Implantação de Veia Cava Inferior interposição de enxerto no Rato Modelo

O objetivo geral deste procedimento é investigar os mecanismos celulares e moleculares da formação de neo tecido e desenvolvimento de estenose em enxertos vasculares de engenharia de tecidos. Os primeiros andaimes tubulares biodegradáveis são montados revestindo a malha de feltro não tecido de ácido poliglicólico com uma tampa de épsilon, lactona e copolímero de L lactídeo. Os próximos passos são colher medula óssea e isolar as células mononucleares por centrifugação por gradiente de densidade.

Em seguida, aproximadamente 1 milhão de células são semeadas no andaime e incubadas durante a noite. A etapa final é implantar o andaime semeado como enxerto de interposição de veia cava inferior. Em última análise, os resultados podem mostrar infiltração celular e deposição de matriz extracelular no enxerto vascular de engenharia tecidual por meio de imuno-histoquímica.

As implicações para esta técnica são entender melhor o que causa a formação de estenose e enxertos vasculares de engenharia de tecidos e, em seguida, usar essas informações para projetar um enxerto vascular de engenharia de tecidos melhor. Em nosso estudo clínico, aprendemos que quase um quarto dos pacientes que receberam o tubo de engenharia de tecidos desenvolveu um estreitamento. Nosso objetivo é eliminar esse problema.

Embora este método possa ser aplicado à cardiopatia congênita, ele também pode ser aplicado à cirurgia de revascularização do cólon ou ao condu para a característica altervenosa. Geralmente, os indivíduos novos neste método tiveram dificuldades por causa das técnicas de microcirurgia fina necessárias durante a osmose venosa. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos procurando uma maneira melhor de caracterizar a nova formação de tecido e maneiras de prevenir o desenvolvimento de estenose nos enxertos vasculares de engenharia de tecidos usados em nosso ensaio clínico em humanos.

Primeiro comece a misturar a lactona da tampa epsilon e o copolímero L Lactide. Isso leva de 60 a 90 minutos para se dissolver completamente. Enquanto isso, pegue uma folha de ácido poliglicólico do freezer e corte várias seções de cinco por oito milímetros.

Em seguida, corte o filtro de uma ponta de pipeta de 10 microlitros e insira uma agulha de calibre 19 em sua extremidade distal. Usando uma pinça, enrole um pedaço de ácido poliglicólico ao redor da agulha. Em seguida, usando uma agulha de calibre 18 embotada, empurre cuidadosamente o feltro na extremidade distal da ponta da pipeta ao redor da agulha de calibre 19.

Quando a solução de copolímero estiver pronta, carregue 40 microlitros na parte superior da ponta da pipeta para saturar o ácido poliglicólico sentido com a solução. Empurre as bolhas de ar com um pipetador até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Transfira todos os enxertos preparados para um tubo de 50 mililitros com as pontas das agulhas para baixo e coloque-os a menos 80 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, liofilizar os enxertos sob vácuo por 24 horas. Com a tampa dos tubos aberta no dia seguinte, isole os enxertos das agulhas. Corte ambas as extremidades do enxerto para uma seção limpa de quatro a cinco milímetros.

Em seguida, deslize esses enxertos de volta em torno de suas agulhas para que eles mantenham sua forma. Armazene o enxerto em um dessecador e na noite anterior eles estejam assentados com células. Armazene-os sob luz ultravioleta em um capuz de biossegurança de um camundongo sacrificado.

Colete todos os fêmures e tíbia em um prato com 10 mililitros de RPMI e corte as duas extremidades de cada osso. E em um segundo prato, lave a medula injetando RPMI de uma agulha de calibre 25 em todos os ossos. Use um total de três mililitros de RPM.

Eu coleto toda a medula óssea em RPMI em um único tubo de 15 mililitros e lavo o prato com mais dois mililitros de RPMI para fazer um volume total de cinco mililitros. Conte as células nesta coleção. Em seguida, carregue cinco mililitros de fial em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e encha-o lentamente com cinco mililitros de medula óssea.

Com RPMI, gire o tubo por 30 minutos a 528 G com a interrupção e a 24 graus Celsius. Colete a camada intermediária do tubo que contém as células mononucleares. Dilua esta camada um a um em PBS.

Gire a solução celular e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS. Em seguida, repita o giro. Dilua o pellet celular em cerca de 200 microlitros de RPMI e conte as células duas vezes.

Use o valor médio para concentrá-los em 1 milhão de células por 10 microlitros de RPMI para o enxerto. Use uma fêmea preta de seis a oito semanas C 57 de seis semanas. Pese o camundongo e aplique o cetoprofeno como analgésico pré-anestésico.

Em seguida, anestesia-o com uma injeção no quadrante inferior. Depois de confirmar a anestesia com uma pitada no dedo do pé, corte os pelos abdominais, lubrifique os olhos e posicione o mouse para a cirurgia em uma almofada enrolada com uma toalha forrada de polietileno estéril. Limpe a área cirúrgica com três esfoliações alternadas de betadina e álcool.

Em seguida, coloque o mouse no chão, deixando apenas o abdômen exposto. Comece a cirurgia com uma laparotomia na linha média. Faça uma incisão abaixo do xifóide até a região suprapúbica.

Em seguida, desloque e envolva os intestinos com uma gaze umedecida com solução salina. Em seguida, faça uma dissecção romba do tecido claro da aorta infrarrenal e da veia cva. Clampeie os lados distais e os lados proximais da aorta e veia cva.

Uma vez preso sem rodeios, separe os dois recipientes. Agora prossiga com a implantação. Agora faça o transecto da veia cva e, se necessário, ligue os ramos da aorta abdominal com monofilamento de 10 nós.

Sutura em agulhas cônicas antes do transecto durante todo o implante. Lave frequentemente o enxerto com solução de heparina para evitar trombose. As duas primeiras suturas em ambos os lados do enxerto são as etapas mais importantes de todo o processo.

Quando não são colocados com cuidado, é difícil separar as camadas frontal e traseira do VCI. Se as camadas não forem claramente identificadas, há uma chance maior de suturá-las acidentalmente. Apare o material extra do enxerto e prenda o enxerto com pontos em ambas as extremidades.

Adicione quatro ou cinco pontos usando 10 t. Sutura ao longo da parte frontal do enxerto. Vire-o e faça o mesmo ao longo da parte de trás com a implantação concluída.

Remova a pinça proximal e controle a hemorragia com um agente hemostático absorvível. Quando a hemorragia terminar completamente, remova o grampo distal e repita o controle da hemorragia. Certifique-se de que o sangue esteja fluindo através do enxerto antes de subir o animal.

Usando seis suturas de monofilamento de poliacrilamida preta au. Feche a pele em duas camadas. Agora injete meio mililitro de solução salina por via subcutânea para evitar a desidratação.

Em seguida, transfira o mouse para uma gaiola de recuperação com uma almofada quente Quando ambulatorial, transfira o mouse para sua gaiola doméstica e forneça ibuprofeno por 48 horas. Um SEM do andaime mostra que o diâmetro interno é de cerca de um milímetro e a espessura da parede é de cerca de 0,17 milímetros. A porosidade do andaime foi de 78,5% com um tamanho médio de poro de 45 mícrons.

Logo após o implante, o enxerto vascular de engenharia de tecido foi visto ao microscópio. Duas semanas depois, foi visto novamente. Ainda mantém sua forma.

É claro que o enxerto estava se degradando e gradualmente substituído por novo tecido. Durante as duas semanas, a semeadura celular de fato melhorou a perviedade do enxerto em 25% o enxerto foi removido para análise histológica. A coloração H e D revelou tecido neo em todo o andaime, uma coloração com corações e masson.

O trirreme mostrou elastina nas camadas íntimas e mostrou colágeno nas camadas mediais. A coloração com CD 31 revelou um revestimento de células endoteliais na camada inal. A coloração Alpha SMA mostrou que o enxerto também era preenchido com músculo liso confluente.

Até mesmo a infiltração de macrófagos foi evidente, como visto pela coloração F quatro 80. Na conclusão deste vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como fabricar um enxerto vascular de engenharia de tecido em pequena escala, incluindo os métodos para fabricar um andaime biodegradável em pequena escala métodos para isolar células mononucleares derivadas da medula óssea e semeá-las no andaime. E, finalmente, devemos demonstrar a você os métodos para usar técnicas microcirúrgicas para implantar o enxerto vascular de engenharia de tecido no modelo de espelhamento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 45 minutos. Outros métodos, como o implante de enxerto de interpretação aórtica, podem ser realizados posteriormente para investigar o desenvolvimento de enxertos vasculares de engenharia de tecidos para cirurgia de revascularização do miocárdio. Embora seja importante tentar este procedimento para lembrar de manter a área cirúrgica hidratada e lavar o enxerto com frequência para evitar trombose aguda, essas técnicas abriram caminho para os pesquisadores no campo da engenharia de tecidos explorarem a formação de tecido ungueal e a prevenção de estenose em enxerto vascular de engenharia de tecidos.