Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

Um novo biorreator de pregas vocais capaz de fornecer estimulação vibratória fisiologicamente relevante para células cultivadas é construído e caracterizado. Este dispositivo de cultura dinâmica, quando combinado com um andaime fibroso de poli(ε-caprolactona), cria um ambiente mimético de pregas vocais que modula o comportamento das células-tronco mesenquimais.

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar o efeito da estimulação vibracional em células-tronco mesenquimais usando um biorreator projetado para emular a fonação. Isso é conseguido criando andaimes de capralactona poli épsilon para fornecer um substrato tridimensional para culturas de células semelhantes ao ligamento vocal. Como segunda etapa, os scaffolds são incorporados em membranas de silicone, o que facilita a transdução da oscilação para as construções celulares.

Em seguida, o vibratório doppler a laser é utilizado para determinar as características vibracionais de cada combinação de andaime de membrana. Em última análise, análises EISA e quantitativas R-T-P-C-R podem ser realizadas para avaliar as respostas celulares nos níveis proteico e translacional. Este método pode responder a questões-chave no campo da laringologia, como o amadurecimento da prega vocal e as consequências do mau uso vocal.

As implicações desta técnica se estendem para o tratamento de distúrbios das pregas vocais devido ao nível de controle celular agora possível com este método para fabricar o andaime, primeiro dissolver os pellets de PCL em clorofórmio a uma concentração de 15 por cento em peso. Em seguida, coloque a solução resultante em uma seringa de 10 mililitros tampada com uma agulha de ponta romba de calibre 21. Trave a seringa em uma bomba de seringa programável e ajuste a vazão em um mililitro por hora.

Em seguida, coloque um coletor coberto com papel alumínio em frente à agulha horizontalmente com uma ponta da agulha para uma distância do coletor de cerca de 18 centímetros. Em seguida, prenda um clipe jacaré positivo no meio da agulha e aterre o clipe no coletor. Defina a tensão na fonte de alimentação de alta tensão para 15 quilovolts, tomando cuidado para ficar longe da agulha.

Em seguida, ligue a bomba da seringa e a fonte de alimentação. Use uma toalha de papel seca para remover rapidamente a solução de polímero residual ao redor da ponta da agulha antes que o jato de fibra estável e as formas de cone de alfaiate permitam que as fibras se acumulem no coletor de alumínio por cerca de sete horas a uma espessura de 250 a 300 micrômetros e, em seguida, armazene o resultado em andaimes em um dessecamento a vácuo por um a dois dias para remover qualquer solvente residual. Os andaimes PCL conterão poros intersticiais de tamanho mícron e fibras emaranhadas aleatoriamente com um diâmetro médio de cerca de 4,7 micrômetros.

Em uma ampliação maior, sulcos e poros em nanoescala serão visíveis nas fibras individuais para montar o biorreator. Comece usando um punção de biópsia de 12 milímetros de diâmetro para cortar o diâmetro externo de um disco circular de oito milímetros de um tapete PCL recentemente girado. Em seguida, use um segundo punção de biópsia de oito milímetros para marcar onde os braços devem ser cortados.

Após a pontuação, use uma lâmina de bisturi para cortar as bordas dos braços para fora e insira o andaime na ranhura da membrana de silicone através dos braços estendidos. Alise o andaime inserido pressionando suavemente a superfície usando uma pinça de cabeça chata e, em seguida, prenda um pedaço de folha de alumínio fina de oito milímetros por dois milímetros ao andaime PCL. Para auxiliar na reflexão do laser, prenda o andaime PCL de membrana de silicone montado na câmara de vibração.

Em seguida, coloque a membrana de silicone entre os blocos de acrílico emparelhados. Prenda o conjunto com quatro parafusos de canto usando uma chave de fenda de microtorque ajustada para uma força constante de 35 centavos por Newton metros, criando uma câmara de vibração estanque de 24 milímetros de largura e 18 milímetros de profundidade. Em seguida, montou um mini wooer de alcance estendido de três pés sob a câmara de vibração através de outro conjunto de parafusos de canto no bloco de acrílico inferior, completando a montagem de um módulo de vibração individual.

Depois de replicar sete módulos de vibração adicionais, fixe quatro dos módulos em uma das duas barras de alumínio estacionárias, colocando as bases dos alto-falantes em orifícios circulares uniformemente espaçados. Corte nas barras, estabilize cada alto-falante inserindo um parafuso na lateral da barra de alumínio em cada orifício circular. Em seguida, conecte os alto-falantes individuais ao seletor conectando fios às entradas positiva e negativa no corpo do alto-falante e às saídas correspondentes no seletor.

O seletor de alto-falantes permite que o sinal do gerador de funções depois de passar por um amplificador de potência alcance todos os oito alto-falantes de uma só vez. Em seguida, coloque as duas matrizes de câmaras, o seletor de alto-falantes e os componentes eletrônicos associados em um gabinete anti-umidade, abrigando todo o conjunto em uma incubadora comercial de cultura de células. Passe os cabos principais por um pedaço de tubo de PVC de grau médico e conecte a potência amplifier e seletor de alto-falante através do conjunto de filtro na parte traseira da incubadora.

Para caracterizar o biorreator primeiro, adicione 1,5 mililitros de água na câmara de vibração para hidratar o andaime PCL antes da vibração. Em seguida, usando o gerador de funções, introduza sinais de vibração na câmara de acrílico imprensada. Use um voltímetro com precisão.

Meça a tensão em cada entrada do alto-falante e, em seguida, monte o doppler a laser de ponto único vibratório. Prenda o sensor a laser de fibra óptica. Dirija-se a um tripé de cabeça inclinada panorâmica e incline a cabeça do sensor de forma que ela aponte perpendicularmente ao tampo da mesa.

Em seguida, conecte o cabeçote do sensor ao módulo de aquisição de dados por meio de um cabo coaxial e o módulo a um laptop por meio da porta USB. Focalize o feixe de laser perpendicularmente em vários pontos predeterminados na membrana de silicone e, em seguida, usando o software de aquisição de dados, clique em configurações de aquisição no menu de opções. Em seguida, altere o modo de medição para FFT e clique na ferramenta de medição contínua na barra de ferramentas principal.

Clique no pico que se forma na frequência escolhida para registrar o deslocamento e plotar o deslocamento normal da membrana média em função da posição relativa no substrato. Para configurar uma cultura de células vibratórias, primeiro subcultive células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana em T um 50. Frascos de cultura de tecidos com uma densidade inicial de semeadura de quatro a cinco vezes 10 a terceiras células por centímetro quadrado em meio de manutenção por sete a oito dias no dia anterior ao experimento imersivo Um andaime PCL em 70% de etanol durante a noite.

Na manhã seguinte, retire as células com Accutane e, em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet em meio de manutenção fresco a uma concentração de 4,5 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Depois que o etanol evaporar, exponha ambos os lados do andaime à luz ultravioleta germicida por cinco a oito minutos. Em seguida, mergulhe o andaime PCL em uma solução de fibronectina de 20 microgramas por mililitro a 37 graus Celsius após uma hora.

O biorreator acabou de ser demonstrado e, em seguida, distribui uniformemente 40 microlitros da suspensão celular no andaime seguro. Deixe as células se conectarem por uma a 1,5 horas e, em seguida, adicione mais 1,5 mililitros de mídia fresca à câmara de vibração. Depois de cultivar o andaime PCL carregado de células-tronco mesenquimais, estaticamente por três dias, atualize o meio e, em seguida, imponha os regimes de vibração selecionados às construções celulares.

As frequências de vibração são escolhidas para refletir as frequências fundamentais da fala humana, e há uma relação linear entre o deslocamento normal e a tensão do topo de pico na faixa de zero a 0,125 volts para todas as frequências testadas em uma determinada tensão de pico do topo, o deslocamento normal diminui à medida que a frequência aumenta de 100 a 300 hertz. Respostas celulares a estímulos vibratórios examinados nos níveis de mRNA em termos da expressão da prega vocal essencial. Proteínas da matriz extracelular, como elastina hialuronano sintase um, colágeno tipo três alfa um e metaloproteinase da matriz um, demonstram que a vibração cíclica de uma hora em uma hora leva a um aumento de 2,3 vezes na expressão de elastina em relação aos controles estáticos.

No sétimo dia, os estímulos vibratórios também aumentam moderadamente a expressão do colágeno. Vale ressaltar que a expressão das principais enzimas de remodelação da matriz extracelular, hialuronano sintase um e metaloproteinase da matriz um, é significativamente aumentada pelos sinais de vibração do terceiro ao sétimo dia. As células cultivadas dinamicamente produzem 4,2 mais ou menos 0,1 microgramas por miligrama por elastina solúvel em peso de andaime seco, conforme detectado por Elisa após sete dias de vibrações.

Considerando que os controles estáticos acumulam apenas 2,7 mais ou menos 0,2 microgramas por miligrama de elastina. Em média, sete dias, uma hora em uma hora de folga as vibrações resultam em aumentos de 2,2 e 4,7 vezes em relação aos controles estáticos correspondentes na secreção de ácido hialurônico e MMP um, respectivamente. Embora nosso sistema seja projetado para estudar a fisiologia da forma VOCO, ele também pode ser aplicado a muitos outros sistemas.

Por exemplo, orelha e tecidos dérmicos humanos. Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.