Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

O objetivo geral deste procedimento é gerar células progenitoras de crista neural a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio de um protocolo definido, reprodutível e rápido. Essas células podem então ser utilizadas para o estudo de doenças relacionadas à crista neural in vitro ou para a diferenciação contínua dessas células em células derivadas. Isso é realizado inicialmente por meio do plaqueamento de uma alta densidade de células-tronco pluripotentes humanas em monocamada sobre matrigel.

O segundo passo consiste em diferenciar as células em células neuroepiteliais utilizando uma sequência e combinação definidas de moléculas pequenas que afetam vias de sinalização-chave. Em seguida, as células neuroepiteliais são replatadas e diferenciadas ainda mais em células precursoras da crista neural. O passo final é isolar as células da crista neural por meio de triagem celular ativada por fluorescência.

No final, ensaios de imunofluorescência e funcionais, como a capacidade da célula de migrar, são utilizados para demonstrar que células da crista neural adequadas foram geradas. A principal vantagem desta técnica em relação aos protocolos existentes para a derivação de células da crista neural a partir de células-tronco pluripotentes humanas é que ela é mais curta. Dura apenas 18 dias.

É mais reprodutível devido à ausência de células alimentadoras MS cinco. É fácil ampliar o processo e é altamente reprodutível entre linhagens de células-tronco pluripotentes humanas. As implicações desta técnica estendem-se a estudos sobre mecanismos de doenças humanas relacionadas à linhagem neurore e mostram potencial para melhorar a modelagem in vitro detalhada e triagem de fármacos para essas doenças.

Antes de iniciar este protocolo, certifique-se de que as colônias de células-tronco pluripotentes humanas sejam grandes o suficiente para serem vistas a olho nu e ainda apresentem bordas nítidas, com poucas células diferenciadas em suas extremidades. Em seguida, quando as CTPH estiverem prontas para serem repassadas, aspire o meio, lave uma vez com cinco mililitros de PBS 1X e adicione quatro mililitros de tripsina 0,05% com EDTA às células. Agite vigorosamente o recipiente na posição horizontal por dois minutos, até que os fibroblastos embrionários de camundongo sejam visualizados ao microscópio se destacando da placa como células isoladas.

As colônias de HPSC permanecerão aderidas à placa como colônias; em seguida, aspire imediata e completamente a tripsina e deixe a placa à temperatura ambiente por dois a quatro minutos. Adicione dois mililitros de meio HES à placa e use uma pipeta P1000 para destacar as células. Se as células não se soltarem facilmente, incube a placa por mais dois a três minutos.

À temperatura ambiente, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros contendo oito mililitros de meio HES, suplementado com 10 micromolares de Y 2 7 6 3 2 diidrocloridrato. Em seguida, aspire o Matrigel de uma placa de 10 centímetros previamente tratada e plaque as células em uma proporção de um para um ou um para dois sobre a placa tratada com Matrigel. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono.

Alimente as células diariamente com meio HES até que estejam prontas para a diferenciação. Em seguida, inicie a diferenciação neural quando as células estiverem de 90% a 100% confluentes. Este é o dia zero.

Alimente as células diariamente do dia zero ao dia três com 10 mililitros de meio de diferenciação KSR contendo 0,1 micromolar de LDN 193189 e 10 micromolares de SB 431542. Em seguida, nos dias quatro e cinco, alimente as células com 10 mililitros de meio contendo 75% de meio de diferenciação KSR e 25% de meio de diferenciação And2, 0,1 micromolar de LDN 193189 e 10 micromolares de SB 431542. Nos dias seis e sete, alimente as células com meio ajustado para conter 50% de meio de diferenciação KSR e 50% de meio de diferenciação And2, além de ser suplementado com 0,1 micromolar de LDN 193189 e 10 micromolares de SB 431542.

Para o oitavo ao nono dia, alimente as células com 25% KSR meio de diferenciação e 75% meio de diferenciação dois, ambos contendo 0,1 micromolar LDN 193189 e 10 micromolar SB 4352. Em seguida, no nono e décimo dia, prepare placas de cultura com poli-L-ornitina, laminina um e fibronectina conforme descrito no protocolo do texto, que serão usadas para o replante das células. No 11º dia, alimente as células com meio de diferenciação N2, suplementado com 0,1 micromolar LDN 193109 e 10 micromolar SB 431542. No 10º dia, no 11º dia, aspire a solução de laminina um e fibronectina das placas de cultura previamente preparadas e deixe secar à temperatura ambiente em uma cabine de cultura tecidual por 20 a 30 minutos.

Em seguida, remova o meio das células em diferenciação e lave as células uma vez com um XPBS. Então, adicione oito mililitros de acuate a cada placa de 10 centímetros e incube as placas por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, use um levantador de células para destacar as células e, em seguida, ressuspenda-as na solução de Accutane.

Com uma pipeta de cinco mililitros, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS 1x ao tubo e centrifugue as células por cinco minutos a 115 ×g. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de PBS 1x. Então, filtre a suspensão celular através de um filtro para células de 40 micrômetros para garantir uma suspensão de célula única.

Conte as células utilizando um hemocitômetro. Centrifugue as células novamente por cinco minutos a 115 Gs e re-suspenda as células em uma concentração de 100.000 a 150.000 células por 10 microlitros de meio de diferenciação N2 suplementado. Utilize uma pipeta repetidora para colocar gotas de 10 microlitros da suspensão celular em placas de cultura de 15 centímetros previamente tratadas com poli-L-oran.

Laminina um e fibronectina. Deixe as gotas em repouso à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Em seguida, adicione cuidadosamente 30 mililitros do meio de diferenciação N dois suplementado à placa sem perturbar as gotas.

Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em um incubador com 5% de dióxido de carbono. No dia 12, adicione cuidadosamente às células 20 mililitros de meio de diferenciação N2 contendo 200 micromolar de ácido ascórbico, 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro, 100 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos oito e 20 nanogramas por mililitro de sonic hedgehog por placa de 15 centímetros.

Em seguida, do dia 14 ao dia 17, alimente as células a cada dois ou três dias com meio de diferenciação N2 contendo apenas 200 micromolares de ácido ascórbico, 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e 100 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos oito. Prepare placas com politirosina, laminina e fibronectina nos dias 16 e 17 para serem utilizadas no replante das células da crista neural.

Após a análise por fax no dia 18, depois que as células tiverem sido separadas por meio de citometria de fluxo ativada por fluorescência, conte as células da crista neural e, em seguida, centrifugue-as a 115 Gs por cinco minutos. Re-suspenda o pellet celular em meio de diferenciação N dois suplementado com 10 nanogramas por mililitro.

FGF dois 20 nanogramas por mililitro de EGF e 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 di-hidrocloreto numa concentração de 30.000 células por 10 microlitros. Seque completamente as placas de cultura previamente preparadas com poli-L-ornitina, laminina um e fibronectina. Em seguida, plaque aproximadamente 50 a 70 gotas da suspensão celular por placa de 10 centímetros.

Incube as células à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos em 20 mililitros de N dois. Meio de diferenciação suplementado com 10 nanogramas por mililitro. FGF dois 20 nanogramas por mililitro EGF e 10 micromolar Y 2 7 6 3 2 di-hidrocloridrato em cada placa de 10 centímetros sem perturbar as gotas.

Em seguida, incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, manter e subcultivar as células da crista neural, de acordo com o protocolo textual anexo; as células da crista neural foram derivadas de células-tronco pluripotentes humanas em 18 dias. Utilizando este novo protocolo de diferenciação in vitro livre de células de apoio.

A análise de fax no dia 18 identificou células positivas para ambos HNK-1 e P75, o que confirmou a presença de células da crista neural. Em ambos os protocolos de diferenciação — sem células de apoio e dependente de células de apoio — as células da crista neural passaram por um estágio de roseta neural. Além disso, as células separadas por citometria de fluxo apresentam morfologia idêntica e expressam os marcadores da crista neural, HNK-1 e AP2. Uma comparação da expressão gênica global de células da crista neural derivadas desses dois protocolos de diferenciação revelou que ambos os grupos de células se agrupam estreitamente.

A análise da capacidade de migração das células da crista neural derivadas utilizando o protocolo livre de células de suporte mostrou que as células migraram com sucesso para dentro do arranhão após 48 horas. Essas células também possuem o potencial de serem diferenciadas em células do sistema nervoso autônomo, conforme confirmado pela coloração positiva para mash one e touch one após quatro dias adicionais de diferenciação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como neuralizar células-tronco pluripotentes humanas e derivar células progenitoras da crista neural in vitro.