Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a dinâmica transcricional e os núcleos cerebrais definidos em camundongos após uma experiência comportamental. Isso é alcançado primeiramente pela habituação dos animais e pelo registro de sua atividade locomotora após injeção de soro fisiológico. Uma vez habituados, a atividade locomotora é registrada após uma dose única de cocaína, amostras do núcleo accumbens são então coletadas e utilizadas para isolamento de RNA e preparação de cDNA.

A seguir, é realizada uma análise de QPCR para estudar a expressão gênica induzida pelo comportamento. Em última instância, obtêm-se resultados que mostram a dinâmica transcricional após a experiência com cocaína. O protocolo será demonstrado pelo Dr. Hatu, gerente do laboratório, Dum Muer, um estudante de pós-graduação do laboratório, e Duran, um estudante de graduação do laboratório. Durante três dias consecutivos, cada camundongo é habituado aos procedimentos de manipulação e injeção, organizando-se os camundongos em gaiolas antes de iniciar o experimento, de modo que os camundongos não sejam transferidos entre gaiolas no futuro e nunca fiquem em isolamento por um período prolongado de tempo.

Trinta minutos antes do início do teste, todas as gaiolas de teste devem ser transferidas para a sala de comportamento para permitir que os animais se aclimatizem ao ambiente. Administre uma injeção intraperitoneal de 250 microlitros de solução salina; imediatamente após a injeção, coloque o camundongo em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 minutos. O camundongo pode ser colocado na câmara de comportamento por 20 minutos.

Uma atividade monitorada do segundo ao 17º minuto. Repita esses passos no mesmo horário do dia durante os dois dias seguintes. No quarto dia, administre uma única injeção de cocaína ou soro fisiológico, conforme o grupo, e coloque imediatamente o camundongo na câmara para monitorar a atividade motora local por 20 minutos em pontos temporais selecionados após a exposição à cocaína, extraia o cérebro e coloque-o em solução de LCR gelada por um a dois minutos para resfriar e endurecer.

Após remover o cerebelo e absorver o excesso de fluido, cole o cérebro na plataforma de um vibrosserrote com a parte rostral voltada para cima. Encha a câmara com A CSF gelada e corte secções de 200 mícrons até que o núcleo accumbens seja claramente identificado. Observe atentamente a forma do corpo caloso, a localização e a forma da comissura anterior e dos ventrículos durante o corte.

Uma vez identificada a região correta, corte duas seções de 400 mícrons das quais o núcleo accumbens será dissecado sob um estereomicroscópio. Use uma lâmina fina para dissecar o núcleo accumbens longe das seções. Quatro passagens rápidas da lâmina na área correta devem isolar imediatamente o tecido apropriado.

Coloque o tecido isolado em 900 microlitros de reagente de lise e armazene a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA; para iniciar, descongele os tubos a 37 graus Celsius e homogeneíze. Usando uma agulha de 25 mm, as primeiras passagens podem ser difíceis e exigir empurrar o tecido contra a parede do tubo para homogeneizá-lo em pequenos fragmentos. Para garantir uma homogeneização adequada, pipete o lisado para uma coluna de centrifugação mini trituradora kaya e centrifugue.

Pipete o lisado para um novo tubo de microcentrífuga e extraia o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação do RNA, realiza-se a transcrição reversa para cDNA, bem como a pré-amplificação específica do alvo das amostras com primers direcionados ao grupo de genes escolhido para análise. Esses procedimentos são descritos na versão textual do protocolo.

Chips microfluídicos comerciais para análise abrangente de QPCR estão disponíveis no formato 48 por 48, permitindo a análise de 48 amostras com 48 conjuntos de sondas, ou em um formato 96 por 96, no qual 96 amostras são analisadas com 96 sondas. Na maioria dos casos, a escolha do chip depende principalmente do número de amostras analisadas.

Primeiro, prepare a mistura da amostra de acordo com o chip escolhido para o experimento. Tenha cuidado ao pipetar o reagente de carga da amostra com corante de ligação 20 XDNA. Agite as soluções da mistura da amostra por um mínimo de 20 segundos e centrifugue por pelo menos 30 segundos.

As reações preparadas podem ser armazenadas por curtos períodos a quatro graus Celsius até que o chip esteja pronto para carregamento. Em seguida, prepare a mistura do ensaio, agite completamente a mistura de amostras e centrifugue para sedimentar todos os componentes. Conforme mostrado anteriormente, o chip IFC de matriz dinâmica possui entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas para fluido da linha de controle utilizado para pressurizar as câmaras microfluídicas.

Primeiro, injete o fluido da linha de controle em cada acumulador do chip. Em seguida, prepare o chip colocando-o no controlador IFC e executando o script apropriado. Quando o script for concluído, remova o chip preparado do controlador IFC e pipete cinco microlitros de cada ensaio.

Misture sobre o chip. Adicione cinco microlitros de cada mistura de amostra nas suas entradas e recoloque o chip no controlador IFC utilizando o software do controlador IFC. Execute o script para carregar as amostras e ensaios no chip.

Quando o script de carregamento da mistura terminar, remova o chip carregado do controlador IFC. Em seguida, coloque o chip no ciclador térmico e crie uma nova execução do chip que inclua uma análise de curva de dissociação. Utilizando o software do ciclador térmico, certifique-se de que as câmaras de reação sejam reconhecidas corretamente e permita que a reação prossiga até a conclusão.

Um aumento na atividade locomotora foi evidente após uma única injeção aguda de cocaína. Nesta seção coronal, linhas brancas grossas marcaram a localização dos cortes feitos para definir os limites do núcleo accumbens. Durante a dissecção, as curvas de amplificação de iniciadores direcionados contra CFOs e fosf B demonstram que os pares de iniciadores amplificam seu transcrito alvo com eficiência aproximada de 100%.

Em cada ciclo, os resultados mostram que a cocaína induziu expressão máxima de CFOs e de fosfo B no núcleo accumbens uma e duas horas após a exposição. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de nova geração, podem ser realizados para identificar novos transcritos não caracterizados.