Name: Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a analisar dinâmicas transcricionais no núcleo accumbens de camundongos após exposição à cocaína. Este protocolo utiliza qPCR para perfilar genes induzidos por estímulos comportamentais em neurociência.

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Este trabalho foi financiado pela Bolsa da Fundação de Ciência de Israel (ISF # 393/12), Bolsa de Excelência dos Centros de Pesquisa de Israel (I-CORE 1796/12), Bolsa da Fundação Alemão-Israel (GIF # 2299-2291.1/2011) e Bolsa de Integração de Carreira Marie Curie (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). As etapas iniciais do projeto foram financiadas por uma bolsa de pós-doutorado da AXA para AC. Reconhecemos os generosos fundos iniciais fornecidos pelo Centro de Ciências do Cérebro Edmond e Lily Safra.
A leitura crítica dos membros do laboratório Citri é muito apreciada.

NOTA: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade Hebraica de Jerusalém. 1 Preparação da solução de ACSF <ol><li> Preparar solução ACSF como descrito na Tabela 1. Adicione 1 L de ddH2O (&gt; 18 mohms pureza), para trazer a osmolaridade ~ 300 mOsm / L, com adição apropriada de água ou de NaCl. </li></ol> 2. Equipamentos e sala preparada O equipamento para o monitoramento do comportamento locomotor induzido pela cocaína é composto por câmaras de comportamento (50 x 45 cm) com fio com uma fonte de luz interior, ventilador e uma câmera (ou sensores de infravermelho), e está equipado com uma caixa de perspex interior (30 x 30 cm) em que os ratos estão autorizados a circular livremente enquanto sua locomoção é monitorada. O teste comportamental deve ser realizado entre 1 hora após as luzes acesas para 1 hora antes de as luzes apagadas, em um ciclo claro / escuro regular. Os animais devem ser treinados de forma consistente, ao mesmo tempo cada dia. <ol><li&gt; Conectar câmera ou sistema de infravermelho para um sistema adequado para monitorar e gravar o comportamento locomotor de ratos. </li><li> Limpar as câmaras depois de cada ensaio com desinfectante fornecida pela instalação de rato e / ou remoção de odores de reagentes, a fim de evitar a polarização de sinalização olfactivo e para assegurar a desinfecção adequada. </li></ol> IMPORTANTE: Ao manusear os ratos ficar quieto, calmo e cuidadoso. Preparação 3 Animais <ol><li> Casa 5 C57BL6 camundongos machos (6-12 semanas de idade; ~ 25-35 g de peso) por gaiola, em uma sala com um ciclo claro / escuro de 12 horas e livre acesso a alimentos e água, de acordo com as normas e requisitos de Experimentação Animal Cuidados orientação e protocolos Comitê. Antes de iniciar o experimento, os ratos pesar e registrar os dados. A cocaína é administrada mais tarde de acordo com o peso dos ratos. </li><li> Transferir todas as gaiolas contendo ratos na sala comportamental 30 min antes de começar o primeiro julgamento. </li><li> Habituar todo ocamundongos utilizados no experimento de manipulação do experimentador, injeções e acompanhamento na configuração do comportamento. Isto é conseguido através de injecções intraperitoneais 3 consecutivas diárias de 250 ul de solução salina, como descrito abaixo. </li><li> Administrar uma injeção intraperitoneal de 250 mL de solução salina. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 min. Repita esta ação durante 3 dias consecutivos, na mesma hora todos os dias. </li><li> No quarto dia, dividem os ratos em dois grupos. Prepara-se uma solução estoque de cocaína a 2 mg / ml em solução salina. Administrar uma única injecção de uma solução de cocaína (finais de 20 mg / kg) para o grupo experimental de acordo com o peso do rato (por exemplo, para um rato de 25 g - injectar 250 ul, ao passo que um rato de 30 g irá receber 300 ul). Administrar solução salina ao grupo de controlo. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse por 20 minutos em uma câmara de comportamento para o monitoramento da atividade locomotora (Latossoloaliado, os primeiros 15 min são monitorados). </li><li> Após a injecção de cocaína, sacrificar os ratinhos em diferentes pontos de tempo (0, 1, 2, 4, 8 e 24 h após a injecção). Importante, certifique-se que os ratos de referência (0 ponto de tempo) não receberá qualquer injecção neste dia. Devido à sua importância, é imperativo incluir repetições do grupo de referência. </li></ol> 4. Dissecção de núcleo accumbens <ol><li> Anestesiar os ratos com isoflurano, no momento apropriado após a injecção de cocaína / soro fisiológico. O isoflurano deve ser ventilado directamente para fora da sala. Portanto, o procedimento deve ser realizada numa hote química. </li><li> Monitorização da profundidade da anestesia, testando o reflexo do pé traseiro. Aperte a pata para provocar uma resposta de retirada pelo animal. Um animal que mostra um reflexo não está em um nível cirúrgico de anestesia e não em um estado de eutanásia. </li><li> A extracção do cérebro: <ol><li> Eutanásia o mouse por decapitação. </li> &lt;li&gt; Retirar a pele acima do centro do crânio e cortar o crânio com uma tesoura afiada. </li><li> Inserir as tesouras no ponto onde a medula espinal entra no cérebro (forame) e fazer dois cortes laterais. </li><li> A partir do mesmo ponto, fazer um corte sagital longa ao longo da sutura sagital. Ao chegar ao bulbo olfatório, clipe para a esquerda e para a direita. </li><li> Com uma pinça, retire o crânio com cuidado, segurando cada metade do crânio firmemente e puxando para o lado, tomando cuidado para não pressionar sobre ou danificar o cérebro. </li><li> Remover o cérebro enquanto cortando os nervos cranianos, utilizando uma colher de micro invertida espátula. </li></ol></li><li> Inserir o cérebro em solução ACSF gelado durante 1-2 min para refrigerar e endurecer. </li><li> Retirar do cérebro ACSF, pavio excesso de fluido com uma toalha de papel, criar um corte coronal entre o cerebelo e o resto do cérebro e cola no cérebro, com a porção rostral voltado para cima, sobre o palco vibratome. </li><li> Cortar o NAc: <ol&gt; <li> Manter soluções aCSF a temperaturas geladas na câmara de corte do vibratome. Seção em 200 mM até o núcleo accumbens (NAC) é claramente identificado de acordo com o Paxinos e Franklin Rato Atlas Cerebral (aproximadamente 1,8 mm anterior ao bregma; prestar atenção à forma do corpo caloso, a localização ea forma da comissura anterior e os ventrículos, bem como a morfologia global da secção de cérebro). Neste ponto, criar duas secções de 400 um, a partir da qual o NAc serão dissecados. </li><li> De acordo com um estereoscópio, use uma lâmina fina para dissecar a área de NAc fora das fatias. A definição da CNS é de acordo com o atlas do cérebro do rato Paxinos e Franklin, e pode convenientemente ser dissecado em seções apropriadas por quatro passes rápidos da lâmina sobre o tecido. (Figura 2). </li><li> Coloque seções Nac imediatamente em 900 mL de Trizol reagente de lise em um tubo de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até RNA extração. </li></ol></li></ol> Transcrição 5 Extração de RNA e cDNA Reversa <ol><li> Descongelar os tubos contendo o núcleo accumbens secções em reagente Trizol lise à temperatura ambiente e homogeneizar o lisado com uma seringa de 1 ml ligada a 25 G até a agulha o tecido é completamente homogeneizada (pelo menos 15-20 vezes). As primeiras voltas são difíceis, e requerem que empurra o tecido contra a parede do tubo, de modo a dividi-la em pedaços pequenos que podem entrar na ponta da agulha. </li><li> Para assegurar a homogeneização, pipetar o lisado para uma mini-coluna de spin QIAshredder e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. </li><li> Pipete o lisado para um novo tubo de microcentrifugação e extrair o ARN de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar o ARN a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Medir a concentração de RNA, analisar a integridade e qualidade usando uma Bioanalyzer ou equipamento equivalente. Use 100-500 ng RNA para cada rodada de preparação cDNA com rAndom primers hexaméricos. </li></ol> 6. Primer Projeto e Testes Primer <ol><li> Escolhendo bons primers: Para um par de primers ideal para qPCR de transcritos de mRNA, siga estes requisitos (Figura 3): <ol><li> Primers projeto já não contendo de 17-28 bases. Evite repetições de nucleotídeos como eles promovem errï¿½ea. </li><li> Iniciadores de design com temperatura de fusão (Tm) entre 56-68 ° C (60-64 ° C de forma óptima). A T m de dentro do par de primers devem estar dentro de 1 ° C, de um ao outro. </li><li> Esteja ciente de que o tamanho do produto deve ser idealmente entre 80 e 150bp. </li><li> Certifique-se de que pelo menos um dos iniciadores inclui uma junção exão-exão, ou o fragmento amplificado contém um grande intrão (intrão-spanning), para evitar a amplificação de contaminantes de ADN genómico. </li><li> Use um software confiável com base em Primer3 (para exemplos, ver Tabela 2), a fim de melhorar o projeto de primer. </li></ol></li><li> Testando o prIMers: A fim de assegurar a especificidade e eficácia dos iniciadores, uma reacção de qPCR de controlo devem ser executadas: <ol><li> Use uma amostra positiva (contendo ADNc molde para todos os pares de iniciadores relevantes) e titula-se o ADNc (por exemplo, oito diluições de três vezes a partir de uma concentração inicial de ~ 10 ng), em reacções paralelas em duplicado. Incluir um controlo sem molde, o qual controla a contaminação dentro das soluções utilizadas para a reacção. </li><li> Calcular a eficiência do iniciador por meio da fórmula: (10 (- 1 / declive) -1) x 100, de tal forma que a curva da inclinação óptima é - 3,333 (isto é, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4). </li><li> Determinar a especificidade da amplificação. Amplificação específica é demonstrada por um único pico proeminente comum para todas as curvas de fusão dos produtos de amplificação, enquanto que fora da amplificação alvo, apresentado como um desvio óbvio from o único grande pico. </li></ol></li></ol> 7 Análise qPCR <ol><li> Pré-amplificação: <ol><li> Análise abrangente qPCR baseia-se na consulta paralelo de limitar as quantidades de ARN com um grande número de pares de iniciadores. Portanto, um passo de pré-amplificação é essencial. Neste passo, o ADNc é submetido a 14-18 ciclos de pré-amplificação com uma mistura de todos os iniciadores que irão ser utilizados para a consulta da amostra no futuro (até 800 pares de iniciadores). </li><li> Diluir todos os primers em TE (baixo EDTA) a 50 mm para Alvo amplificação específica (STA). </li><li> Piscina juntos alíquotas de 1 ul de tudo do iniciador 50 uM define a ser incluído na reacção STA, até 800 ensaios. </li><li> Preparar uma pré-mistura e as amostras para STA, tal como descrito na Tabela 3. Permitir erro através da preparação de mistura de 110% do número de amostras a serem amplificadas. </li><li> Aliquota de 3,75 mL de STA de pré-mistura para cada amostra. Adicionar 1,25 mLde cDNA para cada. </li><li> Vortex para misturar as reações e centrifugar por 10 seg. </li><li> Coloque as reacções STA em um termociclador e ciclo como indicado na tabela 4. </li></ol></li><li> Exonuclease I (ExoI) tratamento: <ol><li> Dilui-se a Exo I, como indicado na Tabela 5. </li><li> Adicionar 2 mL de ExoI diluído (4 U / mL) para cada reação STA 5 jul, vortex, girar para baixo (&gt; 6.000 xg) e coloque em um termociclador a 37 ° C durante 30 minutos e depois a 80 ° C durante 15 min. </li><li> Dilui-se os produtos finais a uma concentração apropriada para o ensaio. Use TE Buffer (adicionar 43 mL de tampão TE para a amostra TSA 7 mL). </li><li> Guarde os produtos STA diluído a -20 ° C ou o uso imediatamente. </li></ol></li><li> Primer e configuração de exemplo para qPCR: <ol><li> Preparar as amostras como se mostra na Tabela 6. Preparar a mistura de acordo com o chip escolhida para a experiência, e adicionar as amostras conforme apropriado. </li><li> Agilitar as soluções de amostra da mistura por um período mínimo de 20 segundos, e centrifugar (&gt; 6000 xg) durante pelo menos 30 seg. Reacções preparadas podem ser armazenadas durante períodos de tempo curtos, a 4 ° C até que o chip é pronto para carga. </li><li> Preparar os ensaios tal como descrito na Tabela 7. </li><li> Agitar a mistura de ensaio durante um mínimo de 20 seg e centrifuga-se (&gt; 6000 xg) durante pelo menos 30 segundos para girar para baixo de todos os componentes. IMPORTANTE: Vortex bem e centrifugar todas as soluções de amostra e ensaio antes da pipetagem para as entradas de chips. Não fazer isso pode resultar em uma diminuição da qualidade dos dados. NOTA: A concentração final de cada iniciador é de 5 uM na entrada e 500 nM no final da reacção. </li></ol></li><li> Priming e carregando a matriz dinâmica IFC (circuito de fluídica integrado) de chips. O chip IFC tem entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas (acumuladores) para a linha de controlo de fluido (óleo mineral) utilizados para pressurizar as câmaras de microfluidos (Figure 4A). <ol><li> Injectar fluido da linha de controlo em cada um acumulador no chip. </li><li> Remover e descartar o filme protector azul a partir do fundo do chip. </li><li> Coloque o chip no controlador IFC apropriado (controlador MX para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o controlador HX IFC para a 96,96 dinâmico matriz IFC), em seguida, executar o script Prime (113x) para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o Prime (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para ferrar o chip. </li><li> Quando o script for concluído, retire o chip ferrado do controlador IFC. </li><li> Pipeta de 5 mL de cada mistura de ensaio e 5 mL de cada amostra em Mix suas entradas. </li><li> Retorne o chip para o controlador IFC. </li><li> Usando o software controlador IFC, execute o Mix (113x) roteiro de Carga para o 48.48 dinâmico matriz IFC) ou Carregar Mix (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para carregar as amostras e ensaios para o chip. Quando o script de carga Mix terminar, retire a cargachips ed do controlador IFC. </li><li> Coloque o chip no termociclador, crie um novo prazo chip (de acordo com as instruções do fabricante), incluindo a análise de curva de fusão. Usando o software termociclador, assegurar que as câmaras de reação são reconhecidas corretamente, e permitir que a reação de correr para a conclusão. </li></ol></li></ol> Análise de Dados 8. <ol><li> A garantia da qualidade: A fim de garantir a qualidade dos dados, verificar a qualidade dos iniciadores de endereçamento curvas de diluição (como descrito acima). Monitorar a especificidade da amplificação exibindo as curvas de fusão de fragmentos amplificados, os picos de forma otimizada, que deve ser bem alinhada 29. </li><li> Visualização: Para visualização de grandes quantidades de dados obtidos pelo alto rendimento qPCR, utilize o software gerado heatmaps, em que a expressão é de intensidade de cor correspondente. Além disso, apresentar a dinâmica de transcrição de genes individuais como gráficos de dispersão alinhados. </li><li> Publicação: Em publicaçãoos resultados de expressão gênica, é aconselhável seguir as orientações MIQE para publicação de experimentos quantitativos PCR em Tempo Real, detalhando as informações mínimas que devem ser comunicadas para um experimento de qPCR para garantir a sua exactidão, a interpretação correta, e reprodutibilidade. </li></ol>

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<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Caracterização de sucesso da expressão gênica do tecido cerebral após paradigmas comportamentais depende de: 1) manejo cuidadoso de ratos durante o paradigma comportamental; 2) dissecção rápida e precisa do tecido de interesse; 3) medidas RNA segura de garantir a integridade do RNA; e 4) O planejamento cuidadoso de primers e delineamento experimental, bem como precisão e atenção aos detalhes na preparação para a análise de qPCR. O objectivo do processo descrito é a caracterização da dinâmica...

Organização dinâmica do cérebro permite flexibilidade cognitiva e comportamental. Experiências são codificadas através de modificações da estrutura e força das conexões entre os neurônios no cérebro 3. Este &quot;dependente da experiência plasticidade&quot; é o resultado da indução de padrões específicos da expressão do gene que fornece as proteínas necessárias para a modificação da estrutura e força 4 sináptica. A identificação de redes de regulação gênicas mediar a formação de memórias de longo prazo é um princípio central da neurociência molecular, com a expectativa de que a identificação dos elementos dominantes de programas de transcrição irá fornecer uma visão sobre os princípios fundamentais que regulam a formação da memória, bem como metas para tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Programas de transcrição desdobrar-se em ondas temporalmente definidos, cada um dos quais codificam genes de caráter diferente, que são importantes para destágios iferentes na implementação dos resultados do evento de sinalização 1,2. Por isso, é importante abordar a dinâmica de transcrição em um prazo temporal, detalhado, de modo a identificar o conjunto completo de genes induzidos, e obter insights sobre sua função potencial de acordo com a dinâmica de sua indução. A dependência de drogas é uma forma robusta de dependentes de experiência plasticidade causada pelos efeitos duradouros das drogas de abuso em circuitos neurais no cérebro 5,6. Inicial, a exposição aguda a drogas pode levar ao desenvolvimento de dependência e da transição para a utilização crónica. A informação contextual é um elemento crucial para o desenvolvimento de dependência. Pistas ambientais associadas à droga são atribuídas importância significativa nas mentes dos usuários de drogas. A informação contextual lembrando um usuário de drogas de experiência de drogas no passado pode induzir a recaída ânsia de drogas, mesmo após longos períodos de abstinência de exposição ao fármaco 7,8.Daí o grande desafio clínico em vício - a propensão dos adictos recaírem mesmo muito tempo depois de os sintomas de abstinência têm abrandado 9. Sensibilização comportamental à cocaína é um modelo simples de cocaína experiência útil no estudo dos mecanismos da dependência de drogas. Neste modelo amplamente estudado para a sensibilização de longa duração induzida pela exposição crônica às drogas de abuso, roedores estão habituados a primeira injeção de solução salina (intraperitoneal, IP) em um ambiente de romance (uma câmara de campo aberto, no qual sua atividade locomotora é monitorado) ; em seguida, eles recebem injecções diárias de cocaína nas câmaras de campo abertas, enquanto a sua actividade é monitorizada 10 (Figura 1). Este paradigma comportamental resulta tipicamente numa sensibilização robusta de comportamento locomotor (8-12 vezes superior actividade de linha de base) 11, que é mantida durante um período de vários meses após a cessação das injecções de cocaína, demonstrando a formação de um taradotraço de memória ASIVE de experiência com drogas. O circuito neural de recompensa, naturalmente envolvido em reforçar comportamentos essenciais para o sucesso de uma espécie (por exemplo, alimentação, sexo), é explorada por drogas de abuso para reforçar comportamentos associados ao fármaco 12,13. Os mecanismos moleculares e celulares, através da qual a experiência de drogas de abuso é aumentada parecem ser semelhantes aos mecanismos subjacentes à formação da memória declarativa ou semânticas em outras estruturas cerebrais 14. Portanto, a robustez do modelo sensibilização comportamental faz com que seja um sistema modelo atraente para estudar mecanismos de dependentes de experiência plasticidade. O núcleo accumbens (NAC) é um integrador central do circuito de recompensa do cérebro, e tem sido extensivamente associados com o desenvolvimento da dependência de 5,6. A formação de vício depende da transcrição de novas proteínas no núcleo accumbens, e robusto emprodução de programas de transcrição bem estruturados é observado no NAc seguinte experiência cocaína 15-19. A resposta transcricional aguda a exposição à cocaína é susceptível de funcionar em vários níveis, a fim de adaptar-se ao forte estímulo de indução e para direcionar a produção de novas proteínas que são responsáveis ​​pelas mudanças estruturais e eletrofisiológicas induzidas pela exposição à droga 6,19-22. A fim de promover o estudo dos mecanismos moleculares dos dependentes de experiência plasticidade no cérebro, um protocolo descrito para a análise global da dinâmica de transcrição em amostras de tecido cerebral após a manipulação comportamental. O protocolo é ilustrada no contexto da experiência comportamental estudada no laboratório Citri - sensibilização comportamental à cocaína, utilizando matrizes dinâmicas de microfluidos para a análise da transcrição. O protocolo descrito, obviamente, não se limita ao estudo tele nucleus accumbens no contexto da sensibilização comportamental, mas poderia ser aplicado a um grande número de paradigmas comportamentais e regiões do cérebro. Na verdade, este protocolo pode ser aplicado aos tecidos do corpo fora do cérebro, e uma variedade de experiências ou manipulações do organismo estudado. O protocolo é dividido em quatro etapas. No primeiro passo, o animal é submetido ao paradigma comportamental; No segundo passo, o tecido é microdissecados; na terceira etapa - mRNA é purificado, reversamente transcrito e sondadas, e na etapa final, os dados são analisados. No contexto do estudo da dinâmica de transcrição, o tempo preciso e definição da experiência são provavelmente os parâmetros experimentais mais importantes para o controle. Por esse motivo, o nosso modelo de comportamento de escolha é a de sensibilização comportamental à cocaína, um sistema que permite elevado nível de controlo sobre os parâmetros do experimentador da experience. Paradigmas comportamentais adicionais que permitem o sincronismo preciso e abordam diferentes modelos de dependentes de experiência plasticidade ou a formação da memória estão disponíveis. Estes modelos incluem o medo condicionado 23, enriquecimento ambiental aguda 24,25, romance objeto de exploração 26 e experiência visual após criação escuro 27. Ainda assim, a sensibilização comportamental à cocaína é uma manipulação comportamental consistentemente robusta, criando um traço de memória altamente penetrante, que dura meses seguintes experiência cocaína 28. O cérebro é seccionado, seguido por microdissecção manual dos nucleus accumbens. Tem sido a nossa experiência que microdissecção Manual de fatias de cérebro rapidamente preparados proporciona o método mais fiável e rápido de extracção do tecido relevante para o paradigma comportamental, e com a experiência, as fronteiras do tecido tornam-se evidentes e facilmente reconhecidas. Alternativamente, fatias finas poderiam ser prepared, seguido por captura a laser microdissecção. Embora este método permite a delineação muito da região de interesse definidas, isto é lento (correndo assim o risco de perda de ARNm lábil), fastidioso e requer equipamento dispendioso dedicado (um microscópio equipado com uma instalação de captura por laser). O protocolo aqui definido também pode ser adaptado para análises de transcrição de uma única célula, por aspiração do citoplasma das células identificadas visualmente, utilizando pipetas de remendo 29. É importante notar que o protocolo descrito fornece uma média populacional, ao mesmo tempo que é altamente provável que, na maioria dos casos, apenas uma sub-população de células dentro do tecido são, na verdade, envolvido na resposta à experiência. É de interesse para o perfil de transcrição de forma seletiva a partir de dentro de populações de células específicas em resposta à experiência, mas a discussão dessas abordagens está além do escopo atual. Para a purificação de ARNm, transcrição reversa e de qPCR de consulta, o tecidoé interrompido por passagem através de agulhas finas, seguido pela utilização de kits comerciais (para mais informações, consulte a Tabela 8). A escolha é informado pela experiência com essas metodologias que garantam a extração segura de RNA de alta qualidade e resultados robustos de aplicações a jusante. Enquanto o protocolo é descrito por de alto rendimento qPCR utilizando matrizes dinâmicas, as amostras podem ser sondado para a expressão de genes usando ponto final PCR, de baixo rendimento qPCR, microarrays de expressão gênica ou seqüenciamento de profundidade. A preferência por qPCR de alto rendimento, utilizando matrizes dinâmicas é devido ao facto de ARNm obtido a partir de núcleos cerebrais seguinte paradigmas comportamentais é frequentemente de quantidades limitantes. Matrizes dinâmicas fornecer uma plataforma que permite a análise global eficiente dos transcritos de um grande número de amostras em paralelo numa única experiência. Após a aquisição inicial do sistema de microfluidos (vulgarmente uma pu institucionalrchase), as experiências são relativamente baratos para ser executado. Na sequência desta análise, mais consultas das amostras pode ser realizada utilizando as plataformas mais caras para procurar novas transcrições (por microarrays ou RNAseq) com as matrizes dinâmicas proporcionando uma referência abrangente para a garantia da qualidade. Finalmente, para a análise de dados, são utilizados métodos convencionais. Ponteiros específicos a respeito de questões que possam surgir serão discutidos no texto do protocolo. Este protocolo é mais apropriado para os investigadores interessados ​​em uma investigação completa do seu sistema de interesse, estudando várias condições e repetições. O protocolo também é mais adequado para os investigadores que já afinados (através de microarray ou RNAseq experimentos) em um subconjunto de 50-500 genes de interesse, que eles estão interessados ​​em consultar repetidamente.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP 100%</td> <td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Câmara</td><td>de Comportamento 1355656</td><td></td>Invitrogen</tr><tr><td>(MDF; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td>Caixa interna de perspex <td>auto-montada</td></tr><tr><td>(30 x 30 cm)</td><td></td><td></td><td>Câmera e gravador de vídeo auto-montados</td></tr><tr><td></td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>software gravador de mídia</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de íris</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td>O Agilent 2100 Bioanalisador</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de microcolher invertida</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Chip de matriz dinâmica para expressão gênica 96.96</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

análise abrangente de transcrição dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência behavioral

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

A codificação de experiências no cérebro e na consolidação de memórias de longo prazo dependerá de transcrição do gene. Identificar a função de genes específicos em experiência de codificação é um dos principais objetivos da neurociência molecular. Além disso, a associação funcional de genes definidos com comportamentos específicos tem implicações para a compreensão da base de transtornos neuropsiquiátricos. A indução da transcrição de programas robustos foi observado no cérebro de ratinhos após várias manipulações comportamentais. Enquanto alguns elementos genéticos são utilizados recorrentemente seguinte diferentes manipulações comportamentais e em diferentes núcleos do cérebro, os programas de transcrição são em geral única para os estímulos indutores e a estrutura na qual eles são estudados 1,2. Nesta publicação, um protocolo é descrito para perfilamento transcricional robusta e abrangente de núcleos cerebrais de ratos em resposta à manipulação comportamental. Aprotocolo é demonstrado no contexto da análise da dinâmica de expressão de genes no núcleo accumbens seguinte experiência aguda cocaína. Subseqüente a um definido na experiência vivo, o tecido neural alvo é dissecado; seguido por purificação de RNA, a transcrição reversa e a utilização de matrizes de microfluidos para a análise detalhada de qPCR de múltiplos genes alvo. Este protocolo é voltada para análise abrangente (dirigindo-50-500 genes) de limitar a quantidade de matéria-prima, tais como amostras de cérebros pequenos, ou mesmo uma única célula. O protocolo é o mais vantajoso para a análise de amostras múltiplas em paralelo (por exemplo, células isoladas, análise dinâmica seguinte farmacêutica, viral ou perturbações comportamentais). No entanto, o protocolo também pode servir para a caracterização e garantia de qualidade das amostras antes de estudos todo o genoma por microarrays ou RNAseq, bem como a validação dos dados obtidos a partir de estudos de todo o genoma.

A qualidade dos resultados obtidos através da aplicação deste protocolo crucialmente depende de um número de parâmetros. Planeamento experimental adequada irá resultar na perturbação mínima aos ratinhos experimentais, de modo a que a experiência testado (neste exemplo, que a exposição a cocaína) será a experiência mais dominante na sua história recente, e, portanto, irá resultar num forte e específico da transcrição programa. Figura 1 descreve o plano experimental para a sensibilização comportamental à ...

Este manuscrito descreve um protocolo que aplica perfis abrangentes para análise de programas transcricionais induzidos em núcleos cerebrais específicos de roedores seguindo paradigmas comportamentais. Aqui, essa abordagem é ilustrada no contexto do perfil de genes induzidos no núcleo accumbens (NAc) de camundongos após exposição aguda à cocaína, utilizando matrizes de qPCR microfluídicas.

Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a dinâmica transcricional e os núcleos cerebrais definidos em camundongos após uma experiência comportamental. Isso é alcançado primeiramente pela habituação dos animais e pelo registro de sua atividade locomotora após injeção de soro fisiológico. Uma vez habituados, a atividade locomotora é registrada após uma dose única de cocaína, amostras do núcleo accumbens são então coletadas e utilizadas para isolamento de RNA e preparação de cDNA.A seguir, é realizada uma análise de QPCR para estudar a expressão gênica induzida pelo comportamento. Em última instância, obtêm-se resultados que mostram a dinâmica transcricional após a experiência com cocaína. O protocolo será demonstrado pelo Dr. Hatu, gerente do laboratório, Dum Muer, um estudante de pós-graduação do laboratório, e Duran, um estudante de graduação do laboratório. Durante três dias consecutivos, cada camundongo é habituado aos procedimentos de manipulação e injeção, organizando-se os camundongos em gaiolas antes de iniciar o experimento, de modo que os camundongos não sejam transferidos entre gaiolas no futuro e nunca fiquem em isolamento por um período prolongado de tempo.Trinta minutos antes do início do teste, todas as gaiolas de teste devem ser transferidas para a sala de comportamento para permitir que os animais se aclimatizem ao ambiente. Administre uma injeção intraperitoneal de 250 microlitros de solução salina; imediatamente após a injeção, coloque o camundongo em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 minutos. O camundongo pode ser colocado na câmara de comportamento por 20 minutos.Uma atividade monitorada do segundo ao 17º minuto. Repita esses passos no mesmo horário do dia durante os dois dias seguintes. No quarto dia, administre uma única injeção de cocaína ou soro fisiológico, conforme o grupo, e coloque imediatamente o camundongo na câmara para monitorar a atividade motora local por 20 minutos em pontos temporais selecionados após a exposição à cocaína, extraia o cérebro e coloque-o em solução de LCR gelada por um a dois minutos para resfriar e endurecer.Após remover o cerebelo e absorver o excesso de fluido, cole o cérebro na plataforma de um vibrosserrote com a parte rostral voltada para cima. Encha a câmara com A CSF gelada e corte secções de 200 mícrons até que o núcleo accumbens seja claramente identificado. Observe atentamente a forma do corpo caloso, a localização e a forma da comissura anterior e dos ventrículos durante o corte.Uma vez identificada a região correta, corte duas seções de 400 mícrons das quais o núcleo accumbens será dissecado sob um estereomicroscópio. Use uma lâmina fina para dissecar o núcleo accumbens longe das seções. Quatro passagens rápidas da lâmina na área correta devem isolar imediatamente o tecido apropriado.Coloque o tecido isolado em 900 microlitros de reagente de lise e armazene a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA; para iniciar, descongele os tubos a 37 graus Celsius e homogeneíze. Usando uma agulha de 25 mm, as primeiras passagens podem ser difíceis e exigir empurrar o tecido contra a parede do tubo para homogeneizá-lo em pequenos fragmentos. Para garantir uma homogeneização adequada, pipete o lisado para uma coluna de centrifugação mini trituradora kaya e centrifugue.Pipete o lisado para um novo tubo de microcentrífuga e extraia o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação do RNA, realiza-se a transcrição reversa para cDNA, bem como a pré-amplificação específica do alvo das amostras com primers direcionados ao grupo de genes escolhido para análise. Esses procedimentos são descritos na versão textual do protocolo.Chips microfluídicos comerciais para análise abrangente de QPCR estão disponíveis no formato 48 por 48, permitindo a análise de 48 amostras com 48 conjuntos de sondas, ou em um formato 96 por 96, no qual 96 amostras são analisadas com 96 sondas. Na maioria dos casos, a escolha do chip depende principalmente do número de amostras analisadas.Primeiro, prepare a mistura da amostra de acordo com o chip escolhido para o experimento. Tenha cuidado ao pipetar o reagente de carga da amostra com corante de ligação 20 XDNA. Agite as soluções da mistura da amostra por um mínimo de 20 segundos e centrifugue por pelo menos 30 segundos.As reações preparadas podem ser armazenadas por curtos períodos a quatro graus Celsius até que o chip esteja pronto para carregamento. Em seguida, prepare a mistura do ensaio, agite completamente a mistura de amostras e centrifugue para sedimentar todos os componentes. Conforme mostrado anteriormente, o chip IFC de matriz dinâmica possui entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas para fluido da linha de controle utilizado para pressurizar as câmaras microfluídicas.Primeiro, injete o fluido da linha de controle em cada acumulador do chip. Em seguida, prepare o chip colocando-o no controlador IFC e executando o script apropriado. Quando o script for concluído, remova o chip preparado do controlador IFC e pipete cinco microlitros de cada ensaio.Misture sobre o chip. Adicione cinco microlitros de cada mistura de amostra nas suas entradas e recoloque o chip no controlador IFC utilizando o software do controlador IFC. Execute o script para carregar as amostras e ensaios no chip.Quando o script de carregamento da mistura terminar, remova o chip carregado do controlador IFC. Em seguida, coloque o chip no ciclador térmico e crie uma nova execução do chip que inclua uma análise de curva de dissociação. Utilizando o software do ciclador térmico, certifique-se de que as câmaras de reação sejam reconhecidas corretamente e permita que a reação prossiga até a conclusão.Um aumento na atividade locomotora foi evidente após uma única injeção aguda de cocaína. Nesta seção coronal, linhas brancas grossas marcaram a localização dos cortes feitos para definir os limites do núcleo accumbens. Durante a dissecção, as curvas de amplificação de iniciadores direcionados contra CFOs e fosf B demonstram que os pares de iniciadores amplificam seu transcrito alvo com eficiência aproximada de 100%.Em cada ciclo, os resultados mostram que a cocaína induziu expressão máxima de CFOs e de fosfo B no núcleo accumbens uma e duas horas após a exposição. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de nova geração, podem ser realizados para identificar novos transcritos não caracterizados.

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Research

JoVE Journal

Behavior

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