Introduzindo agentes experimentais em camundongos

Introducing Experimental Agents into the Mouse

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Introducing Experimental Agents into the Mouse

4.1: Mouse Genotyping

4.3: Zebrafish Maintenance and Husbandry

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07:40 min

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April 30, 2023

Overview

Muitas investigações realizadas em camundongos (Mus musculus) exigem a administração de um agente experimental para o animal. Por exemplo, pode ser de interesse testar a eficácia de uma terapia específica, induzir uma condição patológica ou administrar anestesia ou cuidados paliativos. Para garantir uma entrega segura e eficiente, é importante considerar uma variedade de fatores antes da administração do tratamento.

Este vídeo, que revisa a administração do agente no mouse, começa destacando propriedades a considerar, como viscosidade, dose e palatabilidade, ao planejar a administração de um agente experimental. A discussão subsequente se concentra nos métodos de injeção, incluindo a delineação dos componentes estruturais da seringa e da agulha, como interpretar o medidor de agulhas e métodos seguros de contenção do rato para locais comuns de injeção. Instruções detalhadas são fornecidas para a realização de injeções subcutâneas (SC/SubQ), intraperitoneal (IP) e veia da cauda (IV) em camundongos. Além disso, são discutidas aplicações dessas técnicas, bem como rotas alternativas de administração.

Procedure

Muitos experimentos dependem da administração de agentes para ratos. Frequentemente, esses agentes são introduzidos para testar seu efeito em um processo biológico. Os agentes também podem desempenhar um papel importante na preparação de animais para experimentação. Neste vídeo, discutiremos importantes considerações para a administração de agentes experimentais, ferramentas para entrega de agentes, algumas rotas específicas de administração e aplicações dessas técnicas essenciais.

Então, quais fatores devem ser considerados ao planejar a administração de um agente experimental?

A primeira é a dose apropriada. Normalmente calculado em relação ao peso do animal, fornecer a dose correta de um agente é crítico.

A rota da administração também é importante a considerar. Propriedades como palatabilidade do agente, viscosidade, a quantidade a ser administrada, o tecido alvo e a taxa de disseminação desejada determinarão qual das muitas rotas de administração disponíveis você deve escolher. Neste vídeo vamos focar na injeção, que é um dos métodos mais eficientes de entrega de agentes.

Antes de discutir como realizar uma injeção, vamos nos familiarizar com as principais ferramentas para a técnica.

Começaremos com a seringa. Os líquidos são mantidos dentro do barril, que é marcado para permitir medições precisas de volume. O êmbolo se encaixa dentro do barril e é usado para conduzir o movimento de seu conteúdo. Por fim, a ponta da seringa é o local de fixação do cubo de agulha. Na extremidade oposta do eixo da agulha você encontrará uma ponta chanfrada. Cuidado, é muito afiado!

Os hubs de agulha são codificados por cores para refletir seu tamanho, ou “gauge”, com números de bitola mais altos indicando agulhas menores. Os medidores são escolhidos com base na rota desejada de entrega: quanto menor ou mais sensível a área, menor a agulha necessária.

Depois de selecionar a agulha e a seringa apropriadas para o seu experimento, desenhe o agente no barril puxando para trás no êmbolo. Bolhas de ar injetadas junto com o agente podem interromper tecidos e prejudicar o animal experimental. Portanto, inverta a seringa e gire suavemente o barril, de modo que quaisquer bolhas se movam em direção à ponta e escapem. Se possível, expulse algum agente em excesso para garantir que as bolhas sejam completamente removidas.

Agora que sua seringa está trancada e carregada, você está quase pronto para executar uma injeção!

Antes de começar, é importante equipar-se com os equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas. O manuseio adequado dos animais também é essencial, e varia ligeiramente dependendo do local de injeção utilizado.

Para injeções subcutâneas, que muitas vezes são alvos abaixo da dermis do pescoço do animal, os ratos são contidos por “scruffing”. Primeiro, segure o animal pela cauda e deixe-o segurar a tampa da gaiola. Então, segure firmemente o escroto, levantando uma tenda de pele sobre os ombros do animal.

A agulha deve ser inserida na base da pele da tenda, e o agente dispensou uma pressão firme e consistente ao êmbolo. O líquido injetado será lentamente absorvido na corrente sanguínea.

As injeções intraperitoneais na cavidade corporal são absorvidas a uma taxa semelhante à ingestão. Para acessar o abdômen, vire o animal escroto e coloque a cauda firmemente sob seu mindinho.

Em seguida, divida mentalmente o abdômen do animal em 4 quadrantes e insira a agulha no quadrante inferior esquerdo ou direito. Aplique pressão firme e consistente ao êmbolo para entregar até várias centenas de microliters de agente. Alternativamente, injeções intravenosas permitem uma entrega mais eficiente e sistêmica de agente experimental.

As injeções intravenosas são mais comumente realizadas nas veias traseiras. Primeiro, os ratos são aquecidos sob uma lâmpada de calor por alguns minutos, o que faz com que as veias incham e facilita a inserção da agulha. Para manter o mouse estável durante a injeção, coloque-o em um contidor de plástico, deslizando a cauda através de um orifício especial na parte de trás.

Identificar a nave correta é imprescindível para injeções intravenosas bem sucedidas. Certifique-se de encontrar uma das duas veias caudais em ambos os lados da cauda; não a artéria na parte inferior da cauda.

Segurando o lado bevel da agulha para cima, insira-o na veia. Se a agulha estiver corretamente colocada, a injeção fará com que a veia mude de azul escuro para branco pálido na cor enquanto o agente se move através do vaso.

Após cada injeção, descarte a agulha em um recipiente de afiadas de risco biológico sem recapitular. Nunca reutilize a agulha, pois as pontas podem ficar em frangús e causar ferimentos ao rato.

Agora que você está familiarizado com métodos comuns de injeção, vamos olhar para algumas aplicações práticas de entrega de agentes experimentais.

Em muitos experimentos, os camundongos são infectados com um patógeno específico para estudar a progressão da doença, bem como interações hospedeiro-patógeno. Por exemplo, injeções subcutâneas de bactérias resistentes a antibióticos causam lesões cujo tamanho é uma leitura para a virulência do patógeno. Alternativamente, as injeções no footpad podem ser usadas para imagens vivas do recrutamento de células imunes para o local da infecção.

Modelos de camundongos também são úteis para o estudo da progressão do câncer e terapêutica. Para gerar esses modelos, as injeções podem ser usadas para induzir de forma rápida e eficiente crescimentos malignos em camundongos, tanto através da entrega de compostos cancerígenos quanto da implantação de células cancerosas em tecidos hospedeiros.

No entanto, a injeção nem sempre é necessária para a entrega do agente. A inoculação intranasal, por exemplo, pode ser usada para administrar um agente de interesse dos pulmões para imitar e estudar a progressão da doença respiratória. Outra rota, gavage, permite a administração direta do agente ao estômago para garantir uma dosagem precisa e precisa não alcançável através do tratamento à base de alimentos ou água.

Você acabou de ver a visão geral da JoVE sobre a introdução de agentes experimentais no rato. Neste vídeo, revisamos fatores a serem considerados ao escolher um agente experimental, ferramentas e estratégias para injeções de mouse, e algumas aplicações dessas técnicas críticas. Obrigado por assistir!

Transcript

Many experiments depend upon the administration of agents to mice. Frequently, these agents are introduced to test their effect on a biological process. Agents can also play an important role in preparing animals for experimentation. In this video, we will discuss important considerations for administering experimental agents, tools for agent delivery, some specific routes of administration, and applications of these essential techniques.

So what factors must be considered when planning the administration of an experimental agent?

The first is the appropriate dose. Usually calculated in relation to the animal’s weight, providing the correct dose of an agent is critical.

The route of administration is also important to consider. Properties such as the agent’s palatability, viscosity, the amount to be administered, the target tissue, and the desired rate of dissemination will determine which of the many available administration routes you should choose. In this video we will focus on injection, which is one of the most efficient methods of agent delivery.

Before discussing how to perform an injection, let’s get familiar with the principal tools for the technique.

We’ll begin with the syringe. Liquids are held within the barrel, which is marked to allow accurate volume measurements. The plunger fits within the barrel and is used to drive movement of its contents. Finally, the syringe tip is the site of attachment of the needle hub. At the opposite end of the needle shaft you’ll find a beveled tip. Be careful, it’s very sharp!

Needle hubs are color coded to reflect their size, or “gauge”, with higher gauge numbers indicating smaller needles. Gauges are chosen based on the desired route of delivery: the smaller or more sensitive the area, the smaller the needle required.

After selecting the appropriate needle and syringe for your experiment, draw the agent into the barrel by pulling back on the plunger. Air bubbles injected along with the agent can disrupt tissues and harm the experimental animal. Therefore, invert the syringe and gently flick the barrel, so that any bubbles will move towards the tip and escape. If possible, expel some excess agent to make sure the bubbles are completely removed.

Now that your syringe is locked and loaded, you’re almost ready to perform an injection!

Before you start, it’s important to equip yourself with the appropriate personal protective equipment, including gloves. Proper animal handling is also essential, and varies slightly depending on the injection site used.

For subcutaneous injections, which are often targeted below the dermis of the animal’s neck, mice are restrained by “scruffing.” First, hold the animal by the tail and allow it grip the cage lid. Then, firmly grasp the scruff, raising a tent of skin across the animal’s shoulders.

The needle should be inserted at the base of the tented skin, and the agent dispensed with a firm, consistent pressure to the plunger. The injected liquid will be slowly absorbed into the bloodstream.

Intraperitoneal injections into the body cavity are absorbed at a rate similar to ingestion. To access the abdomen, turn the scruffed animal over, and tuck the tail securely under your pinky.

Then, mentally divide the animal’s abdomen into 4 quadrants and insert the needle into the lower left or right quadrant. Apply firm, consistent pressure to the plunger to deliver up to several hundred microliters of agent. Alternatively, intravenous injections allow a more efficient, systemic delivery of experimental agent.

IV injections are most commonly performed in the tail veins. First, mice are warmed under a heat lamp for a few minutes, which causes the veins to swell and makes needle insertion easier. To keep the mouse steady during the injection, place it into a plastic restrainer, slipping the tail through a special hole in the back.

Identifying the correct vessel is imperative for successful intravenous injections. Be sure to find one of the two caudal veins on either side of the tail; not the artery on the underside of the tail.

Holding the needle bevel side up, insert it into the vein. If the needle is correctly placed, injection will cause the vein to change from dark blue to pale white in color as the agent moves through the vessel.

After each injection, discard the needle into a biohazardous sharps container without recapping. Never reuse the needle, as tips can become blunted and cause injury to the mouse.

Now that you’re familiar with common injection methods, let’s look at some practical applications of experimental agent delivery.

In many experiments, mice are infected with a specific pathogen to study disease progression as well host-pathogen interactions. For example, subcutaneous injections of antibiotic resistant bacteria cause lesions whose size is a readout for the pathogen’s virulence. Alternatively, injections into the footpad can be used for live imaging of immune cell recruitment to the site of infection.

Mouse models are also useful for the study of cancer progression and therapeutics. To generate these models, injections can be used to rapidly and efficiently induce malignant growths in mice, both through the delivery of carcinogenic compounds and the implantation of cancer cells into host tissues.

However, injection is not always required for agent delivery. Intranasal inoculation, for instance, can be used to administer an agent of interest to the lungs to mimic and study respiratory disease progression. Another route, gavage, allows the direct administration of agent to the stomach to ensure a precise and accurate dosing not achievable through food- or water-based treatment.

You’ve just watched JoVE’s overview of introducing experimental agents into the mouse. In this video we reviewed factors to consider when choosing an experimental agent, tools and strategies for mouse injections, and some applications of these critical techniques. Thanks for watching!

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