo do alto-falante, em seguida, para as respectivas saídas do selector. O seletor de alto-falante permite que o sinal de tele gerador de funções, depois de passar por um amplificador de potência, para alcançar todos os oito alto-falantes de uma só vez (Figura 2E). </li><li> Coloque as duas matrizes de câmara, o seletor de alto-falante e componentes eletrônicos associados em um gabinete anti-umidade. Casa todo o conjunto em uma cultura de células incubadora comercial. </li><li> Alimentar os cabos principais (por meio de um tubo de PVC de qualidade médica) que liga o amplificador de potência e selector de coluna através do conjunto de filtro na parte traseira da incubadora. </li></ol> 2. Fabrication andaime e Caracterização <ol><li> Dissolve-se peletes de PCL em clorofórmio a uma concentração de 15% em peso. Carregar a solução numa seringa de 10 ml tapado com uma extremidades cegas agulha 21 G. </li><li> Tranque a seringa em uma bomba de seringa programáveis ​​e definir a taxa de fluxo de 1 ml / h. </li><li> Coloque o coletor de coberta de folha de alumínio através da agulha na horizontal, com uma agulha de distância ponta-de-colecionador de ~ 18 cm. </li><li> Prenda o alli positivoclipe jacaré para o meio da agulha eo jacaré terreno para o coletor de alumínio, em seguida, definir a voltagem da fonte de alimentação de alta tensão de 15 kV. CUIDADO: alta tensão, manter distância da agulha. </li><li> Sequencialmente ligar a bomba de seringa e de alimentação; rapidamente limpo / remover a solução de polímero residual em torno da ponta da agulha com uma toalha de papel seco, antes jactos fibra estável e Taylor cone 19 são formadas. </li><li> Permitir que as fibras se acumulem no colector de Al com uma espessura de ~ 250-300 mM (~ 7 horas sob as condições de fiação corrente). Armazenar os andaimes resultante num exsicador de vácuo durante 1-2 dias para remover qualquer solvente residual. </li><li> Imagem os andaimes, sputter revestido com ouro, utilizando um microscópio eletrônico de varredura para mostrar a morfologia da fibra consistente. 10 </li></ol> 3. Assembléia biorreator e Caracterização <ol><li> Faça um disco cilíndrico (diâmetro: 8 mm) com quatro braços (comprimento: 2mm) para fora do tapete PCL tal como fiados (Figura 2A), em primeiro lugar usando um diâmetro de 12 milímetros biopsia de perfuração para cortar o diâmetro exterior do disco. Em seguida, utilizar um segundo, 8 milímetros biópsia para fazer quatro 2 mm de comprimento entalhes espaçados uniformemente em torno da lâmina circular para marcar onde os braços estão a ser cortados. Depois de marcar com o punção 8 mm, de utilizar uma lâmina de bisturi para cortar as extremidades dos braços para fora. Insira o andaime na ranhura da membrana de silicone via os braços estendidos (Video 1). Achate o andaime inserido pressionando suavemente a superfície, usando uma pinça de cabeça chata. </li><li> Anexar um pequeno pedaço de folha fina Al (8 milímetros x 2 mm, forma ortogonal, Figura 2B) para o cadafalso PCL para auxiliar a reflexão do laser. </li><li> Fixar a membrana de silicone / PCL andaime montado (conforme descrito no passo 1.4) na câmara de vibração. Adicionar 1,5 ml de água na câmara de modo a hidratar o andaime PCL antes vibração. </li><li> Usando o gerador de funções, apresentar sinal de vibraçãoals (por exemplo, 200 Hz ondas sinusoidais com uma tensão de pico-a-pico, Vpp, de 0,1 V) para a câmara de acrílico ensanduichada. Use um voltímetro para medir com precisão a tensão em cada entrada de alto-falante. Nota: a leitura Vpp do gerador de função será diferente da eventual tensão fornecida para o alto-falante. </li><li> Monte o LDV de ponto único e assegurar o sensor laser cabeça de fibra óptica a um tripé cabeça pan-tilt. Ângulo da cabeça do sensor de modo que ele está apontando perpendicular à mesa. Ligue a cabeça do sensor LDV para o módulo de aquisição de dados através de um cabo coaxial, em seguida, o módulo para o laptop via USB. </li><li> Focar o feixe de laser perpendicular em vários pontos predeterminados na membrana de silicone (Figura 2B e Figura 3). </li><li> Utilizando o software de aquisição de dados, registar o deslocamento meados de membrana. Clique em &quot;Configurações de Aquisição&quot; no menu &quot;Opções&quot;; em seguida, alterar o modo de medição para &quot;FFT221;. Em seguida, clique no botão &quot;medição contínua&quot; na barra de ferramentas principal, em seguida, clique no pico que se forma na freqüência escolhida (Figura 6D) para gravar o deslocamento. </li><li> Traça-se a deslocação no meio da membrana normal (w 0) como uma função da posição relativa ao longo do substrato. Construir um mapa de cores em 3D do perfil vibratório superfície usando Origin software de análise de dados de 8,5. </li></ol> 4. Cultura de Células Vibratória <ol><li> MSC derivadas da medula óssea humana de sub-cultura em frascos de cultura de tecido T150 a uma densidade de sementeira inicial de 4.000-5.000 células / cm2 em meio de manutenção MSC. </li><li> Após 7-8 dias de cultura de células (de ~ 85% de confluência), trypsinize as células com um reagente de dissociação de células, tais como Accutase, contagem utilizando um hemocitómetro, centrifugação (440 xg durante 5 min), e re-suspender o sedimento de células em MSC meio de manutenção fresco a uma concentração de 4,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Mergulhe o Scaffo PCLld em 70% de etanol S / N. Depois o solvente é evaporado, expor ambos os lados do andaime a luz germicida UV (254 nm) durante 5-8 min. </li><li> Embeber o andaime PCL em uma solução de fibronectina de 20 ug / ml a 37 ° C durante 1 hora. Insira o andaime revestido de fibronectina na membrana de silicone. Montar o bioreactor como detalhado no passo 1. </li><li> Distribuir 40 ul da suspensão celular de forma uniforme sobre o andaime PCL garantido. Permitir que as células se fixem durante 1-1,5 horas antes de se adicionar mais 1,5 ml de meio fresco para a câmara de vibração. </li><li> Cultura cadafalso PCL MSC-carregado estaticamente por 3 dias e atualizar a mídia após a conclusão da cultura estática. </li><li> Impor regimes de vibração selecionados para as construções celulares. Observação: Como um exemplo, as células são sujeitas a um 1-h-on-1-h-off (DO) a 200 Hz vibração com aw de 0 a 40 mM durante 12 horas por dia, durante até 7 dias. As construções submetidas a estímulos vibratórios são designadas como amostras Vib e os blovermelho estaticamente em câmaras de vibração idênticos servir como controles estáticos (Stat). </li></ol> 5. Avaliações biológicas <ol><li> Recolhe 200 ul meios de cultura de células a partir de cada câmara em dias alternados (dias 1, 3, 5, e 7) e juntar as aliquotas da mesma amostra em conjunto (800 mL cada). </li><li> Quantificar a produção celular de metaloproteinase-1 (MMP1) e HA utilizando um kit ELISA MMP1 Desenvolvimento e um kit de ELISA competitivo ácido hialurônico, respectivamente, seguindo procedimento do fabricante. Enquanto isso, ensaiar a produção de precursor de elastina solúvel seguindo o procedimento de ELISA previamente relatado. Oito </li><li> Após a conclusão do último ciclo de vibração no dia 7, remover rapidamente as construções celulares a partir das câmaras de vibração usando pinças cortantes e brevemente lavá-los com fosfato fria salina tamponada (PBS, 4 ° C). </li><li> Para a coloração vivo / morto, incuba-se as construções com iodeto de propídio (1:2000 em PBS) eSyto-13 (1:1000 em PBS), simultaneamente, durante 5 min à TA. Imagem as construções marcadas com um microscópio confocal multiphoton. </li><li> Separadamente, snap-congelar as construções celulares PBS-enxaguados em gelo seco e extrair o ARN celular total, seguindo um protocolo previamente relatado para a análise genética. 9 </li><li> Verificar a quantidade e qualidade do ARN extraído utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis. As amostras de ARN com A260/A280 e razões A260/A230 de 1,8-2,2 são utilizados para subsequente análise qPCR. </li><li> Reverso transcrever RNA (500 ng / amostra) em cDNA usando um kit de transcrição reversa disponível comercialmente. </li><li> Realizar a reacção de PCR em um sistema de detecção de sequência em tempo real usando um PCR master mix disponível comercialmente seguindo o procedimento previamente detalhado. Oito </li><li> Analisar os resultados qPCR utilizando software de análise de dados de qPCR comercial. Para garantir a confiabilidade da análise de dados, vários genes de referência (YWHAZ, TBP, PPIA) são empregados como intcontrolos Ernal, e a variância da eficiência de iniciadores específicos é levada em conta. oito </li></ol>

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Não existem interesses financeiros concorrentes.

Engenharia de sucesso dos tecidos das pregas vocais funcionais in vitro requer a recriação de um microambiente-como prega vocal para mediar os comportamentos de células multipotentes. É geralmente aceite que o tecido ou órgão estruturas refletem as funções que são necessários para realizar. 22 para os tecidos das pregas vocais, as vibrações de alta frequência que ocorrem durante a fonação são propostas a ser importante para a maturação do tecido. Em nosso estudo, andaimes PCL são usados ​​para fornec...

A prega vocal humana, composta por uma camada epitelial, a lâmina própria (LP) eo músculo vocal, é um tecido macio especializado que converte o fluxo de ar dos pulmões para ondas acústicas para a produção de som. 1 As pregas vocais oscilam regularmente durante a fonação normal, exibindo as estirpes de até 30% em frequências fundamentais que variam 100-300 Hz. 2 Adulto vocal dobra LP é uma estrutura composta por um gradiente superficial (SLP), de um intermediário (PLI) e um (DLP) camada profunda. Outros grupos de classificação do epitélio eo SLP como a camada mucosa, e combina o ILP e DLP no ligamento vocal. 3 A camada SLP contém principalmente uma matriz amorfa com fibras colágenas pouco dispersos, enquanto que o ligamento é enriquecido com colágeno maduro e fibras de elastina para fornecer a força suficiente. 4 A estrutura e mecânica de pregas vocais nascidos variar significativamente de suas contrapartes adultas. Embora mecanismos que regulam o desenvolvimento das pregas vocais e maturação ainda não são totalmente compreendidos, a evidência experimental apontou para os papéis que definem a tensão mecânica derivada de vocalização. Várias condições médicas, incluindo abuso vocal, infecções, irritantes químicos e procedimentos cirúrgicos, pode danificar a prega vocal. Patologias vocais afeta cerca de 3-9% da população dos EUA. Os métodos atuais de tratamento para patologias vocais são limitados 5 e uma abordagem de engenharia de tecidos à base de células-tronco surgiu como uma estratégia promissora para restaurar a função da prega vocal. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma alternativa adequada para as primárias de fibroblastos de pregas vocais para engenharia de tecidos das pregas vocais. 6-9 especificação destino de células-tronco e desenvolvimento do tecido subseqüente são mediados pelo nicho específico em que residem, de que o estado mecânico é um fator vital. 10 forças mecânicas são reguladores essenciais do tecido morfogênese umnd homeostase, especialmente para tecidos que são rotineiramente submetidos a uma carga. 11 Do ponto de vista da engenharia de tecidos, tem sido demonstrado que a exposição a estímulos mecânicos fisiologicamente relevantes promove a diferenciação das células-tronco e específico do tecido remodelação da matriz 12-15. Bioreactores de cultura de tecidos são concebidos para simular o ambiente fisiológico pretendido para a célula ou tecido de crescimento in vitro. Para a engenharia de tecidos das pregas vocais, é especialmente crítico para recriar o ambiente mecânico das pregas vocais phonating. Um biorreator ideal prega vocal deve entregar efetivamente sinais vibratórios para células de cultura, permitindo o controle fácil sobre frequência, amplitude e duração das vibrações. Titze e colegas de trabalho elaborou um biorreator prega vocal (T1 biorreator) 16 que combina alongamento estático com alta freqüência (20-200 Hz) oscilações de estimular a produção de proteínas da matriz celular. Using deste biorreactor, Webb e colaboradores 17 estudaram os efeitos de 10-dias, as vibrações de 100 Hz em fibroblastos dérmicos cultivadas num ácido hialurónico (HA), à base de hidrogel. As construções submetidas a vibração exibiu uma expressão elevada de HA-sintase-2 (HAS2), decorina, fibromodulim e metaloproteinase de matriz-1 (MMP1), relativa aos controlos estáticos. Os efeitos estimulantes foram encontrados para ser dependente do tempo. Mais recentemente, o nosso grupo de 18 reuniu um biorreator prega vocal (J1 biorreator) usando um amplificador de potência, um gerador de funções, um alto-falante fechado e uma membrana de silicone em circunferência ancoradas que transfere o ar oscilante para as células unidas. Fibroblastos de prepúcio neonatal cultivadas no biorreactor J1 foram sujeitos a 1 h de vibração a 60, 110 ou 300 Hz, com uma tensão no plano de até 0,05%. Os resultados qPCR sugeriu que a expressão de alguns genes de ECM foi moderadamente alterada em resposta às frequências vibratórias variadase amplitudes. Estes projetos de biorreatores, enquanto intrigante, tem várias limitações. Por exemplo, o sistema de T1 requer um grande número de ligações e barras de acoplamento mecânico, que limita as frequências máximas atingível. Além disso, as células podem ser submetidas a indesejável agitação e fluido perturbação mecânica que complicam a interpretação dos dados. O bioreactor de J1, por outro lado, apresenta relativamente baixa eficiência de conversão de energia e não é fácil de usar. Além disso, a vibração freqüentemente destaca as estruturas celulares em carga da membrana de silicone subjacente. O J2 biorreator prega vocal aqui relatado, projetado com base no mesmo princípio como a versão J1, é otimizado para a consistência e reprodutibilidade. As vibrações que imitam fonação são gerados aerodinamicamente em câmaras de vibração instalados individualmente em poli fibroso MSC-povoada (ε-caprolactona) (PCL) andaimes são effectively garantiu. Laser Doppler Vibrometria (LDV) permite ao usuário verificar o perfil de vibração do conjunto membrana / andaime. Na nossa demonstração, as MSCs são expostos a 200 Hz de vibrações sinusoidais com uma (DE) padrão 1-h-on-1-h-off para um total de 12 hr por dia durante 7 dias. As respostas celulares aos estímulos vibratórios impostas são investigados de forma sistemática. No geral, a prega vocal J2 fornece o maior número de características user-friendly, permitindo estudos de cultura celular dinâmica a ser realizado em uma alta taxa de transferência e moda reprodutível.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Cure a membrana a 100 &#176; C para 2 hr</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~ 80 kDa, dissolver O / N</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSCs derivadas da medula óssea humana</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Recebido com passagem 2</td></tr><tr><td>meios de manutenção MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS em meio basal suplementado com L-glutamina, gentamicina e anfotericina</td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA kit</td><td>R & D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA kit</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td>Kit de transcrição <td>reversa QuantiTect da Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td> Alto-falante <td>de substituição 4309155</td><td></td><td>Life Technologies</td></tr><tr><td></td><td>DAYTON audio (via Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Cone de papel, gama completa (80-13,000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro chave de fenda de torque Mountz</td><td></td><td># 020377</td><td>Faixa de torque: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>Seletor de alto-falante estéreo</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Potência máxima de manuseio 50 W</td></tr><tr><td>Gerador de funções&nbsp;</td><td>A Agilent&nbsp;</td><td>33220A</td><td>Faixa de frequência 1 e micro; Amplificador de potência Hz-20 MHz</td></tr><tr><td></td><td>Áudio PYLE</td><td>PylePro PT2400</td><td>Resposta de frequência: 10 Hz-50 kHz, dois canais de alto-falante </td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td>Bomba de seringa <td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td></td>Fonte de alimentação de alta tensão <td>NE-300</td><td></td>da <td>New Era Pump Systems</td></tr><tr><td></td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Tensão de saída: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de Mesa Gold Sputter</td><td>Aspirador Denton</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Vibrômetro Doppler laser&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Medição de velocidade sem contato (0-22 kHz)</td></tr> <tr><td>Sistema de detecção de sequência PCR&nbsp;</td><td>Microscópio</td> confocal <td>multifotônico ABI7300</td><td></td>da Applied Biosystems</tr><tr><td></td><td>Espectrofotômetro Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS&nbsp;</td><td>Produtos NanoDrop via Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft Software de Aquisição de Dados</td><td>Polytec</td><td></td><td>Largura de banda de aquisição de até 40 MHz</td></tr><tr><td>Software de análise de dados Origin 8.5</td>Software de análise de dados <td>qPCR OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Liga de alumínio&nbsp;</td>Blocos de acrílico <td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr> Câmara anti-umidade de policarbonato <tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>resistente a impactos&nbsp; Parafusos de policarbonato</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabo/fio</td><td></td><td></td><td></td>eletrônico</tr><tr><td>Tubulação de PVC de grau médico</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Seringa Tygon S-50-HL</td><td>Transparente, biocompatível</td></tr><tr><td>de 10 ml&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Agulha sem corte</td><td>Peças pequenas</td><td>NE-213PL-25</td> Adaptadores de clipe de jacaré de <td>1-1/2" de comprimento</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>Punção</td></tr> de <tr><td>biópsia de 8 mm</td> totalmente isolado <td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? ID do departamento = 10 & CategoryID=96">Sklar&nbsp; Instrumentos cirúrgicos</a></td><td>96-1152</td><td>Punção de biópsia estéril e descartável</td></tr><tr>de<td>12 mm</td><td>Acuderm (via Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td></td><td>Cultura de células tratada</td></tr></tbody></table>

construção e caracterização de um biorreator fold novel vocal

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

A engenharia in vitro de tecidos mecanicamente ativos requer a apresentação de condições mecânicas fisiologicamente relevantes para células cultivadas. Para emular o ambiente dinâmico das pregas vocais, um novo biorreator de pregas vocais capaz de produzir estímulos vibratórios nas frequências fonatórias fundamentais é construído e caracterizado. O dispositivo é composto por um gerador de funções, um amplificador de potência, um seletor de alto-falantes e câmaras de vibração paralelas. As câmaras de vibração individuais são criadas imprensando uma membrana de silicone feita sob medida entre um par de blocos de acrílico. A membrana de silicone não serve apenas como fundo da câmara, mas também fornece um mecanismo para proteger o andaime carregado de células. Os sinais de vibração, gerados por um alto-falante montado embaixo do bloco de acrílico inferior, são transmitidos para a membrana aerodinamicamente pelo ar oscilante. Oito módulos de vibração idênticos, fixados em duas barras metálicas estacionárias, estão alojados em uma câmara anti-umidade para operação de longo prazo em uma incubadora de cultura de células. As características de vibração do biorreator de pregas vocais são analisadas de forma não destrutiva usando um Vibrômetro Doppler a Laser (LDV). A utilidade do dispositivo de cultura dinâmica é demonstrada pela cultura de construções celulares na presença de vibrações senoidais de 200 Hz com um deslocamento da membrana média de 40 μm. As células-tronco mesenquimais cultivadas no biorreator respondem aos sinais vibratórios alterando a síntese e degradação dos componentes da matriz extracelular relevantes para as pregas vocais. O novo sistema de biorreator aqui apresentado oferece uma excelente plataforma in vitro para o estudo da mecanotransdução induzida por vibração e para a engenharia de tecidos funcionais das pregas vocais.

Os andaimes PCL fabricados por electrospinning conter poros intersticiais porte micro e fibras entrelaçadas de forma aleatória, com um diâmetro médio de 4,7 mM (Figura 4A). Numa ampliação maior, ranhuras em nanoescala e poros são visíveis nas fibras individuais (Figura 4B). Revestimento dos andaimes com fibronectina melhora hidrofilicidade e facilita a adesão celular inicial / espalhando no cadafalso PCL (observação não publicada). Formas de onda sinusoidal ...

Um novo biorreator de pregas vocais capaz de fornecer estimulação vibratória fisiologicamente relevante para células cultivadas é construído e caracterizado. Este dispositivo de cultura dinâmica, quando combinado com um andaime fibroso de poli(ε-caprolactona), cria um ambiente mimético de pregas vocais que modula o comportamento das células-tronco mesenquimais.

Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar o efeito da estimulação vibracional sobre células-tronco mesenquimais utilizando um biorreator projetado para emular a fonação. Isso é conseguido por meio da criação de scaffolds de poli-épsilon-caprolactona para fornecer um substrato tridimensional para culturas celulares semelhante ao ligamento vocal. Como segundo passo, os scaffolds são incorporados a membranas de silicone, o que facilita a transdução da oscilação aos constructos celulares.Em seguida, o vibrometro a laser Doppler é utilizado para determinar as características vibratórias de cada combinação de membrana e suporte. Por fim, podem ser realizadas análises por EISA e R-T-P-C-R quantitativa para avaliar as respostas celulares nos níveis proteico e traducional. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da laringologia, como o modo como a prega vocal amadurece e as consequências do uso indevido da voz.As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de distúrbios das pregas vocais devido ao nível de controle celular agora possível com este método para fabricar o andróide: primeiro, dissolva pelotas de PCL em clorofórmio numa concentração de 15 por cento em peso. Em seguida, carregue a solução resultante em uma seringa de 10 mililitros com agulha romba de 21 calibre. Fixe a seringa em uma bomba de seringa programável e ajuste a taxa de fluxo em um mililitro por hora.Em seguida, posicione um coletor coberto com papel alumínio horizontalmente em frente à agulha, com uma distância entre a ponta da agulha e o coletor de aproximadamente 18 centímetros. Depois, prenda um clipe jacaré positivo no centro da agulha e conecte o clipe ao coletor, colocando-o em terra. Ajuste a tensão na fonte de alta tensão para 15 quilovolts, tomando cuidado para permanecer afastado da agulha.Em seguida, ligue a bomba de seringa e a fonte de alimentação. Use uma toalha de papel seca para remover rapidamente a solução polimérica residual ao redor da ponta da agulha antes da formação do jato estável de fibra e do cone ajustado, permitindo que as fibras se acumulem no coletor de alumínio por cerca de sete horas até atingirem uma espessura de 250 a 300 micrômetros, e então armazene o resultado em suportes estruturais em um dessecador a vácuo por um a dois dias para remover qualquer solvente residual. Os suportes estruturais de PCL conterão poros intersticiais de tamanho micrométrico e fibras aleatoriamente entrelaçadas com diâmetro médio de aproximadamente 4,7 micrômetros.Em uma ampliação maior, sulcos e poros em escala nanométrica serão visíveis nas fibras individuais para montar o biorreator. Comece utilizando um furador de biópsia de 12 milímetros de diâmetro para cortar o diâmetro externo de um disco circular de oito milímetros a partir de uma malha de PCL recentemente eletrofiada. Em seguida, use um segundo furador de biópsia de oito milímetros para marcar onde os braços devem ser cortados.Após a marcação, use uma lâmina de bisturi para cortar as bordas dos braços para fora e insira o andame no sulco da membrana de silicone por meio dos braços alongados. Aplique leve pressão na superfície com pinça de ponta chata para aplainar o andame inserido e, em seguida, fixe um pedaço de folha de alumínio fino de oito milímetros por dois milímetros ao andame de PCL. Para auxiliar na reflexão do laser, prenda o andame de PCL com membrana de silicone montado na câmara de vibração.Em seguida, posicione a membrana de silicone entre blocos de acrílico pareados. Fixe o conjunto com quatro parafusos de canto usando uma chave de fenda de torque micro ajustada a uma força constante de 35 centinewton metros, criando uma câmara de vibração estanque com 24 milímetros de largura e 18 milímetros de profundidade. A seguir, monte um mini woofer de alcance estendido com três pés na parte inferior da câmara de vibração por meio de outro conjunto de parafusos de canto no bloco de acrílico inferior, completando a montagem de um módulo de vibração individual.Após replicar mais sete módulos de vibração, fixe quatro desses módulos a uma das duas barras de alumínio fixas colocando as bases dos alto-falantes em orifícios circulares espaçados igualmente. Corte as barras e estabilize cada alto-falante inserindo um parafuso através do lado da barra de alumínio em cada orifício circular. Em seguida, conecte os alto-falantes individuais ao seletor ligando fios às entradas positiva e negativa no corpo do alto-falante e às saídas correspondentes no seletor.O seletor de alto-falantes permite que o sinal do gerador de funções, após passar por um amplificador de potência, alcance os oito alto-falantes simultaneamente. Em seguida, posicione os dois conjuntos de câmaras, o seletor de alto-falantes e a eletrônica associada em uma caixa anti-umidade, acomodando todo o conjunto em uma incubadora comercial para cultivo celular. Passe os cabos principais através de um trecho de tubo de PVC de grau médico e conecte o amplificador de potência e o seletor de alto-falantes por meio do conjunto de filtros localizado na parte traseira da incubadora.Para caracterizar primeiramente o biorreator, adicione 1,5 mililitros de água na câmara de vibração para hidratar a matriz de PCL antes da vibração. Em seguida, utilizando o gerador de funções, introduza sinais de vibração na câmara acrílica embutida. Use um voltímetro com precisão.Meça a tensão em cada entrada do alto-falante e, em seguida, monte o vibrador a laser de ponto único. Fixe o sensor a laser de fibra óptica. Posicione-o em um tripé com cabeça panorâmica e incline a cabeça do sensor de modo que ela aponte perpendicularmente à superfície da mesa.Em seguida, conecte a cabeça do sensor ao módulo de aquisição de dados por meio de um cabo coaxial e o módulo ao laptop por meio da porta USB. Foque o feixe de laser perpendicularmente em vários pontos predeterminados na membrana de silicone e, usando o software de aquisição de dados, clique em configurações de aquisição no menu de opções. Em seguida, altere o modo de medição para FFT e clique na ferramenta de medição contínua na barra de ferramentas principal.Clique no pico que se forma na frequência escolhida para registrar o deslocamento e traçar o deslocamento normal no ponto médio da membrana em função da posição relativa ao longo do substrato. Para montar um cultivo celular vibratório, primeiro subcultive células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana em frascos de cultivo tecidual T um 50 a uma densidade inicial de semeadura de quatro a cinco vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado em meio de manutenção por sete a oito dias; no dia anterior ao experimento, imersa uma matriz de PCL em etanol 70% durante a noite.Na manhã seguinte, desprenda as células com Accutase e, em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em meio de manutenção fresco numa concentração de 4,5 vezes 10 à sexta células por mililitro. Após a evaporação do etanol, exponha ambos os lados da estrutura a luz UV germicida por cinco a oito minutos. Em seguida, mergulhe a estrutura de PCL em uma solução de fibronectina a 20 microgramas por mililitro a 37 graus Celsius após uma hora.O biorreator conforme acabou de ser demonstrado e, em seguida, distribua uniformemente 40 microlitros da suspensão celular sobre o suporte fixado. Deixe as células aderirem por uma a 1,5 hora e, então, adicione 1,5 mililitro adicional de meio fresco à câmara de vibração. Após cultivar o suporte de PCL carregado com células-tronco mesenquimais, em condições estáticas por três dias, troque o meio e, em seguida, aplique os regimes de vibração selecionados sobre as construções celulares.As frequências de vibração são escolhidas para refletir as frequências fundamentais da fala humana, e existe uma relação linear entre o deslocamento normal e a tensão máxima no intervalo de zero a 0,125 volts; para todas as frequências testadas, a um dado valor de tensão máxima, o deslocamento normal diminui à medida que a frequência aumenta de 100 a 300 hertz. As respostas celulares a estímulos vibratórios examinadas ao nível de mRNA, em termos da expressão de proteínas essenciais da prega vocal, como a sintase de hialuronano, elastina, colágeno tipo III alfa 1 e metaloproteinase da matriz 1, demonstram que a vibração cíclica com período de uma hora ligada e uma hora desligada resulta em um aumento de 2,3 vezes na expressão de elastina em relação aos controles estáticos.No sétimo dia, as estimulações vibratórias também aumentam moderadamente a expressão de colágeno. É importante observar que a expressão das principais enzimas de remodelação da matriz extracelular, hialuronano sintase um e metaloproteinase da matriz um, é significativamente aumentada pelos sinais de vibração do terceiro ao sétimo dia. Células cultivadas dinamicamente produzem 4,2 ± 0,1 microgramas por miligrama por peso seco do suporte de elastina solúvel, conforme detectado por ELISA após sete dias de vibrações.Enquanto os controles estáticos acumulam apenas 2,7 ± 0,2 microgramas por miligrama de elastina. Em média, vibrações de sete dias, uma hora ligada e uma hora desligada resultam em aumentos de 2,2 e 4,7 vezes em relação aos controles estáticos correspondentes na secreção de ácido hialurônico e MMP-1, respectivamente. Embora nosso sistema tenha sido projetado para estudar a fisiologia em formato VOCO, ele também pode ser aplicado a muitos outros sistemas.Por exemplo, tecidos auriculares e dérmicos humanos. Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.

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