4.10: Genotipagem de Camundongos

A genotipagem é o processo de detectar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA no genoma de um determinado organismo.

Uma vez que os genes podem influenciar o fenótipo de um camundongo, ser capaz de sondar a composição genética de um camundongo individual, ou "genótipo", é fundamental para atribuir um fenótipo a um gene específico. Este vídeo explorará a genética do camundongo, demonstrará as principais etapas do procedimento de genotipagem e explicará como interpretar os resultados da genotipagem baseada em PCR.

Para entender o que os pesquisadores procuram quando genotipam camundongos, vamos revisar algumas manipulações comuns da genética de camundongos.

Para estudar um gene, os cientistas freqüentemente interrompem sua função alterando sua sequência genética. No entanto, os camundongos são diplóides, então eles têm duas cópias de qualquer gene. Como a maioria dos genes precisa de apenas uma cópia normal para funcionar, os camundongos devem ser criados para produzir um animal com ambos os genes interrompidos antes de estudar o fenótipo.

Este genótipo é chamado de "nocaute homozigoto", ou, mais comumente, apenas ?nocaute? para abreviar. Por outro lado, um camundongo normal com duas cópias funcionais é chamado de "tipo selvagem homozigoto", ou apenas ?tipo selvagem.? Finalmente, camundongos com apenas uma cópia funcional são chamados de ?heterozigotos,? ou ?hets.?

Em vez de remover material genético, alguns experimentos exigem a introdução de sequências de DNA no genoma do camundongo. Esses fragmentos de DNA inseridos são chamados de "transgenes", e os ratos que os carregam são "transgênicos". O ?transgene? introduzido em camundongos é aquele que impulsiona a expressão da proteína fluorescente verde, ou GFP, da água-viva. Ao usar um promotor específico do tecido (uma sequência regulatória que "promove" a atividade de um gene) para impulsionar a produção de GFP, as células de um tipo específico de tecido podem ser facilmente identificadas por fluorescência verde.

Como muitas mudanças genéticas não levam a um fenótipo prontamente observável, como a expressão de GFP, os camundongos precisam ser genotipados para determinar qual animal específico deve ser usado em experimentos. Antes da genotipagem, os camundongos devem ser cuidadosamente rotulados para que possam ser identificados novamente mais tarde. Não, você precisará de algo mais permanente do que isso. Um método comum é fazer entalhes na orelha, de modo que a posição e o número de entalhes correspondam a um número de identificação.

Uma vez que o camundongo é rotulado, colete um pequeno pedaço de tecido (normalmente 2 a 5 mm de cauda, usando uma lâmina de barbear ou tesoura) para extrair o DNA. Se você estiver coletando tecido de mais de um camundongo, marque os segmentos usados da lâmina para garantir que você não usará a mesma peça no próximo animal, o que pode levar à contaminação cruzada em suas amostras.

Para iniciar o processo de separação do material genético de outros componentes do tecido, a amostra é digerida em tampão de lise contendo a enzima proteinase K. Após uma digestão durante a noite, a amostra é centrifugada em pellets de cabelo e qualquer outro material não digerido. Para isolar o DNA do lisado digerido, um método simples e eficaz é adicionar álcool para precipitar ácidos nucléicos. Após uma breve incubação, a amostra é centrifugada novamente para coletar o DNA em um pellet.

Após a lavagem com etanol a 70% para remover o excesso de sais, o pellet de DNA é ressuspenso em água ou tampão e está pronto para genotipagem.

Existem muitas estratégias para determinar se uma sequência específica de DNA está presente em seus camundongos. A maioria deles exige que você primeiro amplifique a região genética de interesse usando a reação em cadeia da polimerase, ou PCR. Para obter mais informações sobre como configurar o PCR, confira o JoVE Science Education ? Guia para PCR.?

Um método para distinguir genótipos é detectar mudanças no tamanho do fragmento amplificado por PCR. Digamos que você esteja rastreando camundongos com uma inserção genética de 700 pares de bases. Após a PCR, as bandas do tipo selvagem são 200 pares de bases e as bandas transgênicas devem ser 900 pares de bases.

Depois de executar seu PCR, separe os produtos de reação em um gel de agarose de porcentagem apropriada, para que você possa distinguir os tamanhos de seus fragmentos. O controle wildtype deve ter apenas a banda wildtype de 200 pares de bases; o controle transgênico deve ter apenas um par de bases 900, banda transgênica; e o controle het deve ter ambas as bandas. Finalmente, um ?modelo sem modelo? O controle é incluído para garantir que os reagentes não contenham nenhum DNA contaminante e, portanto, não gerem bandas.

Agora que estamos confiantes de que os controles funcionaram conforme o esperado, vamos verificar os ratos desconhecidos. Como os camundongos 1 e 2 têm apenas uma banda de tipo selvagem, eles são homozigotos do tipo selvagem. Os camundongos 4 e 6 têm apenas uma banda transgênica e, portanto, são transgênicos homozigotos.

E os camundongos 3 e 5 têm duas bandas cada um e, portanto, são hets.

Finalmente, quando você voltar para encontrar os camundongos com o genótipo desejado, basta combinar o padrão de entalhes da orelha com o número de identificação do camundongo.

Depois de entender o que é genotipagem e como ela é feita, vejamos alguns exemplos de por que ela é útil.

Em alguns casos, modificações genéticas mais complexas são necessárias para produzir o fenótipo desejado. Por exemplo, para estabelecer esse modelo de câncer de pele em camundongos, são necessários dois transgenes. Um carrega um "oncogene" induzível,? ou um gene que pode causar câncer, e o segundo carrega a enzima Cre recombinase, que é expressa apenas nas células da pele e extirpa uma sequência que impede a transcrição do oncogene, permitindo assim a expressão do oncogene. Para produzir descendentes com ambos os transgenes, camundongos heterozigotos para cada um são acasalados. A genotipagem é então usada para identificar a prole desejada.

Às vezes, pode não ser possível genotipar camundongos antes de um experimento. Por exemplo, neste estudo da frequência cardíaca embrionária, não é viável coletar tecido para genotipagem dos embriões sem interromper seu comportamento. Portanto, as posições do embrião dentro da mãe são primeiro cuidadosamente rotuladas e, em seguida, as medições de ultrassom são registradas. Finalmente, biópsias de cauda são coletadas para determinar o efeito do genótipo na frequência cardíaca.

Este vídeo demonstrou um método de extração de DNA, mas existem muitas variações. Por exemplo, o sistema de PCR direto requer menos de cinco minutos de digestão do tecido. Além disso, depois de girar o material não digerido, o sobrenadante está pronto para PCR, eliminando a necessidade de purificação do DNA.

Você acabou de assistir ao guia de JoVE para genotipagem de camundongos. Neste vídeo, revisamos os fundamentos da genética do camundongo, como preparar e analisar amostras de DNA de camundongos, bem como algumas aplicações práticas dessa técnica. Obrigado por assistir!